本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种通过萃取及硅胶柱色谱分离制备高纯姜萜酮的方法。
背景技术：
姜来源于姜科姜属植物姜(zingiberofficinalerosc.)的新鲜或干燥根茎。姜属于药食同源类中药，其临床应用相当广泛，国外对其关注程度亦较高。近年来，针对姜及其主要活性化学成分的化学和药理报道较为丰富。研究表明，姜酚类在姜中的含量很高，而姜萜酮类化合物为姜酚类的脱水产物，其含量较低。但是，在抗炎、抗氧化以及抗肿瘤等方面，姜萜酮类的活性作用均显著优于姜酚类化合物。
发明人在前期研究中发明了一种从姜超临界萃取物中分离姜萜酮的方法，公开于cn101735030a中，先将姜的超临界萃取物于含羟苯甲酯的酸水中加热转化，再经硅胶柱色谱分离、制备hplc精制。它在第一步硅胶分离时，通过洗脱剂环己醇、偏三甲苯在体积比25～50∶1范围内，用三个不同梯度洗脱(例如：45∶1，33∶1和25∶1)，得到纯度约为80％的姜萜酮，收率仅为10～20％，因此必须经后续精制，包括用偏三甲苯溶解姜萜酮粗品，过中压柱、用环己醇和偏三甲苯洗脱，才得纯度约为90％的姜萜酮，此步骤收率约为35％。此方法步骤繁琐，得率很低，并且增加了成本。
以姜超临界流体萃取物或干姜提取物为基础，应用转化前处理、色谱分离手段有序联用，研究一种大幅度提高姜萜酮类产量，快速、简单的制备姜萜酮类组合物的方法，并利用所得组合物研究其抗肿瘤活性，是本技术领域面临的主要问题。
技术实现要素：
本发明在前期研究的基础上，对提取方法做了进一步的优化，优化后的方法革除了精制步骤，只需提取、萃取、经硅胶柱色谱分离即可得到含量大于90％的姜萜酮。
本发明的提取方法包括：姜超临界流体萃取物或干姜提取物经含羟苯甲酯的酸水加热回流提取，回收羟苯甲酯，酸水液用偏三甲苯萃取，减压回收偏三甲苯得到萃取后浓缩物，浓缩物过硅胶色谱柱、用环己醇和偏三甲苯梯度洗脱，收集洗脱液浓缩，即得，其中洗脱用的环己醇和偏三甲苯分六个梯度洗脱，体积比依次为：50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1，收集14∶1的流分，浓缩即得。
洗脱时每个梯度洗脱优选3～6个柱体积。
加热回流所用的含羟苯甲酯的酸水，其中羟苯甲酯的浓度优选40％～80％v/v，盐酸的浓度优选0.2～0.8m。
加热回流的温度优选70～100℃，回流时间优选2～4小时。
其中姜超临界萃取物或干姜提取物与含羟苯甲酯的酸水的重量体积比优选不低于3∶80mg/ml。更优选1∶40～3∶80mg/ml。
所述干姜提取物优选干姜的羟苯甲酯提取物。更优选用80％～90％v/v羟苯甲酯提取。
通过外标定量法计算，原萃取物中姜萜酮的含量约为2.5％，当进行酸水反应处理后提取物中的姜萜酮的含量可达20％(外标法定量)。推测可能原料中部分姜酚转换成了姜萜酮。
研究发现，在洗脱剂环己醇和偏三甲苯优化体积比14∶1～50∶1范围内，利用体积比依次为：50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1的六个梯度依次洗脱，不同极性梯度所得姜萜酮含量不同，例如在17∶1段时，所得组合物中小极性杂质较多，所得姜萜酮纯度仅为50％w/w，而在洗脱至14∶1时，测得姜萜酮纯度较高，约为90％w/w，后再加极性至10∶1时，所得组合物大极性杂质较多，并且含量很低，纯度仅为40％w/w。发明人前期发明的一种从姜超临界萃取物中分离姜萜酮的方法，在洗脱剂环己醇和偏三甲苯体积比25～50∶1范围内，利用三个梯度洗脱(例如45∶1，33∶1和25∶1)，虽然也能将姜萜酮洗脱出来，但是洗脱剂各梯度所洗脱的柱体积数很多(约16个柱体积)，并且由于极性增加缓慢，姜萜酮在柱内被吸附掺杂严重，使得纯度、收率都有很大的损失。
因此，本发明优选用环己醇和偏三甲苯分六个梯度洗脱，体积比依次为：50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1，最后收集14∶1的流分。
试验还发现，当洗脱剂环己醇和偏三甲苯在各个梯度时所洗脱的柱体积过多时(超过6个柱体积)，会使姜萜酮流出时间变长，并且纯度降低，所得组合物含姜萜酮仅为70％w/w，而且由于洗脱时间变长，姜萜酮于硅胶柱上吸附增加，收率降低(约45％)；各梯度所洗脱的柱体积过少时(低于3个柱体积)，会使姜萜酮与许多小极性杂质共流出，也影响其纯度，所得组合物含姜萜酮仅为60％w/w。
六个极性梯度段所洗脱的柱体积优选为3～6。并洗脱至14∶1段时，tlc检测，收集14∶1含姜萜酮段，通过外标定量法计算，得本发明的提取物中含姜萜酮90～93％，8-姜萜酮3～5％。
本发明的制备方法易于操作、成品质量好且产量高，只需转化后硅胶柱层析分离一遍即得姜萜酮类组合物，并且收率很高，可达60～65％，为工业化生产带来极大便利。
具体实施方式
实施例1
精确称取姜超临界流体萃取物约7.5g，将其与200ml60％羟苯甲酯的酸水溶液(0.8m盐酸)充分混匀，100℃加热回流2小时，待反应完全后，45℃回收羟苯甲酯，所得酸水液用80ml偏三甲苯萃取两次，合并偏三甲苯液，回收偏三甲苯，浓缩得到以姜萜酮为主的姜萜酮类组合物约7.5g，提取物中姜萜酮的含量由原来的2.5％升高到20％(外标法定量)。以反应后产物7.5g为原料，200～300目柱层析硅胶10g拌样，200～300目柱层析硅胶150g分离，洗脱剂环己醇和偏三甲苯分六个梯度洗脱，分别为50∶1、33∶1、25∶1、20∶1、17∶1、14∶1(体积比)，各个梯度分别洗脱6、3、3、5、6、6个柱体积，收集14∶1段，tlc检验，置旋转蒸发仪上蒸干，即得以姜萜酮为主的姜萜酮类组合物0.98g，收率65％，hplc外标法测定该组合物中姜萜酮占90％，8-姜萜酮占5％。