用于核酸富集提取的基因芯片及其制备方法与流程

文档序号:14468864阅读:532来源:国知局
用于核酸富集提取的基因芯片及其制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种用于核酸富集提取的基因芯片及其制备方法。



背景技术:

基因芯片是指通过微加工技术将大量的dna片段有序地、高密度排列在固相载体表面,形成储存有大量信息的dna阵列。这些固定于基因芯片上的dna片段可以为碱基序列已知的cdna或寡核苷酸片段,被称为探针。探针阵列与标记的靶核酸分子杂交后,能在短时间内快速、准确地获取大量信息。基于它的高通量、微型化和平行分析的特点,目前已广泛用于基因组功能研究、基因表达、突变检测,snp分析、药物筛选、法医鉴定、临床诊断、农业食品卫生和环境监测等领域。该技术主要包括4个部分:dna微阵列的制备,样品制备及标记,分子杂交与检测,生物信息学分析。

dna微阵列的制备主要有两种方法,原位合成与合成后点样。原位合成是指利用光导合成的方法在载体表面逐个合成寡核苷酸片段,每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因,存在于dna芯片的特定位置上;合成后点样可以将寡核苷酸或cdna用针点或喷点的方法直接排列到玻片等固相载体上制成寡核昔酸芯片或cdna微阵列。核酸芯片的固相载体主要有玻璃、金属、陶瓷、塑料、硅等物质构成的基片,目前应用较为广泛的是玻璃基片。

基因芯片是基于dna杂交的基本原理,即a和t、g和c的互补关系。基因芯片上的探针位点使用不同分子生物学技术和碱基互补配对原则与靶核酸分子杂交,检出杂交或反应信号强度表示靶核酸分子的含量,而通过标记信号所在位置可以得到待测核酸种类。这些信息经由计算机处理、分析,从而实现定性、定量分析的目的。因此杂交的效率高低和杂交时间长短是决定基因芯片的性能的重要指标。

然而固定于芯片表面的探针与位于液相的靶核酸分子进行生化反应的过程不完全相同于液相中生化反应。其原因在于,芯片生物大分子与固相支持物的结合导致了溶液中的靶分子与其不能迅速地发生作用,延长了反应时间,必要时还必需提高靶分子的浓度以加快反应。而且,固相化的生物大分子,特别是空间体积较小的芯片分子,很容易受到支持物对生化反应的空间阻碍作用。如何解决以上问题是生物芯片技术应用中的关键之一。



技术实现要素:

针对现有技术中的缺陷,本发明目的在于提供一种用于核酸富集提取的基因芯片及其制备方法,以采用连接臂与电场加速相结合,来提高核酸杂交的效率和杂交速度,相较于普通基因芯片可以显著缩短杂交时间;随后通过dna变性使杂交结合的目标核酸与捕获探针脱离,在反向电场的作用下快速离开提取芯片表面,显著地提高了芯片的工作效率。

为实现上述目的,本发明提供的技术方案为:

本发明提供了一种用于核酸富集提取的基因芯片的制备方法,包括如下步骤:获得所要提取的目标核酸的序列信息;根据目标核酸的序列信息分析获得特征基因序列;根据特征基因序列制备核酸捕获探针;设计连接臂分子,将连接臂分子和探针分子的5’端连接;对固相基片表面进行处理,制成电极基片;通过连接臂末端的连接分子,固定核酸捕获探针在固相基片表面上,得到用于核酸富集提取的基因芯片。

优选地,获得所要提取的目标核酸的序列信息的方法是基因测序方法。

优选地,特征基因序列为一个或多个。

优选地,核酸捕获探针是寡核苷酸、cdna序列和其他pcr产物中的一种或多种。

优选地,固相基片是塑料材质或玻璃材质。

优选地,连接臂分子包括15~30个功能基团长度。

优选地,功能基团选自聚胸腺苷酸(polyt)、聚腺苷酸(polya)、聚胞苷酸(polyc)、聚鸟嘌呤苷酸(polyg)、胞嘧啶与聚胸腺苷酸(polyt)的嵌合体、胞嘧啶与聚腺苷酸(polya)的嵌合体、胞嘧啶与聚胞苷酸(polyc)的嵌合体、胞嘧啶与聚鸟嘌呤苷酸(polyg)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胸腺苷酸(polyt)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚腺苷酸(polya)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胞苷酸(polyc)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚鸟嘌呤苷酸(polyg)的嵌合体、聚乙醇、聚酯、聚氨和聚硫酸酯中的一种或多种。

优选地,固相基片的表面附着有金属层,金属层表面再覆盖琼脂糖层。

优选地,琼脂糖是以链亲和素标记的琼脂糖。

本发明还保护根据上述方法制备得到的用于核酸富集提取的基因芯片。

本发明所阐述的核酸富集提取芯片与目前用于研究分析的基因芯片一致,也是基于dna互补杂交的原理。然而与上述的用于测试分析目的的基因芯片不同,本发明所阐述的基因芯片应用于目的基因的捕获提取,通过与基因芯片上的探针分子互补杂交简便、高效地将样品中的目的基因捕获富集用于后续的处理。

传统的用于制备测试分析目的的核酸芯片的固相载体常采用玻璃芯片。核酸富集提取芯片也可应用玻璃芯片或上述金属、陶瓷、塑料、硅等其他固相载体。但玻璃芯片易碎且包被的有机薄膜容易脱落,致使探针分子不稳定。而核酸富集提取芯片不同于核酸测试芯片,需要多次重复使用,要求芯片上的探针分子性质稳定,不易脱落。而较传统的玻璃材料核酸芯片,由于塑料与包被层吸附性好,则与包被层紧密结合的探针分子不易脱落,性质稳定。同时塑料芯片不易破碎,可靠耐用,且价格低廉,所以塑料基片比玻璃基片更加适宜用于制备核酸富集提取芯片。此外,由于核酸富集提取芯片不以检测分析为目的,探针在芯片上所在位置并不重要。因此可以不需要采用点样等方式而将探针分子均匀地喷涂在芯片的固相载体上,从而不但提高了芯片上的杂交面积及探针数量而且显著地降低芯片生产成本。

对于核酸富集提取芯片的使用,探针分子与目标核酸的杂交的效率高低和杂交时间长短至关重要。为此,首先在探针分子与芯片片基间加入适当长度的连接臂,可大大提高杂交效率。连接臂将固相化的探针分子与支持物隔开一定的距离,可以为探针提供一个自由的空间以减少空间位阻,有助于杂交反应的进行。连接臂越长,杂交效率越髙。典型的连接臂包括15~30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团,如polyt(a、c或g)、c原子或聚乙烯乙二醇与polyt(a、c或g)的嵌合体、聚乙醇、聚酯、聚氨、聚硫酸酯和其组合物。

此外为进一步缩短杂交时间,核酸富集提取芯片采用在杂交位点引入电场以提高杂交速度。美国nanogen公司是在芯片上1mm2的杂交位点上制作有微电极阵列引入电场,采用能量传导的荧光信号检测。其原理为:当位于待检位点链亲和素标记的琼脂糖凝胶下方的微电极引入直流正电压后,溶液中的生物素标记化的探针就可在电场的作用下快速泳动并浓缩结合于该处。这一技术虽然极大地缩短了杂交时间,但芯片制备复杂,制作成本高。而核酸富集提取芯片的制备技术不同于美国nanogen公司的技术,由于核酸富集提取芯片不要求确定探针杂交位点,因此核酸富集提取芯片可以将整个芯片基片做成电极引入电场。方法是先在塑料或玻璃等基片上附着上一层金属做成电极,其上再覆以链亲和素标记的琼脂糖。在电场的作用下生物素标记的探针分子可快速地结合到基片电极上方的琼脂糖上制备成芯片。在使用芯片富集提取核酸时同样引入电场使提取芯片带正电荷,待提取的带负电荷的dna分子在电场的作用下快速泳动并浓缩结合于芯片上快速完成杂交。在杂交完成后,通过改变电场方向使提取芯片带负电荷、可将未杂交的样品dna从芯片上“洗”去,选择适当的电场强度就可以使非特异杂交的dna与未杂交的探针选择性地分开除去,而保留完全杂交的dna分子。由于电场的这种浓缩和选择特性,使得该方法有很高的灵敏度和特异性,最为显著的是它使原来数小时的杂交反应缩短到二三十秒钟。之后通过dna变性使杂交结合的目标核酸与捕获探针脱离,在反向电场的作用下快速离开提取芯片表面。

本发明关键技术点和保护点包括但不限于:核酸富集提取芯片作为一种独特的以目的基因的捕获提取为目的的新型基因芯片的提出;核酸富集提取芯片采用喷涂的方式将探针分子均匀地固定在芯片载体上的制备方法;核酸富集提取芯片采用连接臂与电场加速相结合来提高核酸杂交的效率和杂交速度的技术;核酸富集提取芯片通过在基片上附着上一层金属做成电极以引入电场的方法。

本发明提供的技术方案,具有如下的有益效果:

(1)本发明所阐述的核酸富集提取芯片作为一种独特的基因芯片,不同于当前用于测试分析的基因芯片,其应用于目的基因的捕获提取。通过与富集提取芯片上的捕获探针分子互补杂交简便、高效地将样品中的目的基因捕获富集用于后续的处理。

(2)本发明所阐述的核酸富集提取芯片,采用塑料基片,相比于基因芯片常用的玻璃基片不易破碎,更加可靠耐用,且价格更加低廉,更被市场所接受。

(3)本发明所阐述的核酸富集提取芯片,采用喷涂的方式将探针分子均匀地固定在芯片载体上,比起目前基因芯片常用的制备方法,不但提高了芯片上的杂交面积及探针数量而且显著地降低芯片生产成本。

(4)本发明所阐述的核酸富集提取芯片,采用连接臂与电场加速相结合,来提高核酸杂交的效率和杂交速度,相较于普通基因芯片可以显著缩短杂交时间。

(5)本发明所阐述的核酸富集提取芯片,通过控制电场方向与强度来实现杂交时目标核酸与捕获探针的加速结合,以及随后目标核酸与捕获探针解脱时的加速释放,显著地提高了芯片的工作效率。

(6)本发明所阐述的核酸富集提取芯片通过在塑料或玻璃等基片上附着上一层金属做成电极以引入电场;与已有的在芯片上1mm2的杂交位点上制作有微电极阵列引入电场的技术相比,制备工艺简单,制作成本低廉。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的用于核酸富集提取的基因芯片的结构示意图;

图2为本发明实施例中的用于核酸富集提取的基因芯片在富集核酸的过程示意图。

附图标记:

1-探针;2-固相基片;3-连接臂;4-目标核酸;5-其他核酸。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,因此只是作为示例,而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明提供一种用于核酸富集提取的基因芯片的制备方法,包括如下步骤:

s1:采用基因测序方法获得所要提取的目标核酸的序列信息;

s2:根据目标核酸的序列信息分析获得一个或多个特征基因序列;

s3:根据特征基因序列制备核酸捕获探针,核酸捕获探针是寡核苷酸、cdna序列和其他pcr产物中的一种或多种;

s4:设计包括15~30个功能基团长度的连接臂分子,将连接臂分子和探针分子的5’端连接;其中,功能基团选自聚胸腺苷酸(polyt)、聚腺苷酸(polya)、聚胞苷酸(polyc)、聚鸟嘌呤苷酸(polyg)、胞嘧啶与聚胸腺苷酸(polyt)的嵌合体、胞嘧啶与聚腺苷酸(polya)的嵌合体、胞嘧啶与聚胞苷酸(polyc)的嵌合体、胞嘧啶与聚鸟嘌呤苷酸(polyg)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胸腺苷酸(polyt)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚腺苷酸(polya)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚胞苷酸(polyc)的嵌合体、聚乙烯乙二醇与聚鸟嘌呤苷酸(polyg)的嵌合体、聚乙醇、聚酯、聚氨和聚硫酸酯中的一种或多种;

s5:对塑料材质或玻璃材质固相基片表面进行处理,在固相基片的表面附着有金属层,然后在金属层表面覆盖以链亲和素标记的琼脂糖层,制成电极基片;

s6:通过连接臂末端的连接分子,固定核酸捕获探针在固相基片表面上,得到用于核酸富集提取的基因芯片。

下面结合具体实施例对本发明提供的用于核酸富集提取的基因芯片的制备方法作进一步说明。

实施例

本实施例提供一种用于核酸富集提取的基因芯片的制备方法,包括如下步骤:

s1:采用基因测序方法获得所要提取的目标核酸的序列信息;

s2:根据目标核酸的序列信息分析获得一个特征基因序列;

s3:根据特征基因序列制备核酸捕获探针,核酸捕获探针是cdna序列;

s4:设计包括25个功能基团长度的连接臂分子,将连接臂分子和探针分子的5’端连接;其中,功能基团含有聚胸腺苷酸(polyt)、聚腺苷酸(polya)、聚胞苷酸(polyc)、聚鸟嘌呤苷酸(polyg)、胞嘧啶与聚胸腺苷酸(polyt)的嵌合体;

s5:对塑料材质或玻璃材质固相基片表面进行处理,在固相基片的表面附着有金属层,然后在金属层表面覆盖以链亲和素标记的琼脂糖层,制成电极基片;

s6:通过连接臂末端的连接分子,固定核酸捕获探针在固相基片表面上,得到用于核酸富集提取的基因芯片。

本发明实施例制备得到的用于核酸富集提取的基因芯片,通过控制电场方向与强度,来实现杂交时目标核酸与捕获探针的加速结合,相较于普通基因芯片可以显著缩短杂交时间;随后通过dna变性使杂交结合的目标核酸与捕获探针脱离,在反向电场的作用下快速离开提取芯片表面,显著地提高了芯片的工作效率。

需要说明的术语如下。核酸:是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,为生命的最基本物质之一。根据化学组成不同,核酸可分为核糖核酸(简称rna)和脱氧核糖核酸(简称dna)。dna是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。rna在蛋白质合成过程中起着重要作用——其中转运核糖核酸,简称trna,起着携带和转移活化氨基酸的作用;信使核糖核酸,简称mrna,是合成蛋白质的模板;核糖体的核糖核酸,简称rrna,是细胞合成蛋白质的主要场所。

基因:是携带生物个体所有遗传信息的dna片段,是控制生物个体可能不同于其他生物个体的形态、生理、生化和行为等性状的基本遗传单位。

dna分子杂交:具有互补碱基序列的dna分子,可以通过碱基对之间形成氢键等,形成稳定的双链区。

dna变性:是指dna双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成单链无规则线团,因而发生性质改变(如粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外吸收增加等)。加热、改变dna溶液的ph值、或受有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素的影响,均可使dna变性。

需要注意的是,除非另有说明,本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明,否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中,除非另有规定,任何具体值应被解释为仅仅是示例性的,而不是作为限制,因此,示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中,需要理解的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是两个以上,除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围,其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

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