与南瓜光周期不敏感性状紧密连锁的indel分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及与南瓜光周期不敏感性状紧密连锁的indel分子标记及其应用。

背景技术：

中国南瓜是南瓜的三大栽培种之一，其产量和种植面积位居三个栽培种之首。然而中国南瓜属雌雄异花同株的短日植物，大都具有光温敏感性，春季华南地区的适宜播种期短(1-3月)，延至4月播种雌花分化减少导致严重减产，国内中国南瓜主栽品种存在种植地域限制，例如，蜜本南瓜及衍生品种不适宜在黄河以北地区种植，由此可见，光温敏感特性使中国南瓜在播种时间和地理分布受到极大限制。此外，起源于热带和亚热带地区植物的开花主要受光周期的影响，因此，选育光周期不敏感中国南瓜品种具有更广阔的应用前景。但传统育种方式选育光周期不敏感品种困难，一般要在长日照下筛选，且耗时费力，大大影响我国的南瓜育种事业。但随着高通量测序技术的成熟，特别是开发大量的snp(单碱基扩增多态性)标记和应用高密度遗传图谱结合方法开展植物性状精细定位成为挖掘植物基因的热点之一。进而基于南瓜的全基因组信息，开发性状连锁的indel分子标记进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。因此，进行南瓜光周期不敏感的基因定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系，对光周期不敏感的遗传改良具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供与南瓜光周期不敏感性状紧密连锁的indel分子标记及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

与南瓜光周期不敏感性状紧密连锁的indel分子标记，记名为seq7593，所述indel分子标记seq7593定位于中国南瓜第10号染色体上，大小为280bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

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申请人通过研究，对南瓜光周期不敏感性状进行了qtl定位，筛选获得了与之紧密连锁的分子标记，记名为seq7593。通过测序，如果发现这段序列如seqidno.1所示，则相应的南瓜表现出光不敏感性状。如果发现seqidno.1所示序列缺失片段tcata，即缺失seqidno.1所示序列自5’起第129位至第133位共5bp大小的碱基片段，获得大小为275bp如seqidno.2所示序列，则相应的南瓜表现出光敏感性状。

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用于扩增上述indel分子标记seq7593的引物对。

优选的，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：

f1：5’-tttcagctcttaccctattcttc-3’(seqidno.3)，

r1：5’-cacattttactccttaacttggac-3’(seqidno.4)。

上述所述的与南瓜光周期不敏感性状紧密连锁的indel分子标记seq7593在南瓜光周期不敏感辅助育种中的应用。

上述所述的用于扩增indel分子标记seq7593的引物对在南瓜光周期不敏感辅助育种中的应用。

一种用于南瓜光周期不敏感辅助育种的试剂盒，包括用于扩增上述任一项所述indel分子标记seq7593的试剂。

一种南瓜光周期不敏感辅助育种的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测南瓜基因组dna；

(2)利用上述任一项所述的引物对进行pcr扩增；

(3)根据扩增片段的长度差异和/或pcr产物测序结果，判断南瓜的光周期敏感性。

优选的，如果扩增片段中包含有280bp大小的片段，或包含序列如seqidno.1所示的片段，则判定待测南瓜为光不敏感性状。

本发明的有益效果是：

本发明对南瓜光周期不敏感性状进行了qtl定位，筛选获得了与之紧密连锁的分子标记所seq7593，其贡献率高，解释表型概率达30％，可用于光周期不敏感性状的分子标记辅助育种体系的建立。根据indel分子标记设计的pcr扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于南瓜品种改良分子辅助育种，为减少南瓜对长日照依赖性和打破种植时间和种植地域的限制有关的分子育种提供技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。

附图说明

图1为光周期不敏感母本(ppis)和光周期敏感父本(pps)；

图2为南瓜光周期不敏感性状在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示lod值；黑线标记的阈值是代表p<0.001的关联阈值，表示关联性极可靠；

图3为indel分子标记seq7593的pcr扩增结果：p1、p2分别为光周期不敏感母本和光周期敏感父本的产物带型，其中p1扩增的片段长度为280bp；f1两种带型，存在280bp和275bp的片段，f2群体的随机单株中存在p1，p2和f1的三种类型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括dna提取、pcr扩增、page凝胶电泳等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、遗传群体的构建及遗传分析

1、供试材料植物材料：光周期不敏感和光周期敏感材料均是广东本地获得的高代自交系，分别命名为ppis和pps，见图1。ppis和pps杂交获得f1，f1自交得f2，用作遗传分析和定位群体。

2、供试材料光周期不敏感性的确定和遗传规律分析。

对162株f2群体单株于4月播种，开花期间为长日照，调查第一雌花的开花节位，用excel2016处理数据，检测是否服从正态分布。

二、南瓜遗传图谱构建和果皮颜色的初步定位

1、南瓜基因组dna的提取

使用ctab法提取南瓜亲本及160株f2群体基因组dna，提取的单株dna用于文库构建。

2、遗传图谱构建

本研究前期委托北京百迈克生物科技有限公司利用slaf-seq技术进行高通量测序，一共162个样本，采用haeiii和hpy166ii进行酶切，对得到的酶切片段(slaf标签)进行3′端加a处理、连接dual-index测序接头、pcr扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用illuminahiseq进行pe125bp测序。插入片段长度为500bp；测序类型为pe125；去掉用于区分样品的标签序列，实际read长度为2×100bp。对初始snp集进行过滤，可得到较为可靠的基因型数据。共开发多态性slaf标签52,246个，选取4,655个高质量slaf标签，过滤掉与其他slaf标签的mlod值均低于5的标签，连锁群为单位，采用highmap软件分析获得连锁群内marker的线性排列，并估算相邻marker间的遗传距离，最终得到图谱总图距为2,502.01cm的遗传图谱图谱，共分为20个连锁群，获得8,051个上图snp标记。

3、光周期不敏感基因ppd的定位

利用mapqtl软件采用复合区间作图法(mqm)对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算以获得性状相关的qtl，置换检验次数设为1000，qtl判断标准为：p值小于0.01时对应的lod值作为筛选的阈值，图中以黑线表示。超过阈值表示为一个基因的连锁定位区间，黑线的lod值为5.6，一个group代表一个连锁群，将ppd基因定位在6号连锁群(图2)，区间从35.00cm到38.30cm，两个标记的遗传距离为3.30cm(图2)，将该区间两头的标记比对中国南瓜基因组，共229.3kb，在峰值标记附近开发indel的多态标记，利用双亲本的全基因组重测序获得这段区间的indel标记，利用samtools软件检测长度小于50bp的小片段插入与缺失位点，并根据该位点上下游200bp的序列，用premier5.0软件设计而成。indel标记seq7593引物序列为：f1：5’-tttcagctcttaccctattcttc-3’(seqidno.3)，r1：5’-cacattttactccttaacttggac-3’(seqidno.4)。pcr扩增体系使用20μl的扩增体系，包含1utaq酶，1μl模板dna，1μl的dntp，1.5μl引物，2μl的10×pcrbuffer，加ddh2o至20μl。pcr扩增程序为：94℃3min，循环过程为94℃30s、退火30s、72℃1min、30个循环，最后72℃延伸10min。退火温度为54℃。

对中国南瓜ppis、pps个体表型与基因型的比较分析，确定indel分子标记seq7593为南瓜光周期不敏感性状紧密连锁标记，定位于中国南瓜第10号染色体上，大小为280bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

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seqidno.1所述序列如果缺失片段tcata，即缺失seqidno.1所示序列自5’起第129位至第133位共5bp大小的碱基片段，获得大小为275bp如seqidno.2所述序列，则相应的南瓜表现出光敏感性状。

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实施例2

采用实施例1的方法在两亲本间进行pcr扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，亲本间表现特异，鉴定f2群体单株33个，结果见图3。

图3为indel分子标记seq7593的pcr扩增结果：p1、p2分别为光周期不敏感母本和光周期敏感父本的产物带型，其中p1扩增的片段长度为280bp；p2扩增的片段长度为275bp。f1两种带型，存在280bp和275bp的片段，f2群体的随机单株中存在p1，p2和f1的三种类型。

结合单株表型发现光周期敏感性的表型与pcr的结果一致。上述indel分子标记可以将光周期敏感和不敏感的单株分开。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

sequencelisting

<110>广东省农业科学院蔬菜研究所

<120>与南瓜光周期不敏感性状紧密连锁的indel分子标记及其应用

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<160>4

<170>patentinversion3.5

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<213>南瓜

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<213>人工序列

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