技术领域：
本发明涉及分子标记领域，具体的，涉及一个水稻不育基因的snp分子标记。
背景技术：
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水稻是重要的粮食作物，推广杂交水稻是提高水稻产量的重要途径。在两系杂交水稻育种中，不育系主要为温度敏感和光照敏感两种类型。温敏不育系在实际生产中有着重要的地位，农垦58s为光温敏雄性核不育水稻品种，其在长日高温下不育、在短日低温下可育，是两系法水稻育种中的重要种质资源。传统的两系不育系的选育在抽穗扬花期观察水稻的花粉育性和选择田间不育株，需要经历花粉镜检、套袋自交、选出的不育株割蔸再生和改变生态环境进行育性转选择等费时费力的过程。随着生物技术的发展，育种家可利用分子标记对控制不育性状的基因进行鉴定，准确区分纯合不育、杂合不育和可育株，显著提高选择效率和加快两系杂交稻的育种进程。
以往文献报道中主要利用的分子标记类型为aflp、rflp、ssr和indel标记筛选基因，在育种中存在多态性较低，差异较小的缺点。检测过程中使用的eb或聚炳烯酰胺易对环境造成污染、对人体产生危害。传统检测手段以花药镜检和结实率等表型观测鉴定为主，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果存在误差，选择效率较低。
张启发研教授究团队指出控制农垦58s不育的是一个长的非编码rna，loc_12g36030的转录本1即pms3(cn102952795a)。他们的研究表明一个长度为1236bp，且与长光照下特异的雄性不育相关的rna分子(ldmar)。长日照条件下，足够的ldmar转录量是维持正常花粉发育所必需的，但由于一个单碱基突变造成ldmar二级结构改变，导致了ldmar在特异的长日照下转录量降低，造成正处于发育的花药提前程序化死亡，表现出雄性不育(dingetal.2012)。庄楚雄教授课题组的进一步指出，p/tms12-1(即pms3)是一个非编码rna基因，与正常水稻品种相比，温敏不育水稻在该小rna序列内存在一个单碱基突变，这个单碱基突变是在籼稻产生温敏不育性和在粳稻产生光敏不育性的共同原因(zhouetal.2012)。
cn105463072a公开了一种水稻光敏不育基因pms3检测和分型方法，采用荧光pcr对pms3基因进行分型。但该方法引物设计较为繁琐，结果验证也不够直观，影响了基因分型的效率。
因此本领域亟需一种能够快速简便的对pms3分型的检测方法。
技术实现要素：
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有鉴于此，提出本发明。
cn102952795a、cn105463072a两篇背景文献以引用的形式并入本文。
本发明要解决的技术问题是开发一组不育基因pms3的分子标记，其能用于pms3基因的高效鉴定及辅助选择育种。为了解决上述技术问题，本发明提供pms3共分离的snp(singlenucleotidepolymorphism)分子标记。
首先，由于pms3基因已被克隆，根据相关文献pms3基因是由单碱基突变引起的不育性的差异。将已发表pms3基因序列及与日本晴参照基因组(msu7.0)比对，确定该snp在水稻12号染色体的22054886位。以候选snp位点为中心提取两侧50bp侧翼序列，并进行引物设计，标记有三条引物，两条针对关键位点碱基差异设计的特异性引物，一条通用引物。利用8份含有pms3基因的水稻供体品种和27份非供体水稻品种进行kasp反应测试验证，标记k_120522扩增效果佳，且能准确区分测试材料中pms3基因的单倍型。标记信息如表1所示。
表1：标记信息
因此，本发明的第一方面，提供了一种水稻不育基因pms3的snp分子标记，所述分子标记为k_120522，其多态性位点碱基为c或g，检测位点位于水稻12号染色体的22054886位。
该标记包括两条特异性引物，及一条通用引物，其中，特异性引物分别为aaaaattttactcttgatggatggtag(primerseqallelex)、aaaaattttactcttgatggatggtac(primerseqalleley)，通用引物为tataggagtgggaggcatgg。
优选的，两条特异性引物5’端分别连接不同的荧光接头序列。更优选的，荧光接头序列为fam或hex。
本发明的另一方面，提供一种检测水稻不育基因pms3的方法，检测方法包括如下步骤：
s1、提取水稻样品基因组dna；
s2、以水稻基因组dna为模板，利用k_120522的引物组，对k_120522分子标记进行检测；
s3、如果k_120522的snp位点碱基为c，判定测试的水稻样品不含pms3基因；若检测位点碱基为g，判定测试的水稻样品含有纯合的pms3基因；若检测位点同时检测到c、g，判断待测水稻含有杂合的pms3基因。
优选的，s1中，从水稻叶片中提取基因组dna，采用简化ctab法。
优选的，s2中，采用kasp技术对snp位点进行检测。其中，两条特异性引物5’端分别连接不同的荧光接头序列。所述荧光接头序列可以为lgc公司的fam或hex接头序列。
优选的，s2中kasp反应体系如表2所示。所述kaspmastermix试剂，以及与其配套使用的lgcsnpline基因分型平台均购于英国lgc公司。
表2：kasp检测的反应体系
优选的，s2中kasp反应步骤如下所述：在微孔反应板中加入20～50ngdna样品，烘干后加入kasp反应混合液，反应体系见表2。pcr扩增在水浴热循环仪中完成，touchdownpcr反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后对kasp反应产物进行荧光数据读取。
因此，s3中，如果样品pcr产物只检测到引物primerx对应荧光信号，则检测位点为碱基c，判定测试的水稻样品不含pms3基因；若只检测到引物primery对应荧光信号，则检测位点为碱基g，判定测试的水稻样品含有纯合的pms3基因；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为c：g，判断待测水稻含有杂合的pms3基因。
本发明的另一方面，提供了一种上述分子标记在水稻育种中的应用，利用k_120522分子标记的检测方法对k_120522分子标记进行检测，选择携带有pms3基因的水稻样品进行后续育种。
本发明的另一方面，提供了一种检测pms3基因snp分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括k_120522分子标记的引物组。
优选的，每种分子标记的特异性引物5’端分别连接不同的荧光序列。所述荧光序列可以为fam和hex荧光序列。
所述试剂盒用于水稻育种。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种鉴定水稻不育基因的特异引物组合，解决了背景技术中的问题，采用该引物组合能够快速和高通量的鉴定水稻的不育基因pms3，移栽前就可以完成对育种材料的精确选择，大幅减少人力和土地资源的投入成本，提高工作效率。并建立了高效、环境友好的相关检测体系，对促进不育基因pms3在商业化育种中的应用具有重要意义。
本发明提供了检测水稻不育基因pms3的引物及基因分型方法，标记k_120522参考基因内部序列开发，与目标基因共分离，不会像非紧密连锁标记一样在育种中出现分离而导致检测结果不准确，且作为共显性分子标记可以区分杂合体和纯合体，最关键是特异性标记，能广泛用于分子辅助选育。采用本发明的引物进行kasp分型检测，每个pcr反应中包括本发明的扩增特异碱基的两个特异性引物和一个通用引物，通过pcr产物两种不同荧光信号进行检测，实现对每个检测样品的snp位点的基因型判定，能够解决现有的形态学鉴定方法检测周期长、环境影响大、经验依耐性强和检测方法操作复杂等问题，避免了现有已有分子标记鉴定实验方法中有毒致癌物质对实验员的健康威胁和对环境的污染，具有简便、可靠、快速、高通量、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1自然群体分型结果。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1常见水稻品种检测
用标记k_120522对含有pms3基因的水稻品种gd-1s、7001s、培矮64s等共8份基因供体材料和其它不含恢复基因的27个水稻品种进行kasp初筛反应验证，结果如表3。含pms3基因的水稻品种在标记测试位点都检测为g型碱基，27份非供体水稻品种均在测试位点检测出碱基c，证明了本发明所提供的分子标记k_120522及其引物组检测结果准确，特异性好。
表3：标记k_120522测试基因分型数据
实施例2自然群体检测
利用95份材料对snp标记k_120522进行自然群体验证。95份材料中包括34份常见杂交稻和60份核心水稻育种材料。标记在自然群体分型结果如图1所示，95份材料分型明确，除了在核心水稻育种材料广湘24s检测出纯合的pms3，34份常见水稻杂交品种和其余59份材料都检测不含pms3，符合实际育种中pms3基因应用仍欠缺的现状，验证了本发明开发的snp分子标记检测方法的可行性和准确性，可用于pms3基因的鉴定及辅助选择育种。
应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。