一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测k亚群禽白血病病毒的靶序列、荧光定量pcr引物，本发明还涉及利用该靶序列进行k亚群禽白血病病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术：

目前，针对禽白血病的防控与治疗没有有效的的疫苗和药物，国内外对禽白血病病毒(alv)的控制主要是定期对种鸡进行alv抗原检测，淘汰带毒阳性鸡，以达到彻底清除alv的目的。k亚群禽白血病病毒(alv-k)是近几年新发现的一种新亚型禽白血病病毒，其致瘤能力弱，体内外复制能力弱。但是，禽白血病病毒易突变，其潜在的威胁同样不能忽视，所以对alv-k的检测及净化是势在必行的。对于alv的检测，常用方法有酶联免疫吸附试验(elisa)、间接免疫荧光实验(ifa)、聚合酶链式反应(pcr)、环介导等温扩增技术(lamp)及荧光定量rt-pcr等，其中elisa检测有商品化的抗原检测试剂盒，其操作方便、稳定性好、特异性强，是净化alv最常用的检测方法。但是其针对alv的保守蛋白p27，不能用于区分所检alv所属亚群，尤其是不能排除内源性alv的干扰。ifa检测需要细胞培养技术作为支撑，对检测人员专业能力要求严格。pcr和lamp操作简便，灵敏性高，但其不能用于病毒基因的病毒载量结果的定量，而且检测结果存在一定的假阳性干扰。rt-pcr技术已经广泛用于alv-a/b/j的检测，其灵敏性高，稳定性好，特异性强，常用于病毒基因的检测及病毒载量的定量。

虽然荧光定量pcr检测技术非常成熟，但是针对alv-k病毒的荧光定量检测方法鲜有报道，原因主要是alv-k核苷酸序列与禽白血病病毒(alv)其他亚群的核苷酸同源性非常高，不利于选择特异性目标靶序列，例如alv-k全长核苷酸序列与内源性禽白血病病毒(alv-e)全长核苷酸序列同源性在93.7％-97.5％之间，两个亚群之间囊膜蛋白基因env仅有166bp左右的序列存在明显差异，其次，alv-k国外分离株及国内不同地区分离株之间gp85基因的同源性在94.5％-99.9％不等，这进一步缩小了引物设计的序列可选择空间，导致alv-k保守序列可供选择的空间较小，筛选难度较大，而在引物设计方面，几个碱基的差别会极大程度上影响引物的特异性，进而导致检测结果的不准确。为了丰富alv-k的检测手段，并对alv-k的感染进行定量，亟须设计并筛选出一对灵敏性好、特异性强的引物用于alv-k的检测和定量，以加快禽白血病的净化进程。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供用于检测k亚群禽白血病病毒(alv-k)的特异性靶序列；本发明的还在于提供上述靶序列的用途，以提高对k亚群禽白血病病毒(alv-k)的检测能力。

为实现上述目的，通过对本实验室分离到的16株k亚群禽白血病病毒(alv-k)和ncbi数据库已报道的(alv-k)序列比对，通过blast软件进行序列同源性分析，找到特异性的保守靶序列，发现了核苷酸完全保守区域，其核苷酸序列如seqidno.1所示，该靶序列是检测k亚群禽白血病病毒(alv-k)的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测k亚群禽白血病病毒(alv-k)的遗传标记物。

进一步，本发明还提供用于特异性扩增上述靶序列的引物。本发明的引物不但适用于已报道的国外alv-k扩增还适用于国内alv-k扩增检测。

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：

f1:5'-cagacaggttctcgcttccg-3'，

r1:5'-ccatatacctcctgtgcgtgt-3。

本发明提供一种k亚群禽白血病病毒(alv-k)的实时荧光定量pcr检测方法，包括以样品总dna为模板，以上述遗传标记物为靶序列，利用本发明提供的引物进行实时荧光定量pcr，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

ct值小于35的标本为阳性结果；

ct值大于等于35的标本为阴性结果；

本发明的实时荧光定量pcr扩增反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为：10μm的上游引物0.5μl，10μm的下游引物0.5μl，2×itaquniversalsybrgreensupermix10μl，cdna模板1μl，rnasefreeh2o8μl。

本发明的实时荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性3min；95℃15s、60℃34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光；95℃15s、60℃1min，95℃15s。

本发明每次检测标本时必须设立ntc对照(无模板对照)和pos对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：

有效扩增：ntc(－)并且pos(+)

无效扩增：ntc(+)并且pos(+)提示体系污染

无效扩增：ntc(－)并且pos(－)提示体系错误或者试剂失效。

只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。

本发明提供了一种用于检测k亚群禽白血病病毒(alv-k)的试剂盒，其包括上述特异性引物对。

本发明试剂盒的引物序列如seqidno.2-3所示。

本发明试剂盒的工作程序为：95℃预变性3min；95℃15s、60℃34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光；95℃15s、60℃1min，95℃15s；该试剂盒中20μl的反应体系为10μm的上游引物0.5μl，10μm的下游引物0.5μl，2×itaquniversalsybrgreensupermix10μl，cdna模板1μl，rnasefreeh2o8μl。

该试剂盒可用于检测k亚群禽白血病病毒，若待测样品ct值大于或等于35时，则待测样品中k亚群禽白血病病毒为阴性。

本发明提供了用于检测alv-k保守区域靶序列，以及以该序列为基础设计的引物，具有较强的特异性和灵敏度，最低检测限为25拷贝/μl；运用该方法进行组内和组间实验，其变异系数低于1.95％。利用本发明提供的特异性引物引物进行alv-k的荧光定量pcr检测方法进一步简化alv-k的检测的程序、缩短检测周期，可作为检测临床标本的手段，提高alv-k检测的阳性率，用于净化养殖场alv-k。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、阴性阳性对照，该试剂盒的推广应用有利于快速、准确地鉴定alv-k。另一方面，相对于有探针的荧光定量pcr方法，本发明基于seqidno.2-3建立的荧光定量pcr检测方法无需与探针配合使用就能够高效特异灵敏地检测alv-k，极大地降低了成本和操作繁琐度。

附图说明

图1是筛选的四对引物p1、p2、p3、p4运用abi7500上机检测的溶解曲线(上图)和扩增曲线(下图)结果，p2/k和p2/e分别是引物p2对alv-k和alv-e的扩增曲线。

图2是1％琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量pcr引物灵敏性结果，条带大小为84bp，1-8为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μl，9为阴性对照，m为markerds2000。

图3是1％琼脂糖凝胶电泳检测常规pcr引物灵敏性结果，条带大小为1214bp，1-8为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μl，9为阴性对照，m为marker2。

图4是荧光定量pcr扩增动力学梯度曲线，1-8为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μl。

图5是荧光定量pcr标准曲线分析图。

图6是溶解曲线分析图。

图7是荧光定量pcr特异性结果，1是alv-k，2是阴性对照，3是ndv，4-9分别是aiv、mdv、alv-a、alv-b、alv-j、alv-e。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1、荧光定量pcr引物的设计

根据禽白血病病毒(alv)宿主范围、病毒囊膜干扰特性、交叉中和反应类型以及基因组的分子特征，可将禽白血病病毒(alv)划分为a～k共11个亚群，其中鸡源alv有a、b、c、d、e、j和新发k亚群7个亚群，其他各亚群核苷酸序列与alv-k核苷酸序列之间有不同程度的同源性，其中以内源性禽白血病病毒(alv-e)与alv-k核苷酸序列同源性最高(93.7％-97.5％)，仅在gp85区域存在两部分差异较大的核苷酸序列(区域1：5836-5925长度77bp，区域2：6039-6116bp长度89bp)。为了排除alv-e及其他亚群的干扰，参考分离到的多株alv-k的序列，利用软件oligo7和dnastart在病毒囊膜蛋白基因gp85区域差异较大的两部分内设计并合成了四对引物，这四对引物针对的靶序列相同，但引物序列稍有不同，分别是：

p1:f1:5'-cagacaggttctcgcttccg-3'

r1:5'-ccatatacctcctgtgcgtgt-3'；

p2:f2:5'-ctccgccgcaactacagaa-3'

r1:5'-cggaagcgagaacctgtctg-3'；

p3:f3:5'-cacagacaggttctcgcttc-3'

r3:5'-catatacctcctgtgcgtgt-3'；

p4:f4:5'-tccactgccgcaactcac-3'

r4:5'-gcggaagcgagaacctgt-3'；

通过试验评估四对引物的特异性、稳定性和灵敏性，最终筛选出一对特异性最好的引物p1，见图1，扩增长度为84bp；

根据图1可知，引物p3和p4对alv-k的溶解曲线形状不符合正常溶解曲线走向，且引物p3有双峰出现；引物p1和p2均有符合要求的溶解曲线出现，但是引物p2对alv-e有扩增曲线出现，未能排除alv-e的干扰；并且可以看到引物p1与p3的序列仅存在几个核苷酸差别，但扩增效果差别很大，因此本发明以引物p1为最佳引物对；

2、病毒核酸的提取

将alv-k标准毒株gdfx0601(genbank:kp686142)感染的细胞反复冻融三次之后，离心取细胞沉淀，用dna提取试剂盒提取细胞总dna，所获得的dna置于-20℃备用。

3、常规pcr扩增方法的建立

以步骤2制得的alv-k病毒dna为模板，用特异性引物f1和r1进行扩增，扩增片段长度为84bp，扩增体系为50μl；pcr反应体系如下：2xtaqpcrmastermix25μl，上下游引物f1和r1各1μl，dna模板1μl，ddh2o22μl；pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸8min；将扩增的pcr产物，在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，在84bp左右的位置呈现一条独立明亮的条带(图2)，与预期大小一致，回收纯化pcr产物；

4、阳性质粒标准品的制备

将步骤(3)回收的pcr产物与pmd18-t载体16℃进行连接，命名重组质粒为pmd18-t-k；转化dh5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆子；经pcr鉴定的阳性单菌落，用质粒小提试剂盒提取重组质粒；质粒送上海英潍捷基公司测序，做进一步鉴定；重组质粒测序结果与genbank发表的gdfx0601序列完全一致，表明重组质粒pmd18-t-k构建成功；测得所述重组质粒浓度为76.0ng/μl，经计算为2.5×10¹⁰拷贝/μl。

实施例2常规pcr灵敏性实验

将实施例1所得的阳性质粒用ddh2o依次进行10倍梯度稀释，其中泳道1-8为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μl，泳道9为阴性对照，按照实施例1所述体系和程序进行扩增，结果如图2所示，条带大小为84bp；

将常规pcr阳性质粒用ddh2o依次进行10倍梯度稀释，其中1-8为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μl，9为阴性对照，按照常规pcr体系和程序进行扩增，结果如图3所示，条带大小为1214bp；根据图2结果可知，用荧光定量pcr引物进行常规pcr反应，最低可检测到10⁴拷贝/μl。

根据图3结果可知，用常规pcr引物方法进行灵敏性实验，最低可检测到10³拷贝/μl的阳性质粒样品，即常规pcr灵敏性可达到10³拷贝/μl。

实施例3荧光定量pcr灵敏性实验

将实施例1制得的阳性质粒用ddh2o依次进行10倍梯度稀释，其中1-8为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μl，将所述稀释好的阳性质粒标准品进行荧光定量pcr反应，20μl的反应体系为10μm的上游引物0.5μl，10μm的下游引物0.5μl，2×itaquniversalsybrgreensupermix10μl，cdna模板1μl，rnasefreeh2o8μl。反应程序为：95℃预变性3min；95℃15s、60℃34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光；95℃15s、60℃1min，95℃15s。并制作动力学曲线，结果如图4所示。

根据图4结果可知，荧光定量pcr进行灵敏性检测，最低可检测到10¹拷贝/μl的阳性质粒样品，及荧光定量pcr检测灵敏度可达到2.5×10¹拷贝/μl。

实施例4荧光定量pcr标准曲线的建立

将实施例1制得的阳性质粒用ddh2o依次进行10倍梯度稀释，其中1-8为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μl，将所述稀释好的阳性质粒标准品进行荧光定量pcr反应，并制作动力学曲线、标准曲线和溶解曲线。结果如图4、图5和图6所示。

荧光定量反应体系为10μm的上游引物0.5μl，10μm的下游引物0.5μl，2×itaquniversalsybrgreensupermix10μl，阳性质粒模板1μl，rnasefreeh2o8μl；

荧光定量反应程序为95℃预变性3min，95℃15s、60℃34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光，95℃15s、60℃1min，95℃15s；

标准曲线方程：y＝-3.21x+33.65。r²＝0.999，扩增效率＝1.05。

由动力学曲线可知，指数增长期曲线平行，扩增效率相近；由标准曲线方程可知阳性质粒浓度梯度与ct值呈线性关系，r²＝0.999，线性关系良好；由溶解曲线可知，各梯度溶解曲线对应同一温度。实施例5荧光定量pcr特异性实验

对所建立的荧光定量pcr进行特异性试验，检测ndv、aiv、mdv、alv-a、alv-b、alv-j、alv-e同时设置阴性对照和阳性对照，结果如图7所示；

根据图7结果可知，所建立的方法除对alv-k有特异性荧光信号外，对其他样品均无荧光信号产生，其中，对阴性对照和ndv在ct值大于35扩增判为阴性，表明所建立的方法有良好的特异性。实施例6荧光定量pcr稳定性实验

对人工感染alv-k的3只90日龄spf鸡肝脏样品进行荧光定量pcr检测，进行组内和组间实验，统计结果的平均值、标准差、变异系数(％)，以评估所建立方法的稳定性。结果如表1所示；

表1肝脏样品荧光定量pcr组内实验和组间实验

根据表1结果可知，组内和组间实验变异系数均小于1.95％，表明所建方法有较好的稳定性，保证了检测结果的可重复性和可信度。

实施例6临床血浆样品的检测

临床血浆样品分离血清，感染细胞，elisa检测上清；对判为阳性的86份细胞样品的沉淀提取细胞总dna，用所建立的荧光定量pcr方法进行检测，最终确认10份样品为alv-k，这一结果经过最终测序验证完全正确；而且，该方法确认的阳性样品数高于常规pcr的8份样品，表明申请方法检测结果的可靠性，同时其灵敏性高于常规pcr方法。

由以上实施例可以得出，申请方法具有良好的灵敏性、特异性和稳定性，且其耗时短、成本低及可用于定量；申请方法和试剂盒丰富了alv-k的检测手段，同时为加快禽白血病的净化提供了理论依据和技术支持。

上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种k亚群禽白血病病毒检测试剂盒

<130>yri20180007

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>84

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cagacaggttctcgcttccgctgtgggcgcgtgcctgtcgggggcctccctgagaccggg60

tgcacacgcacaggaggtatatgg84

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cagacaggttctcgcttccg20

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccatatacctcctgtgcgtgt21

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ctccgccgcaactacagaa19

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cggaagcgagaacctgtctg20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cacagacaggttctcgcttc20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

catatacctcctgtgcgtgt20

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tccactgccgcaactcac18

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gcggaagcgagaacctgt18