快速检测犬圆环病毒感染的RPA引物及其用途及试剂的制作方法

文档序号:14468335阅读:264来源:国知局
快速检测犬圆环病毒感染的RPA引物及其用途及试剂的制作方法

本发明涉及一种快速检测犬圆环病毒感染的rpa引物及其用途及该引物制备的试剂,属生物技术领域。



背景技术:

犬圆环病毒(caninecircovirus,caninecv)是近年来新发现的一种哺乳动物圆环病毒。该病毒是一种无囊膜、二十面体对称的单链环状dna病毒,属于圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属(circovirus)成员。根据国际病毒分类委员会(internationalcommitteeontaxonomyofviruses,ictv)的分类,圆环病毒科分为圆环病毒属(circovirus)和环状病毒属(circoviridae)两个属,由11种病毒组成,包括猪圆环病毒(porcinecircovirus,pcv)、金丝雀圆环病毒(canarycircovirus,cacv)、鹦鹉喙羽病病毒(beakandfeatherdiseasevirus,bfdv)、犬圆环病毒(caninecircovirus,caninecv)及其他家禽和野鸟圆环病毒。

2012年以前,猪圆环病毒(porcinecircovirus,pcv)是唯一感染哺乳动物的圆环病毒,该病毒主要有2种血清型pcv1和pcv2,pcv2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome,pmws)以及猪皮炎与肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome,pdns),pcv1对猪没有致病性。2015年后,pcv2被确定为猪圆环病毒系统性疾病(pcv2-systemicdisease,pcv2-sd)的主要病原,该病毒主要侵害宿主淋巴组织和细胞,损伤宿主免疫系统,造成免疫抑制,并发或继发感染其他病原体。2012年,kapoor等首次报道一种新型感染犬的圆环病毒,将其命名为cacv-1(caninecircovirusgenotype1),并获得strainny214株的全基因组序列。2013年,li等在脉管炎和淋巴炎的患犬肝脏中也检测到了该病毒,为了避免与已有的金丝雀圆环病毒(canarycircovirus)和犬杯状病毒(caninecalicivirus)混淆,研究者建议将该病毒命名为dogcircovirus(dogcv)。为使圆环病毒科所有病毒名称统一,2017年国际病毒分类委员会(ictv)规定该病毒缩写为caninecv。目前,已陆续在美国、意大利、德国和中国等国家的犬中检测到caninecv,且已获得多个毒株的全基因组序列。

caninecv基因组大小约2063nt,较pcv2多276~277个核苷酸。与pcv3相比,多63个核苷酸。caninecv具有与pcv相似的基因组结构,包含2个主要开放阅读框(orfs),其中orf1编码复制酶rep蛋白(303aa),orf2编码衣壳cap蛋白(207aa);还含有2个非编码区(135nt和203nt)。

目前,caninecv感染常用的实验室检测方法主要包括电子显微镜检测、免疫组织化学检测(immunohistochemistry,ihc)、原位杂交检测(insituhybridization,ish)和分子生物学检测(pcr、荧光定量pcr)等方法。2013年,li等通过pcr对168只腹泻犬和204只健康犬的粪便,以及409份患血小板中性粒细胞减少症、不明原因发热和曾被蜱虫叮咬过的犬血清样本进行了caninecv检测,其阳性检测率分别为11.3%(19/168)、6.9%(14/204)和3.3%(19/409)。caninecv阳性的腹泻样本中,有68%(13/19)与其他病原体共感染。通过ish和透射电子显微技术,在4只患有血管损伤及组织细胞炎症的犬淋巴结和脾脏内检测到了caninecv。2014年,decaro等报道在意大利一暴发过急性肠炎的犬繁殖舍死亡幼犬体内检测到了caninecv(bari/411-13),对其基因组进行序列分析表明,该毒株与美国报道的毒株有高度遗传相似性,并证实在2009年caninecv就已经出现。han-siang等建立了caninecv的sybrgreen-basedreal-time-pcr检测方法,对2012-2014年收集的207份腹泻粪便和160份健康犬粪便进行了检测,caninecv的阳性率分别为28%(58/207)和11.9%(19/160)。thaiwong等利用qpcr技术在出血性腹泻和急性死亡的患犬体内检测到了caninecv。herbst等利用电子显微镜观察和pcr检测了2000年以来采集的417份犬粪便样本,在两份粪便样本(v2177/00,v3374/00)中观察到了caninecv病毒颗粒。在我国,2016年孙文超等采用重叠pcr对中国广西20份家犬血清进行了检测,并成功获得了一株caninecv全基因组序列,命名为jz98/2014(genbank登录号:kt946839)。该序列大小为2063nt,与已报道的毒株基因组大小一致,但与欧美毒株处于不同进化分支。

尽管用电子显微镜进行caninecv的检测速度较快,但需要贵重的仪器设备,但不适合普通实验室应用。免疫组织化学(ihc)和原位杂交技术(ish)操作繁琐,检测所需时间较长,也限制了其广泛使用。pcr和qpcr作为分子生物学常用的检测方法,具有快速、特异和敏感的优点,已经应用于caninecv核酸的检测。然而,pcr和qpcr方法也存在一定不足之处,如需要专门的仪器设备和技术,限制了该方法在基层实验室的广泛应用。

重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification,rpa)是2006年由英国twistdxinc公司研发的一种核酸恒温扩增技术,该技术可以在25-42℃恒温条件下快速完成核酸dna的扩增,并且扩增产物可以通过探针法进行实时监测。rpa工作原理是在目的dna片段扩增的过程中,引物与重组酶形成复合物,并与dna发生结合,沿着dna链寻找引物的同源序列,当遇到同源序列完成定位后,就可发生链交换反应,并打开2条dna单链间的氢键,单链绑定蛋白(ssb)与单链dna链结合,阻止形成双链;聚合酶从发生链交换反应的位置开始复制dna,可完成了对目的dna片段的扩增。与常规pcr相比,rpa技术不但具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应时间短、不需复杂仪器设备等优点,在病毒检测领域中具有广泛的应用前景。

因此,一种能够快速、简便、准确的检测诊断犬caninecv感染的引物及该引物制备的试剂或试剂盒就应运而生。



技术实现要素:

本发明的目的是为犬caninecv感染的分子诊断提供一个快速、简便、准确的rpa检测引物及该引物制备的试剂。

本发明利用重组酶聚合酶扩增(rpa)技术建立caninecv感染的快速检测方法,筛选出了caninecvrpa检测引物,并以该引物为基础制备出快速、简便、准确检测诊断犬caninecv感染的试剂。

首先,通过blastn和dnaman软件对32个caninecv流行毒株rep基因进行序列比对,筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列。根据rpa引物设计的基本原则,使用primer5.0软件设计了若干对特异性引物,通过试验筛选出具有高特异性和敏感性的检测rpa的引物,即dna序列为<210>2的上游引物的和dna序列为<210>3的下游引物。

本发明检测rpa的引物主要通过以下过程制取:

1、caninecvrep基因的合成及其重组质粒的构建。

2、caninecvrep基因重组质粒拷贝数的确定。

3、caninecvrpa引物的设计与合成。

4、caninecvrpa反应体系的配制及操作步骤。

5、caninecvrpa反应条件的优化。

6、caninecvrpa检测引物的特异性试验。

7、caninecvrpa检测引物的敏感性试验。

具体过程如下:

1、caninecvrep基因的合成及其重组质粒的构建。

根据genbank中登录的caninecv基因组参考序列(登录号:mg266899),确定rep基因序列,进行rep全长基因(912bp)的体外合成,并克隆至pmd-18t载体,获得重组质粒pt-rep。将含有重组质粒的阳性菌过夜培养后,提取质粒,并测定重组质粒浓度。

2、caninecvrep基因重组质粒拷贝数的确定。

将提取到的重组质粒pt-rep经系列倍比稀释,将pt-rep质粒拷贝数稀释在1×108~100拷贝/μl之间。

3、caninecvrpa引物的设计与合成。

下载genbank公布的caninecv不同地域流行毒株复制相关蛋白rep基因,通过blastn和dnaman软件对caninecv不同地域流行株rep基因进行序列比对,筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列。参考rpa引物设计的基本原则,设计了若干对特异性引物,通过rpa试验筛选出具有高特异性和敏感性的rpa检测引物。设计的rpa引物扩增目的片段大小约为210~220bp。同时,合成荧光定量pcr方法使用的特异性引物qpcrfp和qpcrrp。

4、caninecvrpa反应体系的配制及操作程序。

配制rpa反应体系,包括rpafp和rparp,rehydrationbuffer,ddh2o,模板,280mmmgac。将模板和mgac之外的所有试剂预混后,转入预添加exo冻干酶制剂的pcr反应管中,并充分混匀。将模板加入反应管中,并将mgac加在反应管盖中,混匀,盖紧后瞬时离心,放入水浴锅中进行rpa反应。

5、caninecvrpa反应条件的优化。

5.1rpa最佳反应时间的确定。

caninecvrpa最佳反应时间确定为20-30min。

5.2rpa最佳反应温度的确定。

caninecvrpa最佳反应温度确定为38-42℃。

5.3rpa最佳引物的筛选。

caninecvrpa最佳检测引物为:dna序列为<210>2的上游引物的和dna序列为<210>3的下游引物。

5.4rpa-lfa检测方法操作步骤及结果判定。

在rpa扩增结束后,用微量移液器取5μlrpa产物,加入eb染色液后,进行2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察rpa扩增结果。若扩增产物大小约为220bp,与预期大小完全相符,则结果判为caninecv核酸检测结果为阳性;若没有扩增条带或者扩增产物大小与预期大小不相符,则结果判为caninecv核酸检测结果为阴性。

6、caninecvrpa检测引物的特异性试验。

用病毒dna提取试剂盒分别提取将犬细小病毒(cpv)、犬传染性肝炎病毒(ichv)的基因组dna;用病毒rna提取试剂盒分别提取犬瘟热病毒(cdv)、犬冠状病毒(ccv)、狂犬病病毒(rv)的总rna,反转录成cdna;然后分别以上述病毒的核酸样品(dna或cdna)和caninecv重组质粒pt-rep为模板,分别用筛选出来的rpa引物fp5-rp5进行rpa扩增,每种病原的核酸样品重复检测3次,分析caninecvrpa引物的特异性。检测结果证实,只有caninecv核酸样品(重组质粒pt-rep)rpa检测结果为阳性,其他病毒dna或者cdna核酸样品的rpa检测结果均为阴性,表明rpa引物fp5-rp5对其他病毒的核酸模板没有出现非特异性扩增反应,证实rpa检测引物fp5-rp5具有良好的特异性。

7、caninecvrpa检测引物的敏感性试验。

将caninecv重组质粒pt-rep进行10倍倍比稀释,使其浓度在1×108、1×107、1×106……~1×100拷贝/μl之间,并将不同稀释度的重组质粒作为模板,用fp5-rp5引物进行rpa反应,确定该方法的最低检测浓度;同时进行荧光定量pcr检测(图2),对rpa与荧光定量pcr方法的敏感性进行比较。检测结果发现,用fp5-rp5引物rpa最低可以检测到1×101拷贝/μlcaninecv重组质粒dna,荧光定量pcr检测方法最低也可以检测到1×101拷贝/μl重组质粒dna,表明rpa与荧光定量pcr方法的敏感性相同,证实本研究所发明的caninecvrpa检测引物fp5-rp5具有良好的敏感性。

与荧光定量pcr方法相比,rpa具有对仪器设备要求低(只需要恒温水浴锅)、检测速度快(约25min)、检测结果易观察(可以在紫外灯下观察检测结果)等优点,使得本发明的rpa检测引物可以用于犬caninecv感染的快速检测。

附图说明

图1为rpafp5-rp5引物对caninecv核酸的检测结果

图中1-3:以caninecv核酸(pt-rep)为模板的rpa阳性检测结果

图2为荧光定量pcr方法对caninecv核酸检测的标准曲线和溶解曲线

图中1:caninecvrep基因(pt-rep)的扩增标准曲线;2:caninecvrep基因(pt-rep)的溶解曲线。

图3为表1本发明所用的caninecvrpa引物和qpcr引物。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步详述。

1、caninecvrep基因的合成及其重组质粒的构建。

根据genbank中登录的caninecv基因组参考序列(登录号:mg266899),确定rep基因序列,进行rep全长基因(912bp)的体外合成,并克隆至pmd-18t载体,获得重组质粒pt-rep。将pt-rep质粒转化至感受态细胞dh5α,通过pcr和测序对构建的重组质粒进行验证。结果pcr扩增可得到与预期大小完全一致的特异性核酸条带;对扩增产物测序结果表明,该序列与caninecvrep基因(mg266899)的同源性为100%。将含有重组质粒的阳性菌过夜培养后,提取质粒,并测定重组质粒浓度。经测定,重组质粒pt-rep浓度为100ng/μl。

2、caninecvrep基因重组质粒拷贝数的确定。

根据下列公式,计算重组质粒pt-rep拷贝数:拷贝数(copies/μl=6.02×1023×质粒浓度(ng/μl)×10-9/(质粒碱基数×660)。提取重组质粒pt-rep的浓度为100ng/μl,重组质粒的碱基数为3604bp,经计算得知提取质粒的拷贝数为2.95×1010拷贝/μl。经系列倍比稀释,将pt-rep质粒拷贝数稀释在1×108~100拷贝/μl之间。

3、caninecvrpa引物的设计与合成。

下载genbank公布的32个caninecv不同地域流行毒株(cdx8/2017、cdx2/2017、cqs2/2016、cqs8/2016、cqm7/2016、cd17/2016、ha13、214、cb6293/2-14、az4133/2-13、pe8575/2-13、te6685/2-13、az663/2-13、pe8575/1-13、te7482-13、te6685/1-13、az663/1-13、az5586-13、az5212/2-14、az5212/1-14、az4438-13、az4133/1-13、te4016-13、az2972-13、cb6293/1-14、jz98/2014、fuberlin-jrs、bari/411-13、ucd1-1698、ucd2-32162、ucd3-478、ucd1-1698)复制相关蛋白rep基因,通过blastn和dnaman软件对caninecv不同地域流行株rep基因进行序列比对,筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列。参考rpa引物设计的基本原则,使用primer5.0软件设计了6对特异性引物(表1),通过rpa试验筛选出具有高特异性和敏感性的rpa检测引物。设计的rpa引物扩增目的片段大小约为210~220bp。同时,合成荧光定量pcr方法使用的特异性引物qpcrfp和qpcrrp。引物名称及序列见表1。

4、caninecvrpa反应体系的配制及操作程序。

配制50μlrpa反应体系,包括rpafp和rparp(浓度均为10μm)各2.5μl,rehydrationbuffer29.5μl,ddh2o12.0μl,模板1μl,280mmmgac2.5μl。将模板和mgac之外的所有试剂预混后,转入预添加exo冻干酶制剂的0.2mlpcr反应管中,并充分混匀。将1μl模板加入反应管中,并将2.5μlmgac加在反应管盖中,混匀,盖紧后瞬时离心,放入水浴锅中进行rpa反应。

5、caninecvrpa反应条件的优化。

5.1rpa最佳反应时间的确定。

为了确定rpa最佳反应时间,配制6管50μlrpa反应体系,以pt-rep重组质粒dna为模板,分别进行10min、15min、20min、25min、30min、35min的rpa扩增,根据产物量来确定rpa最佳反应时间。结果发现,在40℃下rpa反应时间为20min时,可扩增得到一条大小为220bp的特异性条带;当rpa反应25min时,得到的扩增产物量约为20min时条带的3倍,而反应30min、35min时rpa产物量没有显著增加。因此caninecvrpa最佳反应时间确定为25min。

5.2rpa最佳反应温度的确定。

为了确定rpa最佳反应温度,配制5管50μlrpa反应体系,以pt-rep重组质粒dna为模板,分别放入25℃、30℃、35℃、40℃和45℃水浴箱内进行扩增反应,25min后分别从各管中取10μl扩增液,根据产物量来确定rpa最佳反应温度。结果发现,在25~45℃的温度范围内rpa均可有效进行,其中40℃时扩增效果最佳,rpa产物量最大,因此rpa最佳反应温度确定为40℃。

5.3rpa最佳引物的筛选。

为了筛选出rpa最佳引物,以重组质粒pt-rep为模板,分别用6对caninecvrpa引物(rpafp1-rp1、rpafp2-rp2、rpafp3-rp3、rpafp4-rp4、rpafp5-rp5、rpafp6-rp6)进行rpa扩增,随后用对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,根据扩增结果的特异性、敏感性和产物量筛选出rpa最佳引物。结果6对引物均能扩增出目的基因片段,其中rpafp5-rp5引物对的特异性、敏感性和产物量最高,因此rpafp5-rp5引物对确定为caninecvrpa最佳检测引物(表1)。

5.4rpa-lfa检测方法操作步骤及结果判定。

在rpa扩增结束后,用微量移液器取5μlrpa产物,加入eb染色液后,进行2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察rpa扩增结果。若扩增产物大小约为220bp,与预期大小完全相符,则结果判为caninecv核酸检测结果为阳性(图1);若没有扩增条带或者扩增产物大小与预期大小不相符,则结果判为caninecv核酸检测结果为阴性。

6、caninecvrpa检测引物的特异性试验。

用病毒dna提取试剂盒分别提取将犬细小病毒(cpv)、犬传染性肝炎病毒(ichv)的基因组dna;用病毒rna提取试剂盒分别提取犬瘟热病毒(cdv)、犬冠状病毒(ccv)、狂犬病病毒(rv)的总rna,反转录成cdna;然后分别以上述病毒的核酸样品(dna或cdna)和caninecv重组质粒pt-rep为模板,分别用筛选出来的rpa引物fp5-rp5进行rpa扩增,每种病原的核酸样品重复检测3次,分析caninecvrpa引物的特异性。检测结果证实,只有caninecv核酸样品(重组质粒pt-rep)rpa检测结果为阳性,其他病毒dna或者cdna核酸样品的rpa检测结果均为阴性,表明rpa引物fp5-rp5对其他病毒的核酸模板没有出现非特异性扩增反应,证实rpa检测引物fp5-rp5具有良好的特异性。

7、caninecvrpa检测引物的敏感性试验。

将caninecv重组质粒pt-rep进行10倍倍比稀释,使其浓度在1×108、1×107、1×106……~1×100拷贝/μl之间,并将不同稀释度的重组质粒作为模板,用fp5-rp5引物进行rpa反应,确定该方法的最低检测浓度;同时进行荧光定量pcr检测(图2),对rpa与荧光定量pcr方法的敏感性进行比较。检测结果发现,用fp5-rp5引物rpa最低可以检测到1×101拷贝/μlcaninecv重组质粒dna,荧光定量pcr检测方法最低也可以检测到1×101拷贝/μl重组质粒dna,表明rpa与荧光定量pcr方法的敏感性相同,证实本研究所发明的caninecvrpa检测引物fp5-rp5具有良好的敏感性。

以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110>石河子大学

<110>石河子大学

<120>快速检测犬圆环病毒感染的rpa引物及其用途及试剂

<141>

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<212>dna

<213>犬圆环病毒(caninecircovirus,caninecv)

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<221>misc_feature

<223>repgene

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<212>核苷酸序列

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