酶修饰的结冷胶的制作方法

本发明涉及一种通过改变酰基取代水平的酶处理而改变结冷胶的结构和功能特性的方法。本发明进一步涉及通过所要求保护的方法生产的部分脱酰基结冷胶，以及所述部分脱酰基结冷胶作为食物产品、药物制剂和个人护理产品中的成分的用途。

背景技术：

结冷胶是由伊乐藻鞘氨醇单胞菌(sphingomonaselodea)(atcc31461)合成的微生物胞外多糖。结冷胶聚合物的重复单元(ru)是由两个d-葡萄糖残基和一个l-鼠李糖残基以及一个d-葡糖醛酸残基组成的四糖，其具有以下结构[→3)-β-d-glcp(1→4)-β-d-glcap(1→4)-β-d-glcp(1→4)-α-l-rhap(1→]。所述天然多糖是部分酯化的；1，3-d-glc残基可在c-2处连接至l-甘油酸酯和/或在c-6处连接至乙酸酯。图1a示出了c-2处为甘油酸酯且c-6处为乙酸酯的结冷胶的重复单元的化学结构图。

结冷胶是一种高效的胶凝剂和结构化剂，因此已被发现对食品工业具有吸引力。结冷胶以极低的浓度使用，冷却后会胶凝，并且由于其通过细菌发酵生产，因此具有稳定的质量和可靠的供应。低浓度的结冷胶形成具有明显屈服应力的流体凝胶，所述流体凝胶在颗粒悬浮方面非常有效。另外，高度假塑性流动在较高的剪切速率下提供了低粘稠度，导致对口感的影响很小。这些功能的结合使结冷胶在乳制品、饮料、敷料和调味汁等应用中非常有用。

结冷胶产品以以下两种形式商业生产；与伊乐藻鞘氨醇单胞菌表达的天然形式相似的高酰基(ha)形式，其中每个重复单元平均有1个甘油酯取代和0.5个乙酸酯取代；以及低酰基(la)形式，其中通过碱处理将酰基取代基完全去除。

酰基基团对凝胶特性有深远的影响。ha结冷胶产生柔软、有弹性的非脆性凝胶，而la结冷胶产生硬的、非弹性的脆性凝胶。la结冷胶的x射线衍射图表明其作为3重对称的同轴双螺旋以固态存在(chandrasekaran等人，1988a，b)。ha结冷胶的螺旋结构首先通过计算机建模来探索，以从脱酰聚合物的这种已知的固态几何结构中推断出来(chandrasekaran等人，1990)。主要结论是乙酸酯基团位于几何结构没有改变的螺旋的外围，但是甘油酸酯的容纳需要改变螺旋的几何结构。另外，据报道，甘油酸酯取代基主要负责稳定结冷胶的螺旋构象，从而导致ha结冷胶的高胶凝温度，而乙酸酯取代基通过位于螺旋的外围而在空间上阻碍了螺旋-螺旋的聚集，从而产生柔软且有弹性的凝胶(morris等人，1996)。

尽管理论上天然结冷胶的每个重复单元包含1个甘油酸酯取代和0.5个乙酸酯取代，但可用的工业ha结冷胶产品包含更少的取代(从3个不同生产商的22种结冷胶产品计算得出，每ru含有大约0.8个甘油酸酯和0.45个乙酸酯，结果未公布)。据报道，天然结冷胶含有约13重量％的甘油酸酯基团和约5重量％的乙酸酯基团，参见us5190927。酰基取代对结冷胶功能性的高影响表明，即使ha产品的酰基水平发生微小变化，对应用性能也可能很重要。

众所周知，其他水状胶质的离散结构的变化也会影响功能，例如果胶的脱甲酯化作用，这种作用可通过由ca²⁺键介导的所谓蛋盒结构诱导凝胶形成。果胶可以使甲基化半乳糖醛酸成嵌段分布或更随机分布，并且嵌段化程度对果胶功能以及果胶在食品系统中的表现有很大影响(remoroza等人，2014)。

先前，已经采取了不同的方法来获得可变水平的结冷胶酰化。通过用弱碱处理对结冷胶进行化学脱酰作用公开于us8,231,921b2和ca2334635，morrison等人(1999)以及morris等人(1996)中。通过改变发酵期间的条件，例如通过使用溶解氧张力或生长培养基组成的变化，也可以产生结冷胶的酰化水平的差异(fialho等人(1999)和dreveton等人，(1996))。

us5,190,927公开了一种使结冷胶部分脱酰基的方法，使得结冷胶具有低水平的乙酸酯残基(0-1重量％)，但保留一些或大部分甘油酸酯残基(3-12重量％)。在发酵伊乐藻鞘氨醇单胞菌以产生天然结冷胶后，在25℃-40℃下用koh调节ph持续6-18小时，然后使ph降至6-8。据报道，所得的部分脱酰基结冷胶能够形成弹性的、非脆性的凝胶。

而且，已经将所述生产微生物的遗传改变用作改变结冷胶酰化的最终水平的策略(us2003/100078和jaya等人(1998))。

通过ha结冷胶和la结冷胶的共混物可产生多种凝胶质地。然而，已经证明ha和la形式的混合物在与单个组分一致的温度下表现出两个不同的构象转变(morrison等人，1999)。

已知乙酸酯取代会影响结冷胶螺旋之间的相互作用。当存在乙酸酯时，它会通过空间阻断离子介导的相互作用来干扰螺旋间的聚集。相反，乙酸酯对单个结冷胶螺旋的形成和稳定性的贡献很小，这主要受甘油酸酯的存在的影响(morris等人，1996)。因此，特异地去除乙酸酯将提供结冷胶中间体，所述结冷胶中间体由于未改变的甘油酸酯水平而保持了单个螺旋的高稳定性，从而提供了高的胶凝温度，但是就影响性能(例如，热滞后)的螺旋间相互作用而言，其具有较低的酰基结冷胶性能。

在本发明中显示了通过酶进行的高特异性乙酸酯去除，其中通过pae12b酶逐渐去除乙酸酯，同时甘油酸酯含量保持在对照的约100％。只有在高温(70℃)和较长孵育时间(20小时)下进行处理，才能部分除去甘油酸酯。在相同条件下但不含酶的情况下孵育的样品中也可见到甘油酸酯的去除。这表明甘油酸酯的去除不是由酶介导的。当进行化学脱酰作用时，已经显示出选择用于碱处理的特定条件可以实现除去甘油酸酯或乙酸酯的某些特异性(ep0526926和morris等人，1996)。但是，这种特异性并不像酶促脱酰作用那样完整。在ep0526926的实例2、3和4中，在碱处理期间使用低温特异地除去了乙酸酯。然而，甘油酸酯的起始水平为约11.3％，并且在碱处理期间降低至约9％。该降低为起始甘油酸酯水平的约20％，并且表明化学脱酰作用不如使用本发明的酶促方法所能获得的那么具有特异性。

本发明的目的是提供具有中等酰基水平和期望的稳定性的结冷胶，以获得具有单一构象转变并因此表现为单一成分的产品。

技术实现要素：

已知作用于果胶的酯酶具有不同的作用机理，如无规或嵌段方式脱酯化作用，这反过来又提供了对果胶的功能特性的影响非常不同的修饰。在通向本发明的研究期间，发明人假定作用于结冷胶的酯酶在作用机理上可能具有相似类型的差异，这可能导致通过酶促脱酰作用获得的结冷胶中间体的额外功能特性。

以ha结冷胶或la结冷胶形式产生的结冷胶代表了凝胶质地的两个对位，因此，部分脱酰基结冷胶可以潜在地提供具有一个广泛特性的中间凝胶质地。能够控制酰化水平可以使结冷胶具有订制的设定温度和流变性质，理想地为所有凝胶质地提供一种水状胶质。根据各种食品应用的特定功能需求订制结冷胶的分子结构，本发明可以提供一系列新产品。这些产品可以单独使用，也可以组合成共混物用于各种食品系统。

使用中等酰化的结冷胶，可以实现从硬且脆到软且有弹性的多种质地，从而在具有一种通用水状胶质成分的食品系统中实现一系列功能。morrison等人(1999)已经证明了这一点的价值，其中明胶的质构特性与部分脱酰基结冷胶紧密匹配。

与上述策略不同的用于产生中等酰化结冷胶的方法是采用酶处理。通过使用经酯酶(所述酯酶可以从聚合物中特异性去除乙酸酯和/或甘油酸酯基团)处理的高酰基天然结冷胶，可以改变酰基取代的水平。与化学脱酰化相比，酶促去除酰基基团可能更容易控制。例如，与us5190927中公开的导致乙酸酯基团和一些甘油酸酯基团均去除的化学处理不同，可以通过适当选择酶而仅除去乙酸酯基团或仅除去甘油酸酯基团。另外，酶促脱酰作用可产生其他类型的脱酰作用模式，如嵌段方式脱酰作用。此外，已经发现酶促脱酰作用不会像化学脱酰作用那样显著地影响结冷胶的聚合物长度。分子量对于凝胶强度和质地至关重要，因此酶促方法可能产生具有有益特性的新型高分子量低酰基结冷胶。

因此，本发明涉及一种用于制备部分脱酰基结冷胶的方法，所述方法包括用能够使结冷胶部分脱酰基的酯酶处理天然结冷胶或高酰基结冷胶。

在另一个方面，本发明涉及部分脱酰基结冷胶，其分子量与天然结冷胶的分子量相比下降小于10％。

在另一个方面，本发明涉及一种食物产品，其包含如本文所述的经酶修饰的部分脱酰基结冷胶。

在又另一个方面，本发明涉及一种药物制剂，其包含如本文所述的经酶修饰的部分脱酰基结冷胶。

在又另一个方面，本发明涉及一种个人护理产品，其包含如本文所述的经酶修饰的部分脱酰基结冷胶。

从下面的示意图(图2)可以看出，低酰基结冷胶(la)和高酰基结冷胶(ha)处于凝胶质地范围的任一极端，而其他形成胶体的水状胶质位于所述范围之间。通过本发明的方法能够产生中等酰化结冷胶，这可以用一种水状胶质提供跨越整个质地范围的选择，并提供当前水状胶质产品组合所不具备的独特流变性质。

附图说明

参照附图进一步描述本发明，其中

图1a示出了高酰基结冷胶的重复单元(ru)的化学结构，并指出了乙酸酯和甘油酸酯取代基的位置。从左到右的顺序是鼠李糖、葡萄糖、葡糖醛酸和葡萄糖。与鼠李糖的还原端进行α结合的葡萄糖具有与c-6位置结合的乙酸酯和与c-2位置结合的甘油酸。图1b示出了与图1a相同的化学结构，除了r¹可以是羟基或甘油酸，或r²可以是羟基或乙酸。

图1c是一张表，其示出了在结冷胶中存在的、关于酰化模式(分别在ha结冷胶和la结冷胶中存在甘油酸酯基团和/或乙酸酯基团)的四种不同ru的组成。

图2是由不同的水状胶质制成的凝胶的凝胶质地的示意图，从由高酰基结冷胶制成的柔软且有弹性的凝胶到由低酰基结冷胶制成的硬且脆的凝胶，以及由介于其间的其他水状胶质制成的凝胶。

图3是条形图，其示出了在有或没有酶pae12b、v2010和rapidasepress(缩写为r.press)的条件下，将ha结冷胶在ph6.3和40℃-70℃的温度下孵育0、1、3或20小时后，结冷胶上残留的乙酸酯和甘油酸酯的水平。

图4a示出了将ha结冷胶与酯酶pae12b在ph6.6下一起孵育0-4小时后，通过nmr光谱法测量的结合乙酸酯和游离乙酸酯的水平。

图4b是示出在不同酶浓度下随时间变化的游离乙酸酯定量的图。在此图中，很明显，使用pae12b酶可以获得不同水平的脱乙酰基作用。

图5是示出用酯酶pae12b处理ha结冷胶0、45、90和135分钟后的胶凝温度变化的图。

图6是与未用酶处理的结冷胶相比，根据酶处理(脱乙酰化)的结冷胶的胶凝特征绘制的20℃下g’的图。

具体实施方式

由于先前没有描述过能够使结冷胶脱酰基的酶，因此使用一组选定的酶进行这种活性的筛选。候选酯酶的选择基于2个标准：被注释或显示出能够使多糖脱酰基，和/或由嗜热微生物合成并且已知在高温下具有活性(高于约70℃的高酰基结冷胶胶凝温度)。

进行筛选试验，不断提高其复杂性。首先，使用一般的酯酶底物4-硝基苯基乙酸酯分析酯酶活性，从而为选定的候选酶提供最佳的ph和温度。其次，测试了酶对结冷胶的活性，所述结冷胶已被超声处理预先降解以避免反应过程中ha结冷胶的凝胶化。通过uv方法(megazymes，k-acet)或nmr，使用乙酸定量进行分析。最后，测试选定的酶对再水合的天然结冷胶的活性，其中对酶处理后残留的乙酸酯和甘油酸酯进行定量。因此，将结冷胶与选定的酶一起孵育一段时间，然后通过水解消化成较小的寡聚物。使用lc-ms在寡聚物上测定甘油酸酯和乙酸酯的水平。

在筛选过程中发现的合适的酯酶是一种能够使结冷胶脱乙酰的酶，更具体地讲是碳水化合物酯酶家族的一种乙酰酯酶，特别地是一种果胶乙酰酯酶。

酯酶可以例如来源于嗜热微生物，并且在高于约40℃的温度，优选在65℃-80℃的温度，如约70℃-75℃的温度下具有酶活性。这种酯酶的实例是来自热纤梭菌(clostridiumthermocellum)的果胶乙酰酯酶(pae12b，目录号cz00371，nzytech公司)。

在本方法中，酯酶处理可以适当地在ph5.5-7.5，优选地在ph6.0-7.0，如ph6.0-6.5下进行。进行酯酶处理的温度优选地在40℃-80℃，更优选地在60℃-75℃，如65℃-75℃。举例来说，pae12b酶的最适温度范围宽广，在高于80℃具有活性，因此可以在高酰基结冷胶的胶凝温度(约70℃)以上使用。

使用酯酶pae12b进行酶处理，对获得部分脱酰基结冷胶的最适条件进行详细分析。这使得产生具有中间水平的乙酸酯取代的结冷胶样品成为可能。发现使用pae12b进行酶促脱乙酰的最佳反应条件是ph6.0-6.5、70℃-75℃。在该ph以上，发生包括甘油酸酯水解在内的化学脱酰作用，在该ph以下，酶活性可忽略不计。在此温度以上，酶活性可忽略不计，在此温度以下，ha结冷胶在所用条件下形成固体凝胶。

酯酶处理可以通过向含有天然结冷胶的发酵液中添加足够量的能使结冷胶部分脱酰基的酯酶来进行，其中酯酶处理进行足够的时间段以使结冷胶部分脱酰基，例如10-1440分钟的时间段。已经发现100-2000单位的酯酶/l发酵液的量足以实现部分脱酰基，其优选地进行60分钟。

天然结冷胶可以通过在适当的含有碳、氮和无机盐的合适来源的水性生长培养基中对伊乐藻鞘氨醇单胞菌(atcc31461)进行需氧发酵而产生。合适的碳源是糖类，如淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖等。合适的氮源是酵母水解物、豆粕、无机氮等。合适的无机盐包括钠、钾、钙、铵、磷酸盐、硫酸镁等。

在酶处理之前，可以通过用其他类型的酶例如蛋白酶和溶菌酶处理来适当地澄清发酵液。

在酯酶处理之后，可以通过用有机溶剂(例如醇，例如异丙醇或乙醇)进行沉淀来从发酵液中分离部分脱酰基结冷胶。

在可替代的实施例中，在从发酵液中分离出结冷胶后进行酯酶处理。在该实施例中，以100-2000单位/克分离的结冷胶的量添加酯酶。

已经发现部分脱乙酰化对结冷胶的流变性质有影响。根据胶凝特征绘制的20℃下g’的图表明，与未用酶处理过的样品相比，酶处理过的样品在最长的反应时间具有较低的粘度(以pa为单位)，参见图6。这表明选择性去除乙酸酯导致较软的凝胶质地，这在某些应用(例如，糖果果冻(confectionaryjellies)、带果块的果冻(dessertgels)、果酱和果冻、烘焙馅料和乳制甜食)中可能是有利的。

还发现由于酶处理导致的结构变化产生结冷胶的胶凝温度的变化，如通过在酶促脱酰作用之前和之后测量结冷胶的胶凝特征所确定的。结冷胶的胶凝温度在特异性去除乙酸酯取代的过程中升高，这显示出对结冷胶功能特性的影响取决于酶促反应的时间，参见下面的图5和实例3。升高胶凝温度会升高形成凝胶的温度，因此可导致凝胶在较高温度下的稳定性。这对于最终产品中较高的填充温度可能是有利的。而且，已经发现具有升高的胶凝温度的部分脱酰基结冷胶能够在低浓度的液体中形成流体凝胶，因此可以有利地用于稳定包含例如蛋白质或不溶性矿物质的悬浮颗粒的饮料。

本发明的部分脱酰基结冷胶的分子量与天然结冷胶的分子量相比下降小于10％。这是一个优点，因为分子量对于胶凝强度和质地很重要。这些功能特性对于结冷胶提供合适的食物产品稳定性的能力很重要，因为凝胶形成需要提供一个能够悬浮颗粒成分(如蛋白质或不溶性矿物质)的网络。

在一个实施例中，本发明涉及一种部分脱酰基结冷胶，其中多糖链的0％至48％的重复单元包含乙酸酯残基。多糖链的优选0％至25％、更优选0％至10％、甚至更优选0.5％至5％的重复单元包含乙酸酯残基。

在一个实施例中，本发明涉及一种部分脱酰基结冷胶，其中多糖链的0％至48％的重复单元包含甘油酸酯残基和乙酸酯残基。多糖链的优选0％至25％、更优选0％至10％、甚至更优选0.5％至5％的重复单元包含甘油酸酯残基和乙酸酯残基。

在一个实施例中，本发明涉及一种部分脱酰基结冷胶，其中多糖链中的5％至50％的重复单元既不包含乙酸酯残基，也不包含甘油酸酯残基。多糖链的优选10％至30％、更优选20％至25％的重复单元既不包含乙酸酯残基，也不包含甘油残基。

在一个实施例中，本发明涉及一种部分脱酰基结冷胶，其表现出的胶凝温度为60℃至85℃，优选地为70℃至80℃。据认为，根据该实施例的部分脱酰基结冷胶对稳定饮料特别有用，因其能够以低浓度在液体中形成流体凝胶，从而使存在于液体中的颗粒悬浮。

可以通过本文公开的发明方法适当地制备所述部分脱酰基结冷胶。

产生与完全酰化或完全脱酰化的结冷胶所获得的功能不同的能力为在食物产品中使用结冷胶提供了新的机会。

因此，本发明的部分脱酰基结冷胶可以作为胶凝剂或质地剂添加到食物产品中以调节其质地和粘度，所述食物产品例如选自由以下组成的组：饮料(beverages)、果酱(jams)、果冻(jellies)、烘焙馅料(bakeryfillings)、糖果(confections)、乳制品(dairyproducts)、带果块的果冻(dessertgels)、糖霜(frostings)、糖衣(icings)、釉料(glazes)、低脂涂抹食品(low-fatspreads)、微波食品(microwavablefoods)、烘焙食品(bakedgoods)、布丁(puddings)、调味汁(sauces)和敷料(dressings)、结构化食品(structuredfoods)和浇头(toppings)。食物产品中部分脱酰基结冷胶的浓度可以在0.02重量％至2重量％变化，这取决于从液体(饮料)到半固体或固体(果冻和布丁)所需的质地和粘度。在一个具体实施例中，所述食物产品是旨在供吞咽困难的患者摄取的结构化食物产品或胶状液体。吞咽困难是人吞咽有困难的病症。通常通过为患者提供特定粘度和质地的食物来管理这一病症。通过部分脱乙酰基化改变结冷胶的质地，可以产生一系列适合吞咽困难管理的质地。

在另一方面，可以将本发明的部分脱酰基结冷胶添加到药物制剂中，如用于片剂的包衣，以代替硬胶囊和软胶囊中的明胶，或作为包含一种或多种治疗活性成分和适当赋形剂的凝胶、乳膏和洗剂中的增稠剂或胶凝剂。所述制剂中部分脱酰基结冷胶的浓度典型地为0.02重量％-2重量％，这取决于从液体(例如洗剂)到半固体(例如乳膏)或固体(例如片剂或胶囊)所需的质地和粘度。

在另一方面，可以将所述部分脱酰基结冷胶作为增稠剂或胶凝剂添加到个人护理产品，如牙膏、液体皂、洗发剂、沐浴露、乳膏、爽身水(bodylotion)、身体凝胶(bodygel)和除臭剂中。所述制剂中部分脱酰基结冷胶的浓度典型地为0.02重量％-2重量％，这取决于从液体(例如液体皂)到半固体(例如乳膏、爽身水、洗发剂、牙膏)所需的质地和粘度。

实例

实例1

通过伊乐藻鞘氨醇单胞菌的需氧发酵制备ha结冷胶，并如上所述进行分离。

将分离的ha结冷胶在ph6.3和40℃-70℃下单独孵育，或与约2000酯酶单位/克结冷胶的量的pae12b(nzytech公司)、v2010(西格玛公司)或rapidasepress(dsm公司)其中之一的酶混合孵育不同的时间段。如上所述，对处理前后的结冷胶上存在的乙酸酯和甘油酸酯进行定量。如图1c所示，结冷胶中存在4个不同的重复单元(ru)。从理论上讲，ha结冷胶由50％ru1和50％ru2组成，而la结冷胶由100％ru4(对应于每个ru的1个甘油酸酯(100％甘油酸酯)和每隔一个ru的1个乙酸酯(50％乙酸酯))组成。如条形图(图3)所示，此实验中使用的ha结冷胶含有约80％的甘油酸酯和45％的乙酸酯(0小时)。在不存在酶的条件下于ph6.3、70℃孵育1、3和20小时后，由于弱碱性条件，甘油酸酯被缓慢除去，而乙酸酯水平几乎保持不变。用酯酶pae12b在ph6.3和40℃-70℃温度下进行的孵育基本上降低了乙酸酯的水平。在70℃时效果最高，这与该酯酶的最适温度相一致。在70℃下，甘油酸酯的去除速率类似于没有酯酶的对照条件，但是观察到在所用的实验条件下，酶促去除乙酸酯比化学脱酰作用要快得多，并且有可能找到酶促去除乙酸酯的同时化学脱酰作用仍然微不足道的最适条件。结果表明，酯酶pae12b从结冷胶中特异性去除乙酸酯，而不去除甘油酸酯。另外，发现两种不同的酶产品v2010(西格玛公司)和rapidasepress(r.press，dsm公司)能够使结冷胶脱乙酰化，尽管在相同条件下这两种酶产品的脱乙酰化速度比pae12b慢。对于v2010，在40℃孵育20小时后效果最高；对于rapidasepress，在40℃和70℃孵育20小时后效果最高，参见图3。

实例2

将按实例1所述制备的分离的ha结冷胶与酯酶pae12b在ph6.6下一起孵育0-4小时，然后通过nmr光谱法测定结合乙酸酯和游离乙酸酯的量。结果显示在图4a中，从图中看来，在所用的实验条件下，随着酶剂量的增加，酶促脱乙酰化进展更快。图4b中的图示出了在酶反应期间游离乙酸酯的定量，并且可以通过调节反应时间和酶剂量来控制乙酸酯去除水平。

实例3

在与实例1和实例2所述相同的条件下，将分离的ha结冷胶与酯酶pae12b一起孵育。通过将ph降低至pae12b具有可忽略的活性的水平，在不同的时间点停止酶促反应。然后，通过流变学分析溶液，以提供胶凝特征和温度。结果在图5中示出。当对结冷胶进行酶处理时，发现胶凝温度升高了5℃-10℃，这与同时去除乙酸酯取代有关。对于在这些条件下没有与甘油酸酯的缓慢去除相关的酶的样品，观察到胶凝温度有缓慢且较小的下降。

还显示部分脱乙酰化对结冷胶的流变性质有影响。根据胶凝特征绘制的20℃下g’的图表明，与未用酶处理过的样品相比，酶处理过的样品在最长的反应时间具有较低的粘度(以pa为单位)，参见图6。这表明乙酸酯的选择性去除导致较软的凝胶质地。

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