本发明涉及定量PCR(定量聚合酶链式反应，quantitative polymerase chain reaction：qPCR)法及用于其的试剂盒。更详细而言，本发明涉及用于在qPCR法中校正靶基因的定量结果的方法及用于实施该方法的试剂盒。
背景技术
在施予基因工程化细胞的疗法、例如施予表达对特定肿瘤具有特异性的CAR(嵌合抗原受体)的T细胞(CAR-T细胞)的细胞疗法中，把握施予后的细胞数在生物体内的动力学(细胞动力学)对于把握治疗效果及安全性(副作用)、建立恰当的治疗方针是重要的。
例如，非专利文献1中，记述了为了治疗急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia：ALL)及慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia：CLL)而施予Tisagenlecleucel(研发编号(code name)CTL019)、即含有靶向CD19阳性B细胞的CAR-T细胞的制剂时的生物体内的细胞动力学。可期待所施予的CAR-T细胞在生物体内增殖，能够持续保持一定的细胞数。对于该CAR-T细胞的血液中的细胞数而言，其与作为治疗对象的ALL及CLL的症状呈相关性地变化，并认为其也与作为该制剂的毒性而可能引起的细胞因子释放综合征(CRS)的严重程度相关。因此，可认为对于这种制剂而言，CAR-T细胞的血液中细胞数的动力学是用于评价治疗效果和安全性这两个方面的重要信息。非专利文献1中，作为反映CAR-T细胞数的指标，使用每1μg基因组DNA(gDNA)中的CAR-T基因的拷贝数(拷贝/μg gDNA)。图1中示出该拷贝数于自细胞移植时(约103拷贝/μg gDNA)的数天急剧降低(约101拷贝/μg gDNA)，在此之后急剧上升(约104～106拷贝/μg gDNA)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Mueller等，Blood 2017 130：2317-2325；doi：https://doi.org/10.1182/blood-2017-06-786129.
技术实现要素：
发明所要解决的课题
以往，对于由血液等检体制备的生物体试样中的细胞数而言，如例如非专利文献1那样通过以该细胞的特异性基因为靶标的定量PCR(qPCR)法来以基因拷贝数的形式进行定量。此时，靶基因的拷贝数通常将基因组DNA(gDNA)作为内标(internal standard)，基于例如由基因组中的拷贝数众所周知的基因(例如RNaseP基因)的定量值换算而得的gDNA量进行标准化，使用例如“拷贝数/μggDNA”这样的单位表示为每单位量gDNA的拷贝数。
但是，迄今为止，尚未验证上述基于以往的定量方法的测定值、基于此测定值的细胞动力学是否适合作为用于评价细胞疗法的效果、安全性的指标。
本发明的课题为提供能够例如在细胞疗法中以更高的精度分析细胞动力学的改良qPCR法。
用于解决课题的手段
本申请发明人发现，对于根据以往的常规qPCR法将gDNA作为内标、使用“拷贝/μg gDNA”的单位表示的靶基因的测定值而言，从一些观点出发，可能不具有足以用作用于分析细胞疗法中所施予的CAR-T细胞等的动力学的信息的准确性。
其原因在于，认为用于标准化的gDNA量会根据各种原因而发生较大的变化。例如，就细胞疗法中的gDNA量而言，在细胞疗法中，常规而言，患者在接受CAR-T细胞等的移植前，为了提高该移植的效果，会接受使血液中的淋巴细胞耗竭的化疗。这种情况下，血液中的gDNA量也暂时性地显著减少，之后，随着淋巴细胞的恢复，gDNA量也增加。另外，增殖的CAR-T也会引起gDNA量增加。因此，gRNA量在个人(患者)间、或来自同一个人但采集时期不同的生物体试样间(样品间)未必是恒定的，有可能变化、波动较大。若作为内标的gDNA量发生变化，则与假定gDNA量保持不变的情况相比，以相对于gDNA量的形式表示的靶基因的定量值(拷贝数/μggDNA)也会变化，有可能不会成为正确反映CAR-T细胞在血液中的增殖、存活等的动力学的指标。
进一步，考虑靶基因的回收率的变化也会影响靶基因的拷贝数的定量值。即，来自DNA提取物的靶基因的回收率(相对于生物体试样中所含总DNA中含有的靶基因的正确的拷贝数而言的、从总DNA得到的提取物中含有的、且能够由qPCR扩增的靶基因的拷贝数的比率)也在生物体试样间变化，将gDNA量作为内标的情况下，可能无法充分缓和该靶基因回收率的变化的影响。
本申请发明人发现，通过在生物体试样中添加例如犬的gDNA这样的外源DNA、将此定量值用于标准化，能够获得上述针对靶基因拷贝数的各种影响得到抑制的更为准确的定量值，从而完成了本发明。上述本发明的qPCR法中，能够以每单位量的生物体试样(例如血液)的数值、例如使用“拷贝/μL血液”的单位表示的测定值的形式获得靶基因的拷贝数。
实际上，确认了如作为后述比较例1～3示出的那样、按照以往的qPCR法将gDNA作为内标的情况下，靶基因的定量值的准确率(Accuracy)较低，精密度(C.V.(变异系数，Coefficient of Variation))较大。相对于此，作为后述实施例1～6示出的根据本发明而使用外源DNA为外标(external standard)的情况下，标准基因(standard gene)的定量值的准确率及精密度较之上述以往的方法而言有明显的改善，由此确认了本发明的定量方法的有用性。例如，在使用模拟来自白细胞减少的患者的生物体试样(从健康人的血液中除去了白细胞)的样品的比较例3和实施例3的对比中，显示出了如上所述的本发明的优点。
因此，作为用于解决课题的手段，本发明提供以下的[1]～[6]。
[1]
定量PCR法(qPCR法)，用于测定人细胞中靶基因的含量，所述qPCR法包括下述步骤：将与所述靶基因不交叉的规定量的外源DNA作为用于校正所述靶基因的测定量的外标添加至含有所述人细胞的生物体试样中。
[2]
如项1所述的qPCR法，其中，所述qPCR法为实时PCR法，
所述靶基因的测定量的校正包括求出针对所述靶基因测得的Ct值与针对所述外源DNA测得的Ct值之差(ΔCt)、由此ΔCt换算为所述靶基因的量。
[3]
如项1所述的qPCR法，其中，所述靶基因的测定量的校正包括反映回收率，所述回收率是将基于qPCR法的所述外源DNA的测定量与所述生物体试样中的所述外源DNA的添加量进行对比而求得的。
[4]
如项1所述的qPCR法，其中，所述qPCR法为实时PCR法，所述靶基因的测定量以所述生物体试样的每单位量的拷贝数表示。
[5]
如项1所述的qPCR法，其中，所述人已被施予了基因工程化T细胞(genetically-engineered T cells)，以及/或者患有引起白细胞减少的疾病、或接受了引起白细胞减少的疗法。
[6]
qPCR用试剂盒，其包含作为用于校正靶基因的测定量的外标的、与所述靶基因不交叉的规定量的外源DNA。
发明效果
通过使用外标作为外源DNA校正测定值的本发明的qPCR法，较之使用gDNA作为内标的以往的qPCR法而言，能够以更高的准确率及精密度来对靶基因进行定量。就上述本发明的qPCR法而言，例如，通过在由于白细胞的减少等使得gDNA量大幅度变化的患者中正确地把握含有靶基因的移植细胞数的动力学，能够确立高效、高安全性的治疗计划等。
附图说明
[图1A]图1A表示基于实施例1中的以免疫缺陷小鼠血液作为检体的标准曲线样品(标准液)中的靶基因的Ct值与犬基因组DNA(外标基因)的Ct值之差(ΔCt；纵轴)、与靶基因的浓度(横轴)的关系制作的标准曲线。
[图1B]图1B表示基于比较例1中的标准曲线样品中的靶基因的Ct值(纵轴)与靶基因的浓度(横轴)的关系制作的标准曲线。
[图2A]图2A表示基于实施例2中的以混合人血液作为检体的标准曲线样品中的靶基因的Ct值与犬基因组DNA(外标基因)的Ct值之差(ΔCt；纵轴)、与靶基因的浓度(横轴)的关系制作的标准曲线。
[图2B]图2B表示基于比较例2中的以混合人血液作为检体的标准曲线样品中的靶基因的Ct值与RNaseP(内标基因)的Ct值之差(ΔCt；纵轴)、与靶基因的浓度(横轴)的关系制作的标准曲线。
[图2C]图2C为基于比较例2中的由各供体的血液样品制备的QC样品中的靶基因拷贝数的准确率(纵轴，参见表2B)、与通过吸光度法测得的DNA浓度(横轴)绘制的相关图。
[图2D]图2D为基于实施例2(左侧“外标基因”)及比较例2(右侧“内标基因”)中的、由各供体的血液制备的QC样品中的靶基因拷贝数的准确率绘制的散点图。
[图3A]图3A表示实施例3中的针对向人血液(◆符号)、除去白细胞的人血液(■符号)及缓冲液(▲符号)中分别添加含有靶基因的人基因工程化T细胞而得的样品、根据使用犬基因组DNA(外标基因)制作的标准曲线进行定量而得的靶基因浓度(纵轴)、与添加的细胞数(横轴)的关系。
[图3B]图3B表示比较例3中的针对向人血液(◆符号)、除去白细胞的人血液(■符号)及缓冲液(▲符号)中分别添加含有靶基因的人基因工程化T细胞而得的样品、根据使用RNaseP(内标基因)制作的标准曲线进行定量而得的靶基因浓度(纵轴)、与添加的细胞数(横轴)的关系。
[图4A]图4A为表示实施例6中的、针对从施予第1人基因工程化T细胞的异种移植小鼠采集的血液检体中的靶基因1、通过根据本发明的使用了外标基因(犬基因组DNA)的定量方法以拷贝/μL血液表示的结果(横轴)、及通过使用了内标基因(RNAseP)的定量方法以拷贝/μg gDNA表示的结果(纵轴)的关系的图表。圆符(●符号)的绘图为以5×106个CAR+细胞/动物进行施予的情况，三角符(▲符号)的绘图为以10×106个CAR+细胞/动物的用量施予的情况。
[图4B]图4B为表示实施例6中的、针对从施予第2人基因工程化T细胞的异种移植小鼠采集的血液检体中的靶基因2、通过根据本发明的使用了外标基因的定量方法以拷贝/μL血液表示的结果(横轴)、及通过使用了内标基因的定量方法以拷贝/μg gDNA表示的结果(纵轴)的关系的图表。
[图4C]图4C为表示实施例6中的、第2人基因工程化T细胞的血液样品中的第2人基因工程化T细胞的数量(横轴，细胞/μL血液，通过流式细胞术测定)、与靶基因2的导入水平(纵轴，拷贝/μggDNA，通过使用了内标基因的本发明的定量方法测定)的相关关系的图表。
[图4D]图4D为表示实施例6的、第2人基因工程化T细胞的血液样品中的第2人基因工程化T细胞的数量(横轴，细胞/μL血液，通过流式细胞术测定)、与靶基因2的导入水平(纵轴，拷贝/μL血液，通过使用了外标基因的本发明的定量方法测定)的相关关系的图表。
具体实施方式
-qPCR法-
本发明的qPCR法用于测定人细胞中靶基因含量，其包括下述步骤：将与所述靶基因不交叉的规定量的外源DNA作为用于校正所述靶基因的测定量的外标添加至含有人细胞的生物体试样中。
[靶基因]
本发明中的“靶基因”没有特别的限定，可以从作为基于常规qPCR法的定量的对象的、人细胞中含有的基因中选择。
本发明的一个优选实施方式中，靶基因为“基因工程化T细胞”所含有的基因。“T细胞”包括αβT细胞、γδT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、NKT细胞等。“基因工程”除了基于导入CAR的基因工程以外，还包括基于导入TCR(T细胞受体)的基因工程等。作为代表性的基因工程化T细胞，可举出CAR-T细胞、TCR-T细胞等。
此外，靶基因也可以为基因工程化T细胞以外的“基因工程化免疫细胞”、例如向NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等导入CAR等基因进行改造而得的免疫细胞中含有的基因。
靶基因也可以为例如为了制作CAR-T细胞等转基因细胞而被导入T细胞等宿主细胞中的表达载体所含的基因。表达载体可以为直链状或环状、可以是质粒等非病毒载体，也可以是病毒载体，还可以是基于转座子的载体。作为病毒载体，可举出例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。作为优选的逆转录病毒载体，可举出例如pMSGV载体(Tamada k等，ClinCancer Res 18：6436-6445(2002))及pMSCV载体(Takara Bio Inc.制)。使用逆转录病毒载体的情况下，该载体含有的基因被整合至T细胞等宿主细胞的基因组，因此可以长期、稳定地表达基因。
例如，制作CAR-T细胞作为基因工程化T细胞的情况下，向作为宿主细胞的T细胞中导入基础上通过将下述各部位的肽根据需要介由间隔子连接而构成的CAR表达用基因：(i)识别癌细胞等攻击对象细胞的细胞表面抗原的单链抗体、(ii)跨膜区域、及(iii)诱导T细胞活化的信号传导区域。另外，CAR表达用基因也可以根据需要而并用自杀基因(该基因用于：根据施予基因工程化T细胞后的治疗历程，例如在作为攻击对象的癌细胞消失的阶段施予激活自杀基因功能的药物，从而能够控制生物体内的基因工程化T细胞数量)、细胞因子/趋化因子基因、将基因彼此连接的接头(P2A、F2A、T2A、E2A序列等)等。在使用包含此种CAR表达用基因及其他基因、接头等的CAR-T细胞制作用基因群的情况下，靶基因可以是至少包含能将其确定为CAR-T细胞制作用基因群中所含基因的碱基序列的部分(基因或其一部分)。制作TCR-T细胞作为基因工程化T细胞的情况下也一样，靶基因可以是至少包含能将其确定为TCR-T细胞制作用基因群的碱基序列的部分(基因或其一部分)，所述TCR-T细胞制作用基因群选自包含TCR基因、及根据需要而包含自杀基因、细胞因子/趋化因子基因、将基因彼此连接的接头等的CAR-T细胞制作用基因群。
[外源DNA]
本发明中的外源DNA是用于校正qPCR法中的靶基因的定量值的、作为外标使用的DNA，该DNA具有与靶基因不交叉、也即不会由于靶基因用引物而扩增(可以设计这样的靶序列用引物)的碱基序列。反过来说，外源DNA也必须是与靶基因、其他的对象细胞中或生物体试样中的基因不交叉(可以设计这样的外源DNA用引物)的碱基序列。外源DNA期望含有人不具有的碱基序列(基因等)。
外源DNA没有特别的限定，只要是具有上述特性的碱基序列的DNA即可。作为代表性的外源DNA，可举出人以外的哺乳动物、优选灵长类以外的哺乳动物、例如牛、猪、山羊、绵羊、犬、猫、兔、啮齿类(小鼠、大鼠等)等的基因组DNA。另外，作为外源DNA(含有LNA等DNA以外的核酸的情况下为外源核酸)，也可使用含有人工设计及合成的序列的人工核酸。
外源DNA也可以是为了便于调节添加量而预先分离的DNA，也可以是包含于人以外的哺乳动物的细胞的状态的(添加量以细胞数的形式调节)DNA。对于细胞中含有的外源DNA而言，与细胞中含有的靶基因一同从细胞中提取DNA即可。
外源DNA向生物体试样中的添加量没有特别的限制，可以适当地调节。例如，后述本发明的典型实施方式中，计算靶基因的Ct值与外源DNA的Ct值之差(ΔCt)的情况下，为至少能针对外源DNA求得Ct值(外源DNA的扩增产物量经规定次数以下的PCR循环而达到阈值)的添加量即可。
[生物体试样]
本发明中的“生物体试样”可以使用与用于基于常规qPCR法对人细胞中含有的靶基因进行定量的生物体试样相同的试样。作为这样的生物体试样，可举出例如由血液、脑脊液、骨髓、肿瘤(原发性肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等)、其他可能存在含有靶基因的细胞的采集自生物体的检体所制备的试样。
作为本发明的一实施方式，生物体试样是由自下述人采集的检体制备的：所述人已被施予了基因工程化T细胞，以及/或者患有引起白细胞减少的疾病或接受了这样的疗法。对于已被施予了基因工程化T细胞的患者而言，基于通过本发明的qPCR法而与以往相比有所改善的定量值来分析施予后的该细胞的细胞数的动力学，带来了极大的贡献。另外，对于白细胞减少症(嗜中性细胞减少症、淋巴细胞减少症、单核细胞减少症)的患者、为了实施细胞疗法而接受了使白细胞(淋巴细胞)耗竭的化疗的患者而言，由于现有技术中作为内标的gDNA量的明显减少导致靶基因的定量值受到较大的影响，因此也是特别优选应用本发明的qPCR法的对象。
[步骤]
qPCR法(定量PCR法)指能够定量地测定生物体试样中基因的拷贝数的各种PCR法。此种qPCR法是本领域技术人员周知且惯用的，其基础技术事项、优选技术事项等也可以适用于本发明。
作为qPCR法的代表性的实施方式之一，可举出“实时PCR法”。实时PCR法中，实时监测伴随PCR扩增产物的增加而发出的荧光(信号)，测定扩增产物(信号)到达一定水平为止的循环数，参照使用标准试样制作的标准曲线，推定原本的生物体试样中的靶基因的拷贝数。作为实时PCR法的具体示例，可举出使用经荧光标记的探针的荧光探针法(例如TaqMan法、分子信标法、循环探针法)，和使用通过结合至双链DNA而发出荧光的试剂的嵌合法，本发明中可以使用任意一种方法。
作为qPCR法的另一个代表性的实施方式，可举出“ddPCR法”(微滴式数字PCR法)。对于ddPCR法而言，以在微小分区(孔)中以0或1(或复数)含有靶基因的方式对生物体试样进行有限稀释后实施PCR，通过扩增信号为阴性(不含靶基因)的微小分区数相对于微小分区总数的比例，推定生物体试样中的靶基因的绝对拷贝数。该推定时，针对可能存在含有多个靶基因的微小分区的情况，使用泊松分布进行校正。ddPCR法中，不需要制作标准曲线。ddPCR法中的扩增信号可以基于与针对实时PCR法所示例的相同的荧光探针法等。
用于实施qPCR法(实时PCR法、ddPCR法等)的基础试剂、试剂盒、系统等也有市售，也可以在本发明中进行使用。实施本发明的qPCR法所需的、用于靶基因及外源DNA的各引物(正向引物及反向引物)、采用荧光探针法的情况下使用的探针的碱基序列、碱基长度，可由本领域技术人员适当地设计，以使其能够使靶基因及外源DNA分别特异性地扩增(与其他基因不交叉)。探针及引物可以为与靶序列完全互补的序列，也可以是部分含有错配的序列，也可以是对于这些序列具有能以高严格度(严格的杂交条件)杂交的范围的同源性的碱基序列。
对于采用荧光探针法的情况下使用的荧光物质、与之组成FRET对的淬灭剂没有特别的限制，本领域技术人员可以适当地选择。
本发明的qPCR法包括向生物体试样中添加作为用于校正靶基因测定量的外标的、与靶基因不交叉的规定量的外源DNA的步骤，除此以外的步骤，例如，从检体制备生物体试样的步骤、从人细胞等提取DNA的步骤、通过PCR扩增核酸的步骤(热变性、引物的退火、探针的杂交、延伸反应等)等可以使用与常规qPCR法相同的步骤。
作为qPCR法的代表例之一的实时PCR法中，测定反应产物(被合成并扩增的DNA)的量达到一定量、即根据荧光物质发出的荧光强度绘出的扩增曲线与规定的阈值(threshold)交叉为止的PCR反应的循环数(Ct值)，将其作为反映初期的生物体试样中含有的靶基因的拷贝数(浓度)的测定值使用。存在Ct值越大、则初始的DNA的拷贝数(浓度)越低的关系。PCR中，DNA以指数函数的方式增加，因此两个Ct值之差与对数之差、即初始DNA的拷贝数的比值(指数)相关。
以往的典型实时PCR法中，基于针对作为内标的gDNA的Ct值对靶基因的测定值(Ct值)及最终的测定量(拷贝数)进行校正。即，执行了以下的[B1]～[B3]的操作：
[B1]针对作为内标的gDNA测定Ct值，算出靶基因的Ct值与内标的Ct值之差(ΔCt(i))，由此对初始的测定值(Ct)进行校正；
[B2]另一方面，针对靶基因的拷贝数(浓度)为已知的多个标准试样也测定Ct值，算出与内标的Ct值之差(ΔCt(i_s))，基于多个ΔCt(i_s)与各自对应的已知的靶基因的拷贝数的关系制作标准曲线；
[B3]通过参考此标准曲线，换算校正后的测定值(ΔCt(i))，求得初期生物体试样中含有的靶基因的拷贝数的校正后测定量。最终的测定量使用例如“拷贝数/μg gDNA”的单位表示。
相对于此，本发明的典型实时PCR法中，基于针对作为外标的外源DNA的Ct值来校正靶基因的测定值(Ct值)及最终的测定量(拷贝数)。即，执行了以下的[A1]～[A3]的操作：
[A1]针对作为外标的外源DNA测定Ct值，算出靶基因的Ct值与外标的Ct值之差(ΔCt(o))，由此对初始的测定值(Ct)进行校正；
[A2]另一方面，针对靶基因的拷贝数(浓度)为已知的多个标准试样也测定Ct值，算出与外标的Ct值之差(ΔCt(o_s))，基于多个ΔCt(o_s)与各自对应的已知的靶基因的拷贝数的关系制作标准曲线；
[A3]通过参考此标准曲线，换算校正后的测定值(ΔCt(o))，求得初期生物体试样中含有的靶基因的拷贝数的校正后测定量。最终的测定量可以基于生物体试样的每单位(重量)的拷贝数、使用例如“拷贝数/μg血液”等单位表示。
但是，根据本发明的qPCR法中的使用了外源DNA的靶基因测定量校正的方式不限于上述实时PCR法中针对ΔCt的校正。只要能够与使用针对靶基因测得的定量值自身相比更正确地定量生物体试样中的靶基因的拷贝数，则也可通过其他方式、在例如ddPCR法中使用外源DNA作为外标进行校正。
例如，可考虑针对外源DNA，将在实时PCR法中测定Ct值、利用标准曲线换算为生物体试样中的拷贝数而得的结果、或在ddPCR法中直接测定生物体试样中的拷贝数而得的结果、与实际添加至生物体试样中的外源DNA的拷贝数进行对比，确认两者是否一致，换言之，求出“回收率”(％，(测定量/实际的添加量)×100)。根据回收率偏离100％的程度，可以视需要而对使用实时PCR法或ddPCR法等测得的靶基因的测定量进一步校正(乘以100/回收率)。这样的进一步校正也可以与上述实时PCR法中关于ΔCt的校正组合而实施。
-试剂盒-
本发明的qPCR用试剂盒包含作为用于校正靶基因的测定量的外标的、与靶基因不交叉的规定量的外源DNA，对于除此以外的构成材料(例如，具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶、其他实施qPCR法时需要的试剂、器具等)而言，可以包含与以往的qPCR用试剂盒相同的材料。引物及探针可以根据靶基因及外源基因而另行准备。
实施例
以下的实施例及比较例中使用的犬基因组DNA特异性基因(MC1R)所用的探针、正向引物及反向引物；靶基因1(用于制作CAR-T细胞的导入基因1)所用的探针、正向引物及反向引物；以及靶基因2(用于制作CAR-T细胞的导入基因2)所用的探针、正向引物及反向引物的各碱基序列如下所示。需要说明的是，已确认了靶基因1所用的探针、正向引物及反向引物、和犬基因组DNA特异性基因(MC1R)所用的探针、正向引物及反向引物具有彼此不交叉的碱基序列；以及，靶基因2所用的探针、正向引物及反向引物、和犬基因组DNA特异的基因(MC1R)所用的探针、正向引物及反向引物具有彼此不交叉的碱基序列。
MC1R用探针(序列号1)
5’-GCCTTGGCTGCGCAGGCTGCTGTGGTGCAG-3’
MC1R用正向引物(序列号2)
5’-CGCCCATGTATTACTTCATCTGTTGCC-3’
MC1R用反向引物(序列号3)
5’-CACGGCGATGGCGCCCAGGAA-3’
靶基因1用探针(序列号4)
5’-CGACTACAGGGCCTACT-3’
靶基因1用正向引物(序列号5)
5’-GGAGCTGAGGTCCCTGAGAAG-3’
靶基因1反向引物(序列号6)
5’-CCTGGCCCCAGTAGTCGAA-3’
靶基因2用探针(序列号7)
5’-CTGAGGAGCGAGGATG-3’
靶基因2用正向引物(序列号8)
5’-CCGGAGTGCTGCTGATCAG-3’
靶基因2反向引物(序列号9)
5’-GCTGTGCCAGATCATGCAGTA-3’
[实施例1/比较例1]血液中靶基因浓度(生物体试样的每单位量的拷贝数)的定量中的外标基因的有用性研究
与本实施例及本比较例相关的记述中，“靶基因”指“靶基因1”。将30μL的免疫缺陷小鼠血液作为检体，向其中以成为50、100、200、600、2,000、6,000、20,000、60,000、200,000、600,000及2,000,000拷贝/μL血液的方式添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作标准曲线样品(标准液)。另外，以成为50、100、200、600、4,000、40,000、400,000及2,000,000拷贝/μL血液的方式添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作质控样品(Quality control sample)(QC样品)。向上述全部的样品中分别添加犬基因组DNA(Zyagen公司)1,200ng作为外标基因。从上述全部的样品中分别使用市售的DNA提取试剂(QIAamp DNA Blood Midi Kits，QIAGEN公司)提取基因组DNA后，使用分别针对靶基因及犬基因组DNA特异性基因(MC1R)的探针、正向引物及反向引物实施qPCR定量。qPCR使用QuantStudio 7Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司)，在以95℃、10分钟/(95℃、15秒，及60℃、1分钟)作为1个循环的条件下实施40个循环。
根据靶基因的标准曲线样品的各浓度(拷贝数)的靶基因扩增曲线与阈值(Threshold)交叉时的PCR循环数(Ct值)与各样品的针对犬基因组DNA的扩增曲线的Ct值之差(Delta Ct)、和各标准曲线样品的浓度，制作标准曲线(图1A)。在靶基因的拷贝数为50至2,000,000拷贝/μL血液的范围内确认到标准曲线的线性。
另外，由靶基因的Ct值和各标准曲线样品的浓度制作标准曲线，结果，在靶基因的拷贝数为50至2,000,000拷贝/μL血液的范围内确认到标准曲线的线性(图1B)。
表1A及B分别示出使用Delta Ct及Ct值的标准曲线算出的QC样品中的靶基因拷贝数的结果。根据Delta Ct的标准曲线算出的值(观察值，Observed)的准确率的平均值(Accuracy，Mean)为83.0-108.1％、精密度(coefficient of variation，C.V.)良好，为2.4-17.5％，但根据Ct的标准曲线算出的值的准确率的平均值为46.9-92.7％、精密度为5.0-26.6％，与基于使用了外标基因的Delta Ct(实施例1)的标准曲线的结果相比，使用Ct的标准曲线(比较例1)的方法的定量性更低。根据以上的结果，认为生物体试样的每单位量的拷贝数的定量中，利用外标基因进行的样品间的靶基因拷贝数的校正是有用的。
[表1A]
[表1B]
[实施例2]人血液中的使用外标基因的靶基因浓度(生物体试样的每单位量的拷贝数)定量
与本实施例相关的记述中，“靶基因”指“靶基因1”。将1.8mL的混合了多人血液而得的混合人血液作为检体，以600、2,000、6,000、20,000、60,000、200,000、2,000,000及20,000,000拷贝的分量添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作标准曲线样品(标准液)。另外，向8位供体各自的血液1.8mL中以2,000拷贝添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作QC样品。向上述全部的样品中分别添加犬基因组DNA(Zyagen公司)1,000ng作为外标基因。从上述全部的样品中分别使用市售的DNA提取试剂(QIAamp DNA Blood Midi Kits，QIAGEN公司)提取基因组DNA后，使用针对靶基因及犬基因组DNA特异性基因(MC1R)的探针、正向引物及反向引物实施qPCR定量。qPCR使用QuantStudio 7Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司)，在以95℃、10分钟/(95℃、15秒，及60℃、1分钟)作为1个循环的条件下实施40个循环。
根据靶基因的Ct值与犬基因组DNA的Ct值之差(Delta Ct)、和各标准曲线样品的靶基因添加浓度，制作标准曲线(图2A)。在靶基因的拷贝数为0.33至11,111拷贝/μL血液的范围内确认到标准曲线的线性，因此可认为利用本方法能够定量地测定生物体试样的每单位量的拷贝数。
图2D(右侧)示出使用此标准曲线算出的由8位供体各自的血液制备的QC样品中的靶基因拷贝数的结果。来自任一供体的QC样品中，均针对添加浓度(标称值，Nominal)算出的值(观察值，Observed)的准确率(Accuracy)为87.2-114.9％、精密度(coefficient of variation，C.V.)良好，为9.8％，显示出本方法的优异的定量性。
[比较例2]人血液中的使用内标基因的靶基因浓度(生物体试样的每单位量的拷贝数)定量
与本比较例相关的记述中，“靶基因”指“靶基因1”。使用qPCR的基因拷贝数的定量中，一般而言，实施基于内标基因的样品间的靶基因拷贝数的校正(通过从靶基因的Ct减去内标基因的Ct来对样品间的靶基因拷贝数进行校正的方法)。于是，选择RNaseP作为内标基因，对于实施例2的全部DNA提取液，使用针对人RNaseP的探针、正向引物及反向引物(TaqMan RNase P Control Reagents Kit，Thermo Fisher Scientific公司)实施qPCR定量。qPCR使用QuantStudio 7Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司)，在以95℃、20秒/(95℃、1秒，及60℃、20秒)作为1个循环的条件下实施40个循环。
根据靶基因的Ct值与RNaseP的Ct值之差(Delta Ct)、和各标准曲线样品的浓度，制作标准曲线(图2B)。在靶基因的拷贝数为0.33至11,111拷贝/μL血液的范围内确认到标准曲线的线性。
另一方面，计算8位供体各自的QC样品中的靶基因拷贝数，结果，准确率(Accuracy)为73.4-159.9％，精密度(coefficient of variation，C.V.)为26.7％，该结果与实施例2相比定量性更低(图2D(左侧))。使用260nm的吸光度法(Cytation5，BioTek公司)测定DNA提取液中的DNA浓度，并针对与准确率的相关性进行研究，结果观察到显著的负相关，这暗示了由于供体间的DNA浓度的差异，相对于内标基因而言的相对靶基因浓度会发生变化(图2C)。以上结果显示出如实施例2那样使用了外标基因的定量的优势。
[实施例3]人血液及缓冲溶液中的源自基因工程化T细胞的靶基因浓度(生物体试样的每单位量的拷贝数)的定量
与本实施例及本比较例相关的记述中，“靶基因”指“靶基因1”。将0.5mL的人血液、使用市售的白细胞滤器(PLASMODIPUR，EuroProxima公司)除去白细胞后的人血液、及缓冲溶液作为检体，向其中分别添加4,000、40,000、400,000及4,000,000个细胞的人基因工程化T细胞，制备样品。需要说明的是，上述人基因工程化T细胞是通过将包含靶基因的CAR基因利用逆转录病毒载体导入活化的T细胞而制得的。另外，作为标准曲线样品(标准液)，向0.5mL的人血液中以375、625、1,250、3,750、12,500、37,500、125,000、1,250,000、12,500,000及125,000,000拷贝的分量添加含有靶基因的质粒，制备样品。向上述全部的样品中分别以成为2,000ng/mL的方式添加犬基因组DNA(Zyagen公司)。从上述各样品中使用市售的DNA提取试剂(QIAamp DNA Blood Midi Kits，QIAGEN公司)提取基因组DNA后，使用针对靶基因及犬基因组DNA的探针、正向引物及反向引物实施qPCR定量。qPCR使用QuantStudio 7Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司)，在以95℃、10分钟/(95℃、15秒，及60℃、1分钟)作为1个循环的条件下实施40个循环。
根据靶基因的Ct值与犬基因组DNA的Ct值之差(Delta Ct)、和各标准曲线样品的靶基因添加浓度，制作标准曲线，图3A示出测定添加了基因工程化T细胞的样品中的靶基因浓度的结果。任一个检体中，均确认到与添加细胞数成比例的靶基因拷贝数的增加。另外，根据本方法导出的靶基因的拷贝数与检体的种类无关，都是相同的。根据这些结果，可认为通过本方法，可以定量地测定由于基因工程化T细胞在生物体内的增减导致的生物体试样的每单位量的靶基因拷贝数的变化。
[比较例3]DNA提取液中的相对于基因组DNA量而言的相对靶基因拷贝数的定量
与本实施例及本比较例相关的记述中，“靶基因”指“靶基因1”。作为基因治疗中的靶基因的定量所使用的单位，一般而言，使用靶基因拷贝数相对于基因组DNA量而言的比例。因此，对实施例3中制备的从基因工程化T细胞添加样品中提取的DNA提取液中的人基因组DNA及靶基因拷贝数进行测定，算出靶基因拷贝数相对于基因组DNA量而言的比例。
向DNA提取试剂的提取液AE中以成为1.5、5、15、25、50、150、500、1,500、5,000、50,000、500,000及5,000,000拷贝/μL的方式添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作靶基因的标准曲线样品(标准液)。另外，制备以成为5.625、56.25、562.5、5,625、56,250、112,500及225,000pg/μL的方式添加人基因组DNA(Promega公司)而得的样品，用作测定人基因组DNA含量的标准曲线样品(标准液)。对于上述标准曲线样品及实施例3中制备的基因工程化T细胞添加样品的DNA提取液，使用针对靶基因及人基因组DNA特异性基因序列(RNaseP)的探针、正向引物及反向引物实施qPCR定量。qPCR使用QuantStudio 7Flex实时PCR系统。针对靶基因的qPCR测定中，在以95℃、10分钟/(95℃、15秒，及60℃、1分钟)作为1个循环的条件下实施40个循环。针对人基因组DNA的qPCR测定中，在以95℃、20秒/(95℃、1秒，及60℃、20秒)作为1个循环的条件下实施40个循环。
根据靶基因的标准曲线样品的各浓度(拷贝数)的靶基因扩增曲线的Ct值、和各标准曲线样品的浓度，制作标准曲线，算出基因工程化T细胞添加样品的DNA提取液中的靶基因拷贝数。另外，根据人基因组DNA的标准曲线样品的各浓度(人基因组DNA量)的靶基因扩增曲线的Ct值和各标准曲线样品的浓度制作标准曲线，算出基因工程化T细胞添加样品的DNA提取液中的人基因组DNA量。根据上述结果计算基因工程化T细胞添加样品的DNA提取液中的靶基因拷贝数相对于人基因组DNA量而言的比例，并与添加细胞数进行比较，结果示于图3B。人血液中添加有基因工程化T细胞的样品中，确认到靶基因的拷贝数根据添加细胞数而相应增加，但在除去白细胞后的人血液及缓冲液样品中并未明确观察到靶基因的拷贝数根据添加细胞数而相应增加。可以认为，添加了基因工程化T细胞时，伴随靶基因拷贝数的增加，源自基因工程化T细胞的人基因组DNA也会增加，因此在人基因组DNA的含量与未处理的人血液相比显著降低的已除去白细胞的人血液及缓冲液中，确认不到靶基因的拷贝数根据添加细胞数而相应增加。如此，将靶基因拷贝数相对于基因组DNA量而言的比例用作靶基因拷贝数定量的单位的情况下，由于检体中含有的基因组量可能会影响对应于基因工程化T细胞在生物体内的增减的靶基因拷贝数的变化，因此可以认为，为了不拘于检体种类地对靶基因拷贝数对应于基因工程化T细胞在生物体内的增减的变化进行定量性研究，期望如实施例2所示地测定生物体试样的每单位量的拷贝数。特别地，在由于化疗等引起血液中的基因组DNA量变化的情况下，本方法被认为是更有效的测定法。
[实施例4]使用外标基因进行校正的人血液中靶基因的定量
与本实施例相关的记述中，“靶基因”指“靶基因1”。将从多人采集的各0.5mL血液混合后的混合人血液作为检体，向其中以0.75、1.3、2.5、7.5、25、75、250、2,500、25,000及250,000拷贝/μL血液的浓度添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作标准曲线样品(标准液)。另外，向同样的混合人血液检体中以7.5、200及200,000拷贝/μL血液的浓度添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作QC样品。向上述全部的样品中分别添加犬基因组DNA(Zyagen公司)1,000ng作为外标基因。从上述样品中分别使用市售的DNA提取试剂(QIAamp DNA Blood Midi Kits，QIAGEN公司)提取基因组DNA后，使用针对靶基因及犬基因组DNA特异性基因(MC1R)的探针、正向引物及反向引物实施qPCR定量。qPCR使用QuantStudio 7Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司)，在以95℃、10分钟/(95℃、15秒，及60℃、1分钟)作为1个循环的条件下实施40个循环。
根据靶基因的Ct值与犬基因组DNA的Ct值之差(Delta Ct)、和各标准曲线样品的靶基因添加浓度，制作标准曲线。使用制成的标准曲线，测定QC样品中的靶基因拷贝数，计算出相对误差(Relative error)(＝1-准确率)及精密度。靶基因拷贝数的测定实施了3次，分别于不同的日期进行。结果在表2示出。可以确认使用外标基因进行校正的本发明的定量方法的鲁棒性(robustness)。
[表2]
[实施例5]使用外标基因进行校正的小鼠血液中的靶基因的定量
与本实施例相关的记述中，“靶基因”指“靶基因1”。将30μL的免疫缺陷小鼠血液作为检体，向其中以成为50、200、600、2,000、6,000、20,000、60,000、200,000及2,500,000拷贝/μL血液的方式添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作标准曲线样品(标准液)。另外，以成为50、100、200、600、4,000、40,000、400,000及2,000,000拷贝/μL血液的方式添加含有靶基因的质粒，将制得的样品用作质控样品(QC样品)。向上述全部的样品中分别添加犬基因组DNA(Zyagen公司)1,200ng作为外标基因。从上述样品中分别使用市售的DNA提取试剂(QIAamp DNA Blood Midi Kits，QIAGEN公司)提取基因组DNA后，使用分别针对靶基因及犬基因组DNA特异性基因(MC1R)的探针、正向引物及反向引物实施qPCR定量。qPCR使用QuantStudio 7Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific公司)，在以95℃、10分钟/(95℃、15秒，及60℃、1分钟)作为1个循环的条件下实施40个循环。
根据靶基因的标准曲线样品的各浓度(拷贝数)的靶基因扩增曲线与阈值交叉时的PCR循环数(Ct值)与各样品的针对犬基因组DNA的扩增曲线的Ct值之差(Delta Ct)、和各标准曲线样品的浓度，制作标准曲线。使用制成的标准曲线，测定QC样品中的靶基因拷贝数，计算出相对误差(Relative error)(＝1-准确率)及精密度。靶基因拷贝数的测定实施了3次，分别于不同的日期进行。结果在表3示出。虽然显示与使用人血液的情况(实施例4)相比，使用小鼠血液的情况下基因的提取效率较低，但即使是上述使用小鼠血液的情况(例如临床前实验阶段)，仍然能确认使用外标基因进行校正的本发明的定量方法的有用性。
[表3]
[实施例6]
分别制作：将包含靶基因1的CAR基因利用逆转录病毒载体导入活化的T细胞而制得的人基因工程化T细胞(以下称为“第1人基因工程化T细胞”)；及将包含靶基因2的CAR基因利用逆转录病毒载体导入活化的T细胞而制得的人基因工程化T细胞(以下称为“第2人基因工程化T细胞”。)。
以5×106个CAR+细胞/动物或10×106个CAR+细胞/动物的用量，向异种移植小鼠的静脉内施予第1人基因工程化T细胞。施予的1、3、7、10、14、17、21及28天后，从小鼠的颌下静脉采集血液。另外，以10×106个CAR+细胞/动物的用量，向异种移植小鼠的静脉内施予第2人基因工程化T细胞。施予的1、4、8、11、15、22及29天后，从小鼠的颌下静脉采集血液。
使用于上述的各时间点(除最后一天)采集的血液样品，与实施例2和比较例2同样地分别使用外标基因(犬基因组DNA)及内标基因(RNaseP)制作标准曲线，基于所述标准曲线，通过与实施例2和比较例2同样的测定方法，分别定量血液样品中的靶基因1和靶基因2的拷贝数。结果在图4A、B、C及D示出。针对第1人基因工程化T细胞的血液样品，通过使用内标基因的定量方法、以第1拷贝/μg gDNA表示靶基因1的拷贝数的情况下(纵轴)确认到饱和，相对于此，通过本发明的使用外标基因的定量方法、以拷贝/μL血液表示的情况下(横轴)确认不到饱和。针对第2人基因工程化T细胞的血液样品(图4B)也发现了同样的趋势。另外，就第2人基因工程化T细胞的血液样品中的第2人基因工程化T细胞的数量(横轴，细胞/μL血液，利用流式细胞术测定)与靶基因2的导入水平(拷贝数，纵轴)的相关关系而言，通过本发明的使用外标基因的定量方法、以每单位μL血液示出拷贝数的情况(图4D)下，与通过使用内标基因的定量方法、以每μg gDNA示出拷贝数的情况(图4C)相比，该相关关系更为明确。可以认为，对于根据本发明的定量方法而言，低估体内的CAR-T细胞增殖的风险较低，是更适合评价细胞动力学的方法。