包含消化酶的组合物的制作方法

文档序号:30012453发布日期:2022-05-13 10:01阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种产生高活性稳定胃蛋白酶组合物的方法,其包括:

(a)提供表达重组胃蛋白酶原的微生物;

(b)在所述重组胃蛋白酶原多肽被所述微生物表达并分泌到生长培养基中的条件下培养所述微生物;

(c)收获所述生长培养基并从中去除所述微生物以获得液体起始材料;

(d)将所述液体起始材料的pH降低至小于pH 4.0以获得活化的胃蛋白酶组合物;以及

(e)将所述活化的胃蛋白酶组合物的pH升高至约5.4与7.0之间的pH以获得高活性稳定胃蛋白酶组合物。

2.根据权利要求1所述的方法,其还包括在步骤(d)之后,将活化的胃蛋白酶多肽与所述活化的胃蛋白酶组合物中的其他蛋白质和小分子分离的步骤,和/或在步骤(e)之后,将活化的胃蛋白酶多肽与所述高活性稳定胃蛋白酶组合物中的其他蛋白质和小分子分离的步骤。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述高活性稳定胃蛋白酶组合物包含完整且稳定的蛋白质水解失活形式的重组胃蛋白酶。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述高活性稳定胃蛋白酶组合物在pH 2下具有至少20,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性。

5.根据权利要求4所述的方法,其中在pH 2下的所述特异性活性大于30,000FCC单位/mg总蛋白质、大于40,000FCC单位/mg总蛋白质、大于50,000FCC单位/mg总蛋白质、大于60,000FCC单位/mg总蛋白质或大于65,000FCC单位/mg总蛋白质。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述高活性稳定胃蛋白酶组合物的最终pH在约5.4与6.0之间。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述重组胃蛋白酶原在步骤(c)之前以至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20g/l存在于所述生长培养基中。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述生长培养基在步骤(b)之后过滤,所述液体起始材料在步骤(c)之后过滤,所述活化的胃蛋白酶组合物在步骤(d)之后过滤,和/或所述高活性稳定胃蛋白酶组合物在步骤(e)之后过滤。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述高活性稳定胃蛋白酶组合物中的重组胃蛋白酶包含猪、绵羊、中欧马鹿、山羊、母牛、人、牦牛或瘤牛胃蛋白酶的氨基酸序列。

10.一种产生重组胃蛋白酶原的方法,其包括:

(a)提供表达重组胃蛋白酶原的微生物,其中所表达的胃蛋白酶原被所述微生物分泌到生长培养基中;

(b)培养所述微生物,直至所分泌的胃蛋白酶原以至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20g/l的量存在于所述生长培养基中;以及

(c)收获所述生长培养基并且从中去除所述微生物以获得其中所述重组胃蛋白酶原基本上呈蛋白质水解失活形式的液体材料。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述重组胃蛋白酶原包含猪、绵羊、中欧马鹿、山羊、母牛、人、牦牛或瘤牛胃蛋白酶原的氨基酸序列。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述重组胃蛋白酶原包含SEQ ID No.1-9中的一个的氨基酸序列或与其具有至少90%同一性的序列。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中表达所述重组胃蛋白酶原的所述微生物包含调节所述重组胃蛋白酶原的表达的第一诱导型启动子。

14.根据权利要求13所述的方法,其中所述方法还包括在培养所述微生物的步骤之后或至少部分地与其同时诱导所述重组胃蛋白酶原的表达的步骤。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述微生物选自酵母、丝状真菌、酵母属物种、细菌、毕赤酵母属物种、木霉属物种和曲霉属物种。

16.根据权利要求15所述的方法,其中所述微生物是毕赤酵母属物种。

17.根据权利要求16所述的方法,其中所述微生物还包含辅助因子。

18.根据权利要求17所述的方法,其中所述辅助因子由第二诱导型启动子表达。

19.根据权利要求13-18中任一项所述的方法,其中所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子两者通过甲醇诱导。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法,其还包括所述收获步骤之后的脱盐步骤。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法,其还包括所述收获步骤之后的干燥步骤。

22.根据权利要求21所述的方法,其中所述干燥步骤包括喷雾干燥或冻干。

23.根据权利要求10-22中任一项所述的方法,其中基本上呈所述蛋白质水解失活形式的所述重组胃蛋白酶原能够通过降低pH或通过暴露于酸性环境而活化以产生高活性稳定胃蛋白酶组合物,其中所述高活性稳定胃蛋白酶组合物在pH 2下具有至少20,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性。

24.根据权利要求23所述的方法,其中在pH 2下的所述特异性活性大于30,000FCC单位/mg总蛋白质、大于40,000FCC单位/mg总蛋白质、大于50,000FCC单位/mg总蛋白质、大于60,000FCC单位/mg总蛋白质或大于65,000FCC单位/mg总蛋白质。

25.根据权利要求1-9或权利要求23-24中任一项所述的方法,其中所述高活性稳定胃蛋白酶组合物包含具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列或与其具有至少90%同一性的序列的重组胃蛋白酶。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法,其还包括用至少一种成分配制所述重组胃蛋白酶或重组胃蛋白酶原以分别产生呈液体、粉末、丸剂、片剂或胶囊形式的配制的重组胃蛋白酶组合物或重组胃蛋白酶原组合物。

27.一种治疗胃肠道的疾病或病况的方法,其包括:

(a)提供在配制的组合物中的重组胃蛋白酶原,其中所述胃蛋白酶原通过根据权利要求10-26中任一项所述的方法产生;

(b)施用用于口服施用的所述配制的组合物;其中所述配制的组合物与动物肠道环境接触时,所述胃蛋白酶原被转化为高活性稳定胃蛋白酶;并且其中所述胃蛋白酶有效治疗胃肠道的所述疾病或病况。

28.一种包含重组胃蛋白酶多肽的组合物,其中所述组合物(a)不含动物来源的蛋白质,(b)所述胃蛋白酶多肽基本上呈完整且稳定的蛋白质水解失活形式,(c)所述组合物具有大于约5.4的pH,并且(d)所述组合物具有至少20,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性。

29.根据权利要求28所述的组合物,其中所述组合物具有至少30,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性。

30.根据权利要求28所述的组合物,其中所述组合物具有至少40,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性。

31.根据权利要求28所述的组合物,其中所述组合物具有至少50,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性。

32.根据权利要求28所述的组合物,其中所述组合物具有至少60,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性。

33.根据权利要求28所述的组合物,其中所述组合物具有至少70,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性。

34.根据权利要求28-33中任一项所述的组合物,其中所述组合物具有在约5.4至约6.0之间的pH。

35.根据权利要求28-34中任一项所述的组合物,其中所述组合物呈粉末化形式。

36.根据权利要求28-35中任一项所述的组合物,其中所述蛋白质水解失活的胃蛋白酶多肽形式在室温下在所述组合物中稳定至少6个月。

37.根据权利要求28-36中任一项所述的组合物,其中所述蛋白质水解失活的胃蛋白酶多肽形式在4℃下在所述组合物中稳定至少6个月。

38.根据权利要求35-37中任一项所述的组合物,其中所述组合物具有小于约10%的水分含量。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%w/w的蛋白质含量。

40.根据权利要求28-34中任一项所述的组合物,其中所述组合物呈液体形式。

41.根据权利要求40所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽的浓度是至少2g/l、至少5g/l、至少7g/l、至少10g/l、至少15g/l或至少20g/l。

42.根据权利要求40或权利要求41所述的组合物,其中所述蛋白质水解失活的胃蛋白酶多肽形式在约4℃的温度下在所述组合物中稳定至少30天。

43.根据权利要求28-42中任一项所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽包含猪、绵羊、中欧马鹿、山羊、母牛、人、牦牛或瘤牛胃蛋白酶的氨基酸序列。

44.根据权利要求28-42中任一项所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽包含SEQ ID NO:10或与其具有至少90%同一性的氨基酸序列。

45.根据权利要求28-44中任一项所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽在酵母、丝状真菌、酵母属物种、细菌、毕赤酵母属物种、木霉属物种或曲霉属物种中产生。

46.根据权利要求45所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽在毕赤酵母属物种中产生。

47.根据权利要求25-46中任一项所述的组合物,其中所述组合物中至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%w/w的蛋白质是重组胃蛋白酶。

48.一种包含重组胃蛋白酶原多肽的组合物,其中所述组合物(a)不含动物来源的蛋白质,(b)所述胃蛋白酶原多肽基本上呈完整且稳定的蛋白质水解失活形式,(c)所述组合物具有大于约5.4的pH,并且(d)所述胃蛋白酶原多肽能够被活化为具有至少20,000FCC单位/mg总蛋白质的特异性活性的蛋白质水解活性的胃蛋白酶形式。

49.根据权利要求48所述的组合物,其中所述特异性活性是至少30,000FCC单位/mg总蛋白质。

50.根据权利要求48所述的组合物,其中所述特异性活性是至少40,000FCC单位/mg总蛋白质。

51.根据权利要求48所述的组合物,其中所述特异性活性是至少50,000FCC单位/mg总蛋白质。

52.根据权利要求48所述的组合物,其中所述特异性活性是至少60,000FCC单位/mg总蛋白质。

53.根据权利要求48所述的组合物,其中所述特异性活性是至少70,000FCC单位/mg总蛋白质。

54.根据权利要求48-53中任一项所述的组合物,其中所述组合物是液体并且所述重组胃蛋白酶原多肽以至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20g/l存在于所述组合物中。

55.根据权利要求48-53中任一项所述的组合物,其中所述组合物是粉末。

56.根据权利要求48-55中任一项所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶原包含SEQ ID NO:1-9中的一个的氨基酸序列或与其具有至少90%同一性的氨基酸序列。

57.根据实施方案48-56中任一项所述的组合物,其中所述组合物中胃蛋白酶的量小于10%、5%、1%、0.5%、0.1%或0.05%(重量胃蛋白酶/重量胃蛋白酶原)。

58.根据权利要求48-56中任一项所述的组合物,其中所述组合物中至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%w/w的蛋白质是重组胃蛋白酶原。

59.根据权利要求48-58中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%w/w的蛋白质含量。

60.根据权利要求48-58中任一项所述的组合物,其中所述组合物还包含至少一种成分以产生呈液体、粉末、丸剂、片剂或胶囊形式的配制的重组胃蛋白酶原组合物。

61.根据权利要求60所述的配制的重组胃蛋白酶原组合物,其中所述配制的组合物基本上没有胃蛋白酶。

62.根据权利要求60或权利要求61所述的配制的胃蛋白酶原组合物,其中所述胃蛋白酶原在暴露于动物肠道环境和/或约2的pH时能够活化。

63.根据权利要求48-62中任一项所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶原多肽在酵母、丝状真菌、酵母属物种、细菌、毕赤酵母属物种、木霉属物种或曲霉属物种中产生。

64.根据权利要求63所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶原多肽在毕赤酵母属物种中产生。

65.一种产生稳定胃蛋白酶组合物的方法,其包括:

(a)提供表达重组胃蛋白酶原的微生物;

(b)在所述重组胃蛋白酶原多肽被所述微生物表达并分泌到生长培养基中的条件下培养所述微生物;

(c)收获所述生长培养基并从中去除所述微生物以获得液体起始材料;

(d)将所述液体起始材料的pH降低至小于pH 4.0以获得活化的胃蛋白酶组合物;以及

(e)将所述活化的胃蛋白酶组合物的pH升高至约5.4与7.0之间的pH以获得稳定胃蛋白酶组合物;

其中所述稳定胃蛋白酶组合物在pH 2下具有在约100FCC单位/mg总蛋白质与约19,000FCC单位/mg总蛋白质之间的特异性活性。

66.根据权利要求65所述的方法,其还包括在步骤(d)之后,将活化的胃蛋白酶多肽与所述活化的胃蛋白酶组合物中的其他蛋白质和小分子分离的步骤,和/或在步骤(e)之后,将活化的胃蛋白酶多肽与所述稳定胃蛋白酶组合物中的其他蛋白质和小分子分离的步骤。

67.根据权利要求65或权利要求66所述的方法,其中所述稳定胃蛋白酶组合物包含完整且稳定的蛋白质水解失活形式的重组胃蛋白酶。

68.根据权利要求65-67中任一项所述的方法,其中在pH 2下的所述特异性活性是至少500FCC单位/mg总蛋白质、至少1000FCC单位/mg总蛋白质、至少2000FCC单位/mg总蛋白质、至少5000FCC单位/mg总蛋白质、至少10000FCC单位/mg总蛋白质或至少15000FCC单位/mg总蛋白质且小于20000FCC单位/mg总蛋白质。

69.根据权利要求65-68中任一项所述的方法,其中所述稳定胃蛋白酶组合物的最终pH在约5.4与6.0之间。

70.根据权利要求65-69中任一项所述的方法,其中所述重组胃蛋白酶原在步骤(c)之前以至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20g/l存在于所述生长培养基中。

71.根据权利要求65-70中任一项所述的方法,其中所述生长培养基在步骤(b)之后过滤,所述液体起始材料在步骤(c)之后过滤,所述活化的胃蛋白酶组合物在步骤(d)之后过滤,和/或所述稳定胃蛋白酶组合物在步骤(e)之后过滤。

72.根据权利要求65-71中任一项所述的方法,其中所述稳定胃蛋白酶组合物中的重组胃蛋白酶包含猪、绵羊、中欧马鹿、山羊、母牛、人、牦牛或瘤牛胃蛋白酶的氨基酸序列。

73.一种产生重组胃蛋白酶原的方法,其包括:

(a)提供表达重组胃蛋白酶原的微生物,其中所表达的胃蛋白酶原被所述微生物分泌到生长培养基中;

(b)培养所述微生物,直至所分泌的胃蛋白酶原以至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20g/l的量存在于所述生长培养基中;以及

(c)收获所述生长培养基并且从中去除所述微生物以获得其中所述重组胃蛋白酶原基本上呈蛋白质水解失活形式的液体材料;

其中基本上呈所述蛋白质水解失活形式的所述重组胃蛋白酶原能够通过降低pH或通过暴露于酸性环境而活化以产生稳定胃蛋白酶组合物,其中所述稳定胃蛋白酶组合物在pH 2下具有在约100FCC单位/mg总蛋白质与约19,000FCC单位/mg总蛋白质之间的特异性活性。

74.根据权利要求73所述的方法,其中所述重组胃蛋白酶原包含猪、绵羊、中欧马鹿、山羊、母牛、人、牦牛或瘤牛胃蛋白酶原的氨基酸序列。

75.根据权利要求73或权利要求74所述的方法,其中所述重组胃蛋白酶原包含SEQ ID No.1-9中的一个的氨基酸序列或与其具有至少90%同一性的序列。

76.根据权利要求73-75中任一项所述的方法,其中表达所述重组胃蛋白酶原的所述微生物包含调节所述重组胃蛋白酶原的表达的第一诱导型启动子。

77.根据权利要求76所述的方法,其中所述方法还包括在培养所述微生物的步骤之后或至少部分地与其同时诱导所述重组胃蛋白酶原的表达的步骤。

78.根据权利要求73-77中任一项所述的方法,其中所述微生物选自酵母、丝状真菌、酵母属物种、细菌、毕赤酵母属物种、木霉属物种和曲霉属物种。

79.根据权利要求78所述的方法,其中所述微生物是毕赤酵母属物种。

80.根据权利要求79所述的方法,其中所述微生物还包含辅助因子。

81.根据权利要求80所述的方法,其中所述辅助因子由第二诱导型启动子表达。

82.根据权利要求76-81中任一项所述的方法,其中所述第一诱导型启动子、所述第二诱导型启动子或所述第一诱导型启动子和所述第二诱导型启动子两者通过甲醇诱导。

83.根据权利要求73-82中任一项所述的方法,其还包括所述收获步骤之后的脱盐步骤。

84.根据权利要求73-83中任一项所述的方法,其还包括所述收获步骤之后的干燥步骤。

85.根据权利要求84所述的方法,其中所述干燥步骤包括喷雾干燥或冻干。

86.根据权利要求73-85中任一项所述的方法,其中在pH 2下的所述特异性活性是至少500FCC单位/mg总蛋白质、至少1000FCC单位/mg总蛋白质、至少2000FCC单位/mg总蛋白质、至少5000FCC单位/mg总蛋白质、至少10000FCC单位/mg总蛋白质或至少15000FCC单位/mg总蛋白质且小于20000FCC单位/mg总蛋白质。

87.根据权利要求73-86中任一项所述的方法,其中所述稳定胃蛋白酶组合物包含具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列或与其具有至少90%同一性的序列的重组胃蛋白酶。

88.根据权利要求73-87中任一项所述的方法,其还包括用至少一种成分配制所述重组胃蛋白酶或重组胃蛋白酶原以分别产生呈液体、粉末、丸剂、片剂或胶囊形式的配制的重组胃蛋白酶组合物或重组胃蛋白酶原组合物。

89.根据权利要求88所述的方法,其中所述液体是糖浆或凝胶。

90.一种包含重组胃蛋白酶多肽的组合物,其中所述组合物(a)不含动物来源的蛋白质,(b)所述胃蛋白酶多肽基本上呈完整且稳定的蛋白质水解失活形式,(c)所述组合物具有大于约5.4的pH,并且(d)所述组合物具有在约100FCC单位/mg总蛋白质与约19,000FCC单位/mg总蛋白质之间的特异性活性。

91.根据权利要求90所述的组合物,其中在pH 2下的所述特异性活性是至少500FCC单位/mg总蛋白质、至少1000FCC单位/mg总蛋白质、至少2000FCC单位/mg总蛋白质、至少5000FCC单位/mg总蛋白质、至少10000FCC单位/mg总蛋白质或至少15000FCC单位/mg总蛋白质且小于20000FCC单位/mg总蛋白质。

92.根据权利要求90或权利要求91所述的组合物,其中所述组合物具有在约5.4至约6.0之间的pH。

93.根据权利要求90-92中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%w/w的蛋白质含量。

94.根据权利要求90-93中任一项所述的组合物,其中所述组合物呈粉末化形式。

95.根据权利要求90-93中任一项所述的组合物,其中所述组合物呈液体形式。

96.根据权利要求95所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽的浓度是至少10mg/l、至少100mg/l、至少500mg/l、至少1g/l、至少2g/l、至少5g/l、至少7g/l、至少10g/l、至少15g/l或至少20g/l。

97.根据权利要求90-96中任一项所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽包含猪、绵羊、中欧马鹿、山羊、母牛、人、牦牛或瘤牛胃蛋白酶的氨基酸序列。

98.根据权利要求90-97中任一项所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽包含SEQ ID NO:10或与其具有至少90%同一性的氨基酸序列。

99.根据权利要求90-98中任一项所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽在酵母、丝状真菌、酵母属物种、细菌、毕赤酵母属物种、木霉属物种或曲霉属物种中产生。

100.根据权利要求99所述的组合物,其中所述重组胃蛋白酶多肽在毕赤酵母属物种中产生。

101.根据权利要求95-100中任一项所述的组合物,其中所述液体形式是糖浆或凝胶。

102.根据权利要求90-101中任一项所述的组合物,其中所述组合物中至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%w/w的蛋白质是重组胃蛋白酶。


技术总结
本文提供了具有增强的蛋白质特异性活性的组合物、蛋白质组合和用于制备其的方法。

技术研发人员:哈勒·雷德费恩;哈沙尔·卡什萨格;克里缇卡·马哈德万;亚历山大·查普奥克斯;韦斯利·拉瑟福德-詹金斯;乔伊·安德鲁·克雷普斯;伊沙·乔希;
受保护的技术使用者:克莱拉食品公司;
技术研发日:2020.08.07
技术公布日:2022.05.13
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