技术特征：
1.一种n-内含肽变体，其包含天然断裂内含肽的至少一个氨基酸取代，其中n-内含肽蛋白质变体序列不包括如从初始催化半胱氨酸测量的至少位置36中的天冬酰胺(n)，并且其中与天然n-内含肽蛋白质序列或共有n-内含肽序列相比，所述取代的氨基酸提供增加的碱稳定性。2.权利要求1的n-内含肽变体，其中提供增加的碱稳定性的所述取代的氨基酸是h或q。3. 一种点形念珠藻(nostoc punctiforme) (npu)的野生型n-内含肽结构域的n-内含肽蛋白质变体，其中所述野生型npu n-内含肽结构域包含下述序列：clsyeteiltveygllpigkivekriectvysvdnngniytqpvaqwhdrgeqevfeycledgsliratkdhkfmtvdgqmlpideifereldlmrv (seq id no: 1)，其中所述蛋白质变体包含在seq id no: 1的至少位置36中的天冬酰胺(n)用以下氨基酸进行的氨基酸取代：与野生型n-内含肽结构域和变体或野生型n-内含肽结构域的碱稳定性相比，所述氨基酸增加n-内含肽蛋白质变体的碱稳定性。4.根据权利要求3的n-内含肽蛋白质变体，其中增加碱稳定性的所述氨基酸取代是组氨酸(h)或谷氨酰胺(q)。5.根据权利要求4的n-内含肽蛋白质变体，其中增加碱稳定性的所述氨基酸取代是组氨酸(h)。6. 一种n-内含肽变体序列，其包含：alsydteiltveygflpigxiveexiextvysvdxxgfvytqpiaqwhnrgeqevfeyxledgsiiratxdhxfmttdgxmlpideifexgldlxqv (seq id no: 2)其中，在位置20、35、70、73和95中的x各自独立地选自k、r或a；在位置28中的x是c、a或s；在位置36中的x是n、h或q；在位置25中的x是n或r；在位置59中的x是d或c；在位置80中的x是e或q；和在位置90中的x是q、r或k；并且其中与seq id no: 1相比，所述碱稳定性是增加的。7.根据权利要求6的n-内含肽变体序列，其中在位置20、35、70、73和95中的x是r；在位置28中的x是a；在位置36中的x是h；在位置25中的x是n；在位置59中的x是d；在位置80中的x是e；和在位置90中的x是q。8.根据权利要求6的n-内含肽变体序列，其中在位置20、35、70、73和95中的x是a；在位置28中的x是a；
在位置36中的x是h；在位置25中的x是n；在位置59中的x是d；在位置80中的x是e；和在位置90中的x是q。9.根据权利要求6的n-内含肽变体序列，其中在位置20、35、70、73和95中的x是k；在位置28中的x是c；在位置36中的x是h；在位置25中的x是n；在位置59中的x是d；在位置80中的x是e；和在位置90中的x是q。10.根据权利要求6的n-内含肽变体序列，其中在位置20、35、70、73和95中的x是r；在位置28中的x是a；在位置36中的x是n；在位置25中的x是n；在位置59中的x是d；在位置80中的x是e；和在位置90中的x是q。11.根据权利要求6的n-内含肽变体序列，其中在位置20、35、70、73和95中的x是k；在位置28中的x是a；在位置36中的x是n；在位置25中的x是n；在位置59中的x是d；在位置80中的x是e；和在位置90中的x是q。12.根据上述权利要求中一项或多项的n-内含肽变体序列，其与固相例如膜、纤维、颗粒、珠或芯片偶联。13.根据权利要求12的n-内含肽变体序列，其中所述固相是天然或合成起源的层析树脂。14.根据权利要求12或13的n-内含肽变体序列，其中所述固相是层析树脂，例如天然或合成树脂，优选多糖例如琼脂糖。15.根据权利要求13的n-内含肽变体序列，其中所述固相提供有嵌入的磁性颗粒。16.根据权利要求12的n-内含肽变体序列，其中所述固相是非扩散限制树脂/纤维材料。17.根据权利要求12或13的n-内含肽变体序列，其中所述n-内含肽经由在c末端上的包
含一个或多个lys的lys尾与固相偶联。18.根据权利要求12或13的n-内含肽变体序列，其中所述n-内含肽经由在c末端上的cys尾与固相偶联。19. 根据上述权利要求12-18中一项或多项的n-内含肽变体序列，其中每ml固相，优选层析树脂(ml溶胀凝胶)偶联0.2
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mole/ml n-内含肽。20. 根据上述权利要求1-19中一项或多项的n-内含肽序列，其中所述n-内含肽在对应于0.05m
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0.5m，优选0.1-0.5m naoh的碱性条件下是稳定的。21. 一种c-内含肽变体序列，其包含以下氨基酸序列：vkivsrkslgvqnvydigvekdhnfllangliasn (seq id no: 3)或与其具有至少85%同一性的序列。22.一种载体，其包含根据权利要求21的c-内含肽和编码目的蛋白质(poi)的基因。23.一种用于目的蛋白质(poi)的亲和纯化的断裂内含肽系统，其包含天然n-内含肽的n-内含肽变体序列和c-内含肽，其中与天然n-内含肽相比，所述n-内含肽变体序列具有n36h或n36q突变。24. 根据权利要求23的断裂内含肽系统，其包含权利要求1-20中任一项的n-内含肽序列变体和seq id no: 3的c-内含肽变体序列。25.根据权利要求23或24的断裂内含肽系统，其中所述c-内含肽和附加标签与所述poi共表达。26.根据权利要求23、24或25的断裂内含肽系统，其中将所述n-内含肽固定到固相，并且所述固相在所述poi从所述固相中切割后进行再生。27. 根据权利要求26的断裂内含肽系统，其中所述固相在碱性条件例如0.05-0.5 m naoh下进行再生。28.根据权利要求26或27的断裂内含肽系统，其中所述固相再生多达100个循环，例如多达50个循环。29.一种层析柱，其包含层析树脂，所述层析树脂包含一种或多种n-内含肽变体序列配体，其中所述n-内含肽变体序列如权利要求1-20中一项或多项定义的。30. 一种使用根据权利要求23-29中一项或多项的断裂内含肽系统纯化加上c-内含肽标签的目的蛋白质(poi)的方法，其中将所述n-内含肽固定到固相；所述方法包括在中性ph例如6-8下，以及在二价阳离子的存在下，使c-内含肽和n-内含肽接触；在二价阳离子的存在下，洗涤所述固相；添加螯合剂，以允许c-内含肽和poi之间的自发切割；收集无标签的poi；并且在碱性条件例如0.05-0.5m naoh下，使所述固相再生。31. 一种使用根据权利要求23-29中一项或多项的断裂内含肽系统纯化加上c-内含肽标签的目的蛋白质(poi)的方法，其中将所述n-内含肽固定到固相；所述方法包括在中性ph例如6-8下，优选在高流速下，使c-内含肽和n-内含肽接触；洗涤所述固相；在c-内含肽和poi之间的切割后，收集无标签的poi；并且在碱性条件例如0.05-0.5m naoh下，使所述固相再生。32. 一种用于纯化目的蛋白质(poi)的方法，其包括下述步骤：将poi与根据seq id no 3的c-内含肽和附加标签共表达；使所述附加标签与其在第一固相上的结合配偶体结合；切下poi和c-内含肽；在中性ph下，使所述c-内含肽与附着于第二固相的n-内含肽结合，并且
从所述poi中切下所述结合的c-内含肽和n-内含肽；并且在碱性条件例如0.05-0.5m naoh下，使所述第二固相再生。33.根据权利要求32的方法，其中所述附加标签是亲和标签、离子交换、疏水相互作用、溶解度、多模态。34.根据权利要求30-33中任一项的方法，其中所述碱性条件与离液剂例如胍或尿素组合，并且所述固相可以再生多达100次。35.根据权利要求30-34中一项或多项的方法，其中所述poi是：需要天然或接近天然的n末端序列的蛋白质，例如治疗性蛋白质候选物、生物制品、抗体片段、抗体模拟物、酶、重组蛋白质或肽，例如生长因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗原(病毒、细菌、酵母、哺乳动物)生产、疫苗生产、细胞表面受体、融合蛋白。36.根据权利要求30-35中一项或多项的方法，其中在少于4小时的切割内实现多于30%，优选多于50%，最优选多于80%的poi产率。37. 根据权利要求30-36中任一项或多项的方法，其中将所述n-内含肽固定到层析树脂，并且其中所述静态结合容量为0.2
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mole/ml c-内含肽结合的poi/沉降的ml树脂。38.根据权利要求1-5中一项或多项的n-内含肽变体，其中所有天冬酰胺(n)氨基酸残基都被以下氨基酸残基取代：与天然n-内含肽蛋白质序列相比，所述氨基酸残基提供增加的碱稳定性。39.根据权利要求1-5中一项或多项的n-内含肽变体，其中所有天冬酰胺(n)氨基酸残基都被提供增加的碱稳定性的氨基酸残基取代，并且其中在第一个残基处的半胱氨酸被任何其它氨基酸取代。
技术总结
本发明涉及主要在层析领域的蛋白质纯化。更确切地，本发明涉及使用具有改善的C-内含肽标签和N-内含肽配体的断裂内含肽系统的亲和层析，其中靶蛋白可以作为具有天然N末端的无标签的终产物进行纯化。标签的终产物进行纯化。标签的终产物进行纯化。
技术研发人员：C
受保护的技术使用者：思拓凡生物工艺研发有限公司
技术研发日：2020.11.20
技术公布日：2022/7/1