用于治疗的新的TNFα结构的制作方法

文档编号:14477996
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技术特征:

1.包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或相应序列的蛋白质亚基的不对称TNFα三聚体,其中当通过X射线晶体学测定时所述TNFα三聚体采用的构象为所有亚基的SEQ ID NO:36或相应序列的残基12-18、47-50、54-64、76-82、91-97、117-125、129-137和150-156的Cα原子在参考结构化合物34.pdb的相同原子的RMSD之内,所述TNF-α三聚体能够结合TNFR1,但其中来自所述结合的TNFR1的信号传导被减弱或拮抗,任选地用于在人体或动物体上实施的治疗方法中。

2.权利要求1的TNFα三聚体,用于治疗和/或预防一种或多种以下疾病:自身免疫性和炎症性疾病;神经和神经退行性疾病;疼痛和伤害性疾病;和心血管疾病。

3.权利要求2的TNFα三聚体,用于治疗和/或预防一种或多种以下疾病:类风湿性关节炎,克罗恩氏病,牛皮癣,系统性红斑狼疮,阿尔茨海默氏病,帕金森病和癫痫。

4.通过直接或间接向有需要的患者施用包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或相应序列的蛋白质亚基的不对称TNFα三聚体治疗和/或预防自身免疫性和炎症性疾病、神经和神经退行性疾病、疼痛和伤害性疾病和心血管疾病中的一种或多种的方法,其中当通过X射线晶体学测定时所述TNFα三聚体采用的构象为所有亚基的SEQ ID NO:36或相应序列的残基12-18、47-50、54-64、76-82、91-97、117-125、129-137和150-156的Cα原子在参考结构化合物34.pdb的相同原子的RMSD之内,所述TNF-α三聚体能够结合TNFR1,但其中来自所述结合的TNFR1的信号传导被减弱。

5.权利要求4的方法,其用于治疗和/或预防类风湿性关节炎、克罗恩病、牛皮癣、系统性红斑狼疮、阿尔茨海默病、帕金森病和癫痫中的一种或多种。

6.根据权利要求1-3使用的TNFα三聚体或权利要求1-3的TNFα三聚体或权利要求4或5的方法,其中RMSD在0.85、0.8、0.7、0.65、0.6、0.5或之内。

7.根据权利要求1-6使用的TNFα三聚体或权利要求1-6的TNFα三聚体或方法,其中所述蛋白质亚基包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由其组成,任选地其中所述治疗在人体上进行。

8.根据权利要求1-7使用的TNFα三聚体或权利要求1-7的TNFα三聚体或方法,其中所述构象可通过或通过TNFα三聚体与化合物(1)-(64)中的任何一种形成复合物来获得。

9.包含蛋白质亚基的TNFα三聚体和能够结合所述TNFα三聚体的化合物的复合物,所述蛋白质亚基包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或相应的序列,其中化合物-三聚体复合物结合TNFR1并减弱所述三聚体通过TNFR1诱导的信号传导,其中当通过X射线晶体学测定时所述化合物包含结合在TNFα三聚体内的药效团,使得所述药效团在所有以下残基的之内:亚基A的Leu57;亚基B的Tyr119;亚基B的Gly121;亚基B的Gly122;C亚基的Tyr59;亚基C的Leu120;和亚基C的Tyr151,并且其中所述药效团由2个稠合的5-或6-元环(中心在“R3”和“R2”)、一个环(中心在R2)与H键受体(“A1”),并且其还通过连接非氢原子被取代为另外的5-或6-元环(中心在“R4”)。

10.权利要求9的复合物,其中R2环是5元或6元。

11.权利要求9或10的配合物,其中R3环是5元或6元的。

12.权利要求9-11的复合物,其中R4环是5元或6元的。

13.权利要求9-12的复合物,其中R2环是芳族的。

14.权利要求9-13的复合物,其中R3环是芳族的。

15.权利要求9-14的复合物,其中R4环是芳族的。

16.权利要求9-15的复合物,其中R2环是杂芳族的。

17.权利要求9-16的复合物,其中R3环是杂芳族的。

18.权利要求9-17的复合物,其中R4环是杂芳族的。

19.权利要求9-18的复合物,其中稠合环共有2个原子。

20.权利要求9-19的复合物,其中连接性非氢原子是碳、氮或氧。

21.权利要求9-20的复合物,其中A1特征是通过R2环中的氮或氧原子。

22.权利要求9-21的复合物,其中A1特征与所述TNFα三聚体的亚基C上的Tyr151的侧链氢键结合。

23.权利要求9-22的复合物,其中所述R2、R3和R4环以及A1特征根据下表排列在所述TNFα三聚体结构内:

24.权利要求9-23的复合体,其中所述R1,R2,R3和A1特征之间的一个或多个距离是根据下表中的近似或准确值或在约10%内

25.权利要求9-24的复合物,其中所述R1,R2,R3和A1特征之间的一个或多个角度是根据下表中的近似或准确值或在约10%内

26.权利要求9-25的复合物,其中所述R3-R2-R4角限定涉及所述TNFα三聚体的去对称化的香蕉形状(banana shape)。

27.权利要求9-26的复合物,其中包含药效团的化合物具有20-41个非氢原子。

28.权利要求9-27的复合物,其中所述化合物是化合物(1)-(64)中的任何一种。

29.权利要求9-28的复合物,用于在人体或动物体上实施的治疗方法中。

30.权利要求29的用途的复合物,用于治疗和/或预防以下的一种或多种:自身免疫性和炎症性疾病;神经和神经退行性疾病;疼痛和伤害性疾病;和心血管疾病。

31.权利要求30的用途的复合物,其用于治疗和/或预防类风湿性关节炎,克罗恩氏病,牛皮癣,系统性红斑狼疮,阿尔茨海默氏病,帕金森病和癫痫中的一种或多种。

32.一种治疗和/或预防预防类风湿性关节炎,克罗恩氏病,牛皮癣,系统性红斑狼疮,阿尔茨海默氏病,帕金森病和癫痫中的一种或多种的方法,其通过直接或间接向有需要的患者施用权利要求9-28的复合物来进行。

33.权利要求32的方法,其用于治疗和/或预防类风湿性关节炎,克罗恩氏病,牛皮癣,系统性红斑狼疮,阿尔茨海默氏病,帕金森病和癫痫中的一种或多种。

34.权利要求29-33的用途或方法的复合物,其中所述治疗在人体上。

35.权利要求9-34的复合物、复合物的使用或方法,其中所述蛋白质亚基包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由其组成。

36.权利要求9-35的复合物,使用复合物或方法,其中所述复合物中的TNFα三聚体是用于在权利要求1-8的方法中使用的TNFα三聚体。

37.权利要求9-36的复合物、复合物的使用或方法,其中所述化合物拮抗TNFα三聚体通过TNFR1受体诱导的信号传导。

38.权利要求9-37的复合物、复合物的使用或方法,其中所述化合物与不存在所述化合物时所述TNFα三聚体的稳定性相比增加所述TNFα三聚体的稳定性。

39.权利要求38的复合物、复合物的使用或方法,其中稳定性的增加导致TNFα三聚体的热转变中点(Tm)升高至少1℃,至少10℃,或者10℃至20℃。

40.权利要求9-39的复合物、复合物的使用或方法,其中所述化合物与不存在所述化合物的情况下所述TNFα三聚体对所述TNFR1受体的结合亲和力相比,增加所述TNFα三聚体对所述TNFR1受体的结合亲和力。

41.权利要求40的复合物、复合物的使用或方法,其中所述化合物通过相较于在不存在所述化合物的情况下TNFα三聚体与TNFR1受体结合的缔合速率(kon-r)和解离速率(koff-r)值增加缔合速率(kon-r)和/或降低解离速率(koff-r)来增加所述TNFα三聚体与TNFR1受体的结合亲和力。

42.权利要求41的复合物、复合物的使用或方法,其中所述测试化合物通过相较于在不存在所述化合物的情况下TNFα三聚体与TNFR1受体结合的缔合速率(kon-r)值增加缔合速率(kon-r)来增加所述TNFα三聚体与TNFR1受体的结合亲和力。

43.权利要求40至42的复合物、复合物的使用或方法,其中与不存在所述化合物的情况下TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r相比,所述测试化合物降低所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r,其中:

a)与不存在所述化合物的情况下所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r相比,所述化合物降低所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r至少10倍;

b)在所述化合物的存在下TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r值小于10nM。

44.权利要求40至42的复合物、复合物的使用或方法,其中与不存在所述化合物的情况下TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r相比,所述测试化合物降低所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r,其中:

a)与不存在所述化合物的情况下所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r相比,所述化合物降低所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r至少4倍;

b)在所述化合物的存在下TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r值小于600pM。

45.权利要求44的复合物、复合物的使用或方法,其中在所述化合物存在下所述TNFα三聚体对所述TNFR1受体的KD-r值小于200pM。

46.权利要求9-45的复合物,使用复合物或方法,其中所述化合物具有500nM或更低的IC50值。

47.权利要求9-46的复合物、复合物的使用或方法,其中所述复合物以1nM或更低的KD-ab结合以下抗体中的任一种:

具有序列SEQ ID NO:26的轻链和序列SEQ ID NO:27的重链的CA185_1979;或

具有序列SEQ ID NO:11的轻链和序列SEQ ID NO:12的重链的CA185_1974。

48.药物组合物,其包含权利要求9-31、34-47中任一项的复合物或复合物和药学上可接受的载体。

49.权利要求1-8的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中TNFα三聚体拮抗TNFR1受体的信号传导。

50.权利要求1-8、49的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中所述TNFα三聚体与对称TNFα三聚体的稳定性相比具有增加的稳定性。

51.权利要求50的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中稳定性增加导致TNFα三聚体的热转变中点(Tm)升高至少1℃,至少10℃,或10℃至20℃。

52.权利要求1-8、49-51的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中与对称TNFα三聚体与TNFR1的结合亲和力相比,TNFα三聚体对TNFR1受体的结合亲和力增加。

53.权利要求52的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中所述化合物通过相较于在不存在所述化合物的情况下TNFα三聚体与TNFR1受体结合的缔合速率(kon-r)和解离速率(koff-r)值增加缔合速率(kon-r)和/或降低解离速率(koff-r)来增加所述TNFα三聚体与TNFR1受体的结合亲和力。

54.权利要求52的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中所述测试化合物通过相较于在不存在所述化合物的情况下TNFα三聚体与TNFR1受体结合的缔合速率(kon-r)值增加缔合速率(kon-r)来增加所述TNFα三聚体与TNFR1受体的结合亲和力。

55.权利要求52至54的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中与不存在所述化合物的情况下TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r相比,所述测试化合物降低所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r,其中:

a)与不存在所述化合物的情况下所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r相比,所述化合物降低所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r至少10倍;

b)在所述化合物的存在下TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r值小于10nM。

56.权利要求52-54的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中与不存在所述化合物的情况下TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r相比,所述测试化合物降低所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r,其中:

a)与不存在所述化合物的情况下所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r相比,所述化合物降低所述TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r至少4倍;

b)在所述化合物的存在下TNFα三聚体对TNFR1受体的KD-r值小于600pM。

57.权利要求56的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中TNFα三聚体与TNFR1受体的KD-r值小于200pM。

58.权利要求1-8、49-57的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,其中所述复合物以1nM或更低的KD-ab结合以下抗体中的任一种:

具有序列SEQ ID NO:26的轻链和序列SEQ ID NO:27的重链的CA185_1979;或

具有序列SEQ ID NO:11的轻链和序列SEQ ID NO:12的重链的CA185_1974。

59.权利要求1-8的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,权利要求1-58的复合物、复合物的使用和方法,其中TNFα三聚体是可溶性TNFα、膜结合TNFα或可溶性TNFα和膜结合TNFα。

60.权利要求1-8的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或方法,权利要求1-58的复合物、复合物的使用和方法,其中所述TNFα三聚体包含SEQ ID NO:36的蛋白质序列或由其组成。

61.权利要求1-3、6-8的TNFα三聚体的使用或TNFα三聚体或权利要求9-31、34-60的复合物或复合物的使用用于在人体上实施的治疗方法或动物体,其中所述用途不诱导或导致恶化感染和/或恶性肿瘤。

62.权利要求61的TNFα三聚体的使用或复合物的使用,其中所述感染是TB和/或细菌败血症和/或真菌感染。

63.权利要求61或62的TNFα三聚体的使用或复合物的使用,其中所述恶性肿瘤是淋巴瘤。

64.权利要求4-8、32-60的方法,权利要求1-60的复合物、复合物的使用或方法,其中所述施用有需要的患者不诱导或导致所述患者中的恶化感染和/或恶性肿瘤。

65.权利要求64的方法,其中所述感染是TB和/或细菌败血症和/或真菌感染。

66.权利要求64或65的方法,其中所述恶性肿瘤是淋巴瘤。

67.具有空间群P 21 21 21,P 21 21 2或P 1 21 1的TNFα三聚体晶体。

68.权利要求67的TNFα三聚体晶体,其包含含有SEQ ID NO:35或36的氨基酸残基的多肽。

69.权利要求67或68的TNFα三聚体晶体,其特征在于,所述晶体的晶胞尺寸为α=90度,β=90度,γ=90度或α=90度,β=99.1度,γ=90度。

70.权利要求67-69的TNFα三聚体晶体,其进一步包含化合物(1)-(64)中的任一种。

71.一种包括可执行代码的计算机,其用于“

a)使用化合物1.pdb至化合物64.pdb中的任一种的TNFα三聚体的结构坐标作为不对称TNFα三聚体的三维模型;

b)在三维模型中分析三聚体中心的结合口袋;和

c)在计算机文库中筛选适合所述结合位点的小分子。

72.鉴定apo TNFα三聚体的潜在抑制剂的方法,包括以下步骤:

a)使用化合物1.pdb至化合物64.pdb中的任何一种的TNFα三聚体的结构坐标来产生不对称TNFα三聚体的三维模型;

b)在三维模型中鉴定三聚体中心的结合口袋的残基;

c)使用结合位点残基产生特定的3-D靶标;

d)使用特定的3-D靶设计或选择潜在的TNFα三聚体抑制剂;

e)获得潜在的抑制剂;和

f)体外使潜在抑制剂与apo TNFα三聚体接触,以确定所述潜在抑制剂与所述apo TNFα三聚体相互作用的能力,

由此相互作用的能力指示所述apo TNFα三聚体的所述潜在抑制剂被确定。

73.一种设计结合apo TNFα三聚体的化合物的方法,包括以下步骤:

a)使用化合物1.pdb至化合物64.pdb中的任一种的TNFα三聚体的原子坐标来建立TNFα三聚体中心处的结合口袋的三维计算机模型;

b)评估化合物和结合口袋之间的立体化学互补性;

c)通过观察影响蛋白质/化合物缔合的蛋白质或化合物的变化,以迭代方法优化立体化学互补性;和

d)设计优化所述蛋白质/化合物立体化学互补性的化合物。

74.鉴定与apo TNFα三聚体中心处的结合口袋相互作用的候选抑制剂的方法,包括以下步骤:

a)获得权利要求67-70中任一项的晶体;

b)获得步骤a)的晶体的氨基酸的结构坐标;

c)使用步骤b)中产生的氨基酸的结构坐标产生TNFα三聚体的3D模型,

d)确定来自3-D模型的TNFα三聚体中心处的结合口袋;

e)进行计算机拟合分析以设计或鉴定与结合口袋相互作用的候选抑制剂;和

f)体外设计或鉴定的候选抑制剂与apo TNFα三聚体接触以确定抑制剂对TNFα活性的作用。

75.鉴定结合apo TNFα三聚体的化合物的方法,包括以下步骤:

a)使用权利要求67-70任一项的晶体获得TNFα三聚体的3-D分子模型;

b)在合理的药物设计方法中使用a)的模型来鉴定可结合于TNFα三聚体中心的候选化合物;和

c)在步骤b)中鉴定的结合候选化合物存在下测定TNFα活性,从而鉴定结合apo TNFα三聚体的化合物。

76.权利要求67-70的晶体或化合物1.pdb至化合物64.pdb中任何化合物的结构坐标在鉴定apo TNFα三聚体抑制剂中的用途。

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