一种利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及肿瘤学和医学检验领域，具体涉及一种利用tcpp联合cep探针从人的离体样本中检测鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及应用。

背景技术：

随着医疗技术的不断发展，越来越多的恶性肿瘤得以有效控制甚至治愈。但仍有很大一部分肿瘤患者愈后较差，这对恶性肿瘤的早期诊断、预后监测提出了更高的要求。由于起病隐匿、早期无明显症状、容易复发及转移等因素，近年来，循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctcs)检测作为一种新型肿瘤诊断及监测手段而受到越来越多的关注。循环肿瘤细胞目前已被证实其计数的动态变化与多种实体肿瘤的疗效、复发、转移等具有一定相关性。循环肿瘤细胞是指从肿瘤原发灶、转移灶或其他不明部位自发脱落或因诊疗操作脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环的肿瘤细胞的统称。少数循环肿瘤细胞能逃避机体的免疫杀伤，随血流播散至远端器官后形成转移灶。因此，循环肿瘤细胞的出现被认为是恶性肿瘤血行转移的重要始发事件。外周血循环肿瘤细胞仅占外周血白细胞的1/10⁷～1/10⁶，且入血呈现不连续性并具有很强的异质性，因此循环肿瘤细胞的检测技术一直是研究的重点和难点。

循环肿瘤细胞的检测主要包括循环肿瘤细胞富集技术和鉴定技术。基于循环肿瘤细胞密度、大小、电荷和可变形性等物理特性诞生了各类富集方法。目前应用最广泛的循环肿瘤细胞富集方法是基于细胞表面标志富集法，其中获得fda(foodanddrugadministration，美国食品和药品管理局)认证的cellsearch检测系统在很多与癌症相关的临床研究中被作为金标准，该系统使用包被上皮细胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule，epcam)抗体的免疫磁珠对7.5ml外周血中的循环肿瘤细胞进行富集和计数。富集分离后的循环肿瘤细胞需进一步鉴定，目前采用rt-pcr、免疫荧光标记、rna原位杂交、染色体核型鉴定等多种技术可对循环肿瘤细胞进行细胞形态学、免疫学、分子学等的检测鉴定，从而实现对外周血循环肿瘤细胞的定性及定量分析。cellsearch法使用表皮细胞特异性蛋白作为肿瘤标志物，同时利用免疫磁珠的方法将循环肿瘤细胞富集并最后进行免疫荧光显微观察检测的一种半自动的循环肿瘤细胞计数方法。这种方法存在检测阳性符合率较低的问题。同时由于其系统较为昂贵、单个检测样本成本较高、耗时较长，应用较为困难。

中国专利申请号2018111914921，专利名称为一种循环肿瘤细胞的检测方法的申请案公开了一种利用apoptin蛋白在正常细胞和肿瘤细胞的定位特点，结合荧光物质的可视性，将apoptin基因和荧光蛋白基因融合在起，表达出带有荧光的apoptin蛋白，并根据apoptin蛋白在肿瘤细胞和正常细胞核内的定位特点，应用到循环肿瘤细胞的检测的方法，并成功检测到循环肿瘤细胞。但该方法在应用于检测循环肿瘤细胞染色体多倍体，遇到基因断裂或基因融合等情况时，由于捕获的循环肿瘤细胞中存在大量的血细胞背景，寻找目标循环肿瘤细胞极为困难。

中国专利申请号2016110225481，专利名称为一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒的申请案公开了一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，组成包括：细胞密度梯度分离液、多孔隔膜分离管、5ml容积的离心管、表皮类肿瘤标志物抗体和间质类肿瘤标志物抗体。其利用密度梯度离心法去除了血液中绝大多数的红细胞及白细胞背景干扰，同时对血液中的循环肿瘤细胞进行富集。之后使用以表皮类和间质类两大类共4种肿瘤标志物的荧光抗体对循环肿瘤细胞进行荧光标记，最后在通用的流式细胞仪中完成对循环肿瘤细胞检出并计数，该试剂盒考虑到了肿瘤细胞的表皮间质转换过程，增加了捕获间质类的循环肿瘤细胞，增加了检测阳性符合率，但其检测的原理依然是依赖于抗原的表达，虽将肿瘤标志物增加至两大类共4种，依然无法防止漏筛。

如上所述，漏筛的原因在于，上皮源性肿瘤循环肿瘤细胞的形成、迁移和侵袭与上皮-间质转化(epithelialmesenchymaltransition，emt)密切相关。由于肿瘤细胞在释放入血中emt过程的存在，一些肿瘤抗原的表达会丢失，会引起依赖于肿瘤抗原表达的检测方法产生假阴性，造成肿瘤细胞漏筛。这是目前检测方法普遍存在的问题。另一方面，由于肿瘤细胞具有异质性，不同来源的肿瘤细胞会表达不同的抗原，导致目前没有一种统一的肿瘤标示物来鉴别肿瘤细胞。

技术实现要素：

1.发明要解决的技术问题

针对现有循环肿瘤细胞检测方法中免疫荧光标记法和原位杂交法中存在检测阳性符合率较低和漏筛的问题。同时由于现有系统较为昂贵、单个检测样本成本较高、耗时较长，应用较为困难。本方案提供了一种利用tcpp染色检测鉴定循环肿瘤细胞的方法，可以不依赖于肿瘤细胞表面的抗原表达，避免由于肿瘤细胞的emt过程中抗原丢失，而引起的假阴性问题，提高了检测的准确性，利用tcpp化合物进行检测筛查，成本相较目前常用的瘤标抗体，费用降低，节省了成本。

2.技术方案

为达到上述目的，提供的技术方案为：

本发明的一种利用tcpp联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：包含tcpp储备液、微酸性缓冲液、细胞清洗液、细胞固定液、组织固定液、cep探针溶液、细胞破膜液、dapi染色液和pbs溶液。

进一步地，所述tcpp储备液以异丙醇溶液为溶剂。

进一步地，所述微酸性缓冲液包括ph值为5.8-6.5的mes缓冲液。

进一步地，所述细胞清洗液包括pbs溶液和tween20所组成的pbst溶液。

进一步地，所述细胞固定液包括多聚甲醛细胞固定液。

进一步地，所述组织固定液是由含体积分数50％乙醇的pbs溶液和聚乙二醇溶液混合制得。

进一步地，所述细胞破膜液为含有质量分数0.5％tritonx-100的pbs溶液。

利用tcpp联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒在制备用于鉴定循环肿瘤细胞产品中的应用，所述应用用于非疾病诊断和治疗目的。

进一步地，采用固相染色法，具体包括如下步骤：

(1)采用所述的tcpp储备液配制tcpp工作液，tcpp工作液浓度为1-200μg/ml，优选为20-200μg/ml，40μg/ml为最优选；

(2)富集循环肿瘤细胞：采集样本，预处理后用细胞清洗液清洗，得细胞溶液；

(3)原位杂交：向所述细胞溶液中加入组织固定液得到混合液，将混合液涂布于载玻片上，干片，将pbs溶液和细胞固定液混匀后，滴加至载玻片上，避光孵育，pbs溶液清洗，干片，滴加cep探针溶液，封片，杂交孵育，结束后解封，取下盖玻片，浸入pbs溶液；

(4)tcpp暴露：向步骤(3)处理后的载玻片上滴加细胞破膜液，避光孵育，pbs溶液冲洗后将载玻片浸入25-42℃预热的所述tcpp工作液中，避光孵育，用微酸性缓冲液冲洗载玻片，干片，滴加dapi染色液，封片；

(5)阅片：封片后一定时间内荧光显微镜扫描成像；

(6)结果判定：a.蓝光通道下，被dapi染色液染色的细胞呈蓝色，以此判断正常细胞和循环肿瘤细胞总数目；b.在绿光通道下，被tcpp染色的细胞呈绿色，以此判断循环肿瘤细胞总数目；c.橙光通道下，根据橙光通道下橙光数目判断肿瘤细胞的染色体核型。

进一步地，采用液相染色法，具体地包括如下步骤：

(1)采用所述的tcpp储备液配制tcpp工作液，tcpp工作液浓度为1-200μg/ml，优选为20-200μg/ml，40μg/ml为最优选；

(2)富集循环肿瘤细胞：采集样本，预处理后用细胞清洗液清洗，得细胞溶液；

(3)tcpp暴露：体积分数95％无水乙醇和体积分数5％的微酸性缓冲液混合，加入所述细胞溶液中，离心，弃上清至0.2ml，加入tcpp工作液，25-42℃暗处孵育，离心，弃上清至0.2ml，混匀，加入微酸性缓冲液补足，离心，弃上清至100μl，加入100μl组织固定液，混匀，涂布于载玻片上，干片；

(4)原位杂交：将pbs溶液和细胞固定液混匀后，滴加至载玻片上，避光孵育，pbs溶液清洗，干片，滴加cep探针溶液，封片，杂交孵育，结束后解封，取下盖玻片，浸入pbs溶液，干片，滴加dapi染色液，封片；

(5)阅片：封片后一定时间内，荧光显微镜扫描成像；

(6)结果判定：a.蓝光通道下，被dapi染色液染色的细胞呈蓝色，以此判断正常细胞和循环肿瘤细胞总数目；b.在绿光通道下，被tcpp染色的细胞呈绿色，以此判断循环肿瘤细胞总数目；c.橙光通道下，根据橙光通道下橙光数目判断肿瘤细胞的染色体核型。

3.有益效果

采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明的一种利用tcpp联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，利用细胞发生癌变后其对低密度脂蛋白的摄取增加的特点，同时利用四(4-羧基苯基)卟啉(tcpp)可以产生特征性荧光以及结合低密度脂蛋白的特性，将四(4-羧基苯基)卟啉(tcpp)与cep荧光原位杂交组合来鉴定循环肿瘤细胞，在不依赖于肿瘤细胞表面的抗原表达做为检测手段的情况下，可以达到以下效果：1)避免由于肿瘤细胞在emt过程中由于抗原丢失而造成某些现有依赖于抗原的检测手段检测出现假阴性，提高了检测的准确性，同时也克服了免疫荧光检测和原位杂交检测联合使用时存在相互干扰、检测耗时较长的问题，提高了准确性，本法杂交孵育在2h内即可完成，减少了检测时间，检测结果观察直观。2)由于不依赖循环肿瘤细胞抗原的表达，因而可以鉴定多种上皮肿瘤，避免了不同种类肿瘤细胞的异质性而没有统一的瘤标来鉴定循环肿瘤细胞的缺陷。鉴定的技术手段思路不同于市面上目前的增加肿瘤标志物的方法，成本相较目前常用的瘤标抗体类检测方案，费用降低，节省了时间成本。

(2)本发明的一种利用tcpp联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，不依赖于某些循环肿瘤细胞的倍体进行检测，既可以鉴定二倍体肿瘤细胞，又可以鉴定异倍体肿瘤细胞，弥补了目前原位杂交和染色体核型鉴定技术中只能鉴定异倍体肿瘤细胞的缺陷，提高了检测的准确性。不依赖于染色体的倍数是指，细胞变异之后，细胞脂膜结构发生变化，导致细胞更易于摄取和富集低密度脂蛋白，从而使低密度脂蛋白在肿瘤细胞内的浓度大大增高，而低密度脂蛋白又易于结合卟吩类化合物。在荧光显微镜下观察，在对应颜色通道下，会发现循环肿瘤细胞相对于正常细胞呈现出更亮的易于区分的荧光特性。同时，这里又结合了染色体的异倍体来辅助判断，染色体的异倍体形态是肿瘤细胞的特征之一，提高了循环肿瘤细胞识别的准确性，防止出现假阳性。

(3)本方案细胞清洗液采用pbst，而非pbs。由于血液中也有血浆蛋白，其也可能会与tcpp结合，影响到背景色。使用pbst一方面是防止这些非特异性结合，减少背景色。另一方面由于吐温20是细胞表面活性剂，相当于增加了细胞表面通道，增加循环肿瘤细胞对tcpp摄取的速率和浓度。即此处使用pbst既可以增加细胞表面活性，又能有效降低tcpp染色后的背景色，结合扫描成像等技术手段使得寻找目标循环肿瘤细胞变得简单易操作。

附图说明

图1是荧光显微镜下健康人外周血中混有h460肺癌细胞的扫描成像图；图1中，a为蓝光通道下，被dapi染色液染色的细胞呈蓝色，以此判断正常细胞和循环肿瘤细胞总数目；图b为在绿光通道下，被tcpp染色的细胞呈绿色，以此判断循环肿瘤细胞总数目；图c为橙光通道下，根据橙光通道下橙光数目判断肿瘤细胞的染色体核型；图d表示a、b和c的融合图。

图2是荧光显微镜下健康人外周血的扫描成像合成图。

图3是荧光显微镜下健康人外周血中混有h460肺癌细胞的扫描成像图；图3中，a为蓝光通道下，被dapi染色液染色的细胞呈蓝色，以此判断正常细胞和循环肿瘤细胞总数目；图b为在绿光通道下，被tcpp染色的细胞呈绿色，以此判断循环肿瘤细胞总数目；图c为橙光通道下，根据橙光通道下橙光数目判断肿瘤细胞的染色体核型；图d表示a、b和c的融合图。

图4是液相染色法下荧光显微镜下健康人外周血中混有h460肺癌细胞的扫描成像图。图4中，a为蓝光通道下，被dapi染色液染色的细胞呈蓝色，以此判断正常细胞和循环肿瘤细胞总数目；图b为在绿光通道下，被tcpp染色的细胞呈绿色，以此判断循环肿瘤细胞总数目；图c为橙光通道下，根据橙光通道下橙光数目判断肿瘤细胞的染色体核型；图d表示a、b和c的融合图。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合附图和实施例对本发明作详细描述。

实施方式中包括以下组分：

ficoll购自天津灏洋公司；

cd45单抗免疫磁珠购自thermoscientific公司；

cep8探针为spectrumorange橙光标记的dna探针，购自雅培公司；

dapi染色液购自thermoscientific公司。

实施例1

本实施例提供了一种利用tcpp联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，组分包括：tcpp储备液(浓度为1mg/ml)、100mmph值为6.1mes缓冲液、细胞清洗液(pbst)、质量分数5％的多聚甲醛细胞固定液、组织固定液(含体积分数50％乙醇的pbs溶液，其中含有质量分数1％的聚乙二醇)、cep8探针溶液、细胞破膜液(含体积分数0.5％tritonx-100的pbs溶液)、dapi染色液、pbs溶液。

一、富集循环肿瘤细胞ctcs

1、采集外周血6ml于acd采血管中。向其中加入10μl的h460肺癌细胞培养悬液。样本来源是外周血，但不局限于外周血，也包括胸腹水或脑脊液等。

2、样本以400g转速离心15min，弃上清。用pbst细胞清洗液补足6ml，并上下颠倒数次，混匀。其中pbst细胞清洗液由pbs缓冲液及体积分数0.02％的tween20构成。

3、将血样缓缓叠加至3ml的淋巴细胞分离液ficoll上，保证液面分层清晰。以350g转速离心6min。

4、离心后分成三层，上层为淡黄色血浆层，中间层为白膜层(ctcs和白细胞主要在这一层)，下层为红细胞层。吸取上层和中间层于心的50ml离心管中，下层丢弃。切忌勿吸到红细胞层。

5、向吸取的液体中缓慢滴加300μl表面偶联有cd45抗体的免疫磁珠，然后置于摇床，以30°-45°角度倾斜，120转/分的速度摇20min。

6、将上述离心管置于磁力架上2min，然后从离心管中心吸取所有液体于另一新的50ml离心管中，结合免疫磁珠的白细胞被去除。

7、向上述离心管中补加pbst细胞清洗液，补足45ml，500g离心5min。

8、弃上清。向上述离心管中补加pbst细胞清洗液，补足45ml，400g离心5min。

9、弃上清，至管底留约50μl液体。向其中加入2μl的荧光增强液。涡旋震荡仪轻微震荡以悬浮细胞，室温避光孵育10min。荧光增强液为含0.1mg/mlsds的pbs溶液，其中含有质量分数1％的聚乙二醇。

10、向上述溶液中再加入150-200μl细胞通透液，室温避光孵育20min。

细胞通透液由含有体积分数0.2％的tritonx-100的pbs构成。

11、收集所有的溶液于新的15ml离心管中，补足14ml，以500g/min转速离心5min。

12、吸弃上清液至留100μl，加入100μl组织固定液，轻微吹打混匀，将之均匀涂布于格式化载玻片上，并置于30-33℃的恒温干燥箱中过夜干片。组织固定液包括含体积分数50％乙醇的pbs溶液，其中含有质量分数1％的聚乙二醇。

二、ctcs荧光原位杂交

1、将180μlpbs缓冲液于37℃预热30min，向其中加入20μl质量分数5％的多聚甲醛细胞固定液，混匀后，均匀滴加至上述玻片上，覆盖所有细胞干迹，避光孵育10min。

2、吸弃所有液体，滴加200μlpbs缓冲液清洗玻片2次，每次2min。

3、吸弃所有液体后，将玻片浸入无水乙醇中2min。

4、吹风机凉风吹干玻片，滴加10μlcep8探针，盖上盖玻片，并用封片胶封闭。于原位杂交仪杂交，条件为：76℃，10min；37℃，3h。

5、杂交结束后，撕下封片胶，浸入50mlpbs缓冲液中1min，轻轻取下盖玻片，在浸入pbs缓冲液中，5min，清洗未杂交上的探针。

三、tcpp储备液配置

1、用去离子水配制110ml50％的异丙醇。

2、取上述溶液90ml，加入400mgnahco3。

3、加入100mgtcpp，搅拌溶解3-5min。

4、再用体积分数50％异丙醇定容到100ml。tcpp浓度为1mg/ml。

5、保存于棕色瓶中，用锡箔纸包裹，冷藏保存。

四、tcpp工作液配置

1、先称取5.33gmes粉末，去离子水定容到250ml，使其终浓度为100mm，再用1m的naoh溶液调节ph值为5.8-6.5。mes缓冲液ph6.1最佳。tcpp工作液配置需用微酸性缓冲液配制，除mes缓冲液外，其他微酸性缓冲液亦可。

2、取2mltcpp母液，加入容量瓶，再加入48ml的上述mes缓冲液，使tcpp终浓度为40μg/ml。

3、棕色瓶避光且冷藏存放，现用现配。

五、tcpp暴露过程

1、取前述杂交后的玻片向细胞区域加200μl细胞破膜液，避光孵育10min。然后用pbs冲洗玻片2次，每次5min。所述破膜液为含有体积分数0.5％tritonx-100的pbs溶液。

2、将玻片浸入50ml的25-42℃预热的tcpp工作溶液中30min，避光孵育。优选预热温度为36℃。tcpp暴露时间为2min-2h，30min为优选。

3、室温下，用mes缓冲液洗玻片3次，每次1min。

4、吹风机冷风吹干玻片，滴加10μldapi染色液，盖玻片封片。

5、封片后1-24h内，使用荧光显微镜观察玻片，并计数ctcs细胞。

ctcs的判断方法为：荧光显微镜下，dapi染色在蓝光通道下细胞蓝色、tcpp染色在绿光通道下细胞呈绿色。在橙光通道下，可以根据橙光数目判断8号染色体核型。其中显微镜滤光块参数建议为：蓝光：365±50nm、绿光485±20nm、橙光546±10nm。扫描成像使用的是荧光显微镜，但不局限于荧光显微镜，还包括流式细胞仪。

六、结果

图1中，a.蓝光通道下，被dapi染色液染色的细胞呈蓝色，以此判断正常细胞和循环肿瘤细胞总数目；b.在绿光通道下，被tcpp染色的细胞呈绿色，以此判断循环肿瘤细胞总数目；c.橙光通道下，根据橙光通道下橙光数目判断肿瘤细胞的染色体核型；d表示a、b和c的融合图。

由图1可知，肿瘤细胞在a和b中均出现。正常细胞出现在a中，而未出现在b中。

实施例2

本实施例提供了一种利用tcpp联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，组分包括：tcpp储备液(浓度为1mg/ml)、100mmph值为6.1mes缓冲液、细胞清洗液(pbst)、质量分数5％的多聚甲醛细胞固定液、组织固定液(含体积分数50％乙醇的pbs溶液，其中含有质量分数1％的聚乙二醇)、cep8探针溶液、细胞破膜液(含体积分数0.5％tritonx-100的pbs溶液)、dapi染色液、pbs溶液。

检测健康人外周血。

一、富集循环肿瘤细胞ctcs

1、采集健康人外周血6ml于acd采血管中。

2、样本以400g转速离心15min，弃上清。用pbst细胞清洗液补足6ml，并上下颠倒数次，混匀。其中pbst细胞清洗液由pbs缓冲液及体积分数0.02％的tween20构成。

3、将血样缓缓叠加至3ml的淋巴细胞分离液ficoll上，保证液面分层清晰。以350g转速离心6min。

4、离心后分成三层，上层为淡黄色血浆层，中间层为白膜层(ctcs和白细胞主要在这一层)，下层为红细胞层。吸取上层和中间层于心的50ml离心管中，下层丢弃。切忌勿吸到红细胞层。

5、向吸取的液体中缓慢滴加300μl表面偶联有cd45抗体的免疫磁珠，然后置于摇床，以30°-45°角度倾斜，120转/分的速度摇20min。

6、将上述离心管置于磁力架上2min，然后从离心管中心吸取所有液体于另一新的50ml离心管中，结合免疫磁珠的白细胞被去除。

7、向上述离心管中补加pbst细胞清洗液，补足45ml，500g离心5min。

8、弃上清。向上述离心管中补加pbst细胞清洗液，补足45ml，400g离心5min。

9、弃上清，至管底留约50μl液体。向其中加入2μl的荧光增强液。涡旋震荡仪轻微震荡以悬浮细胞，室温避光孵育10min。荧光增强液为含0.1mg/mlsds的pbs溶液，其中含有质量分数1％的聚乙二醇。

10、向上述溶液中再加入150-200μl细胞通透液，室温避光孵育20min。

细胞通透液由含有体积分数0.2％tritonx-100的pbs构成。

11、收集所有的溶液于新的15ml离心管中，补足14ml，以500g/min转速离心5min。

12、吸弃上清液至留100μl，加入100μl组织固定液，轻微吹打混匀，将之均匀涂布于格式化载玻片上，并置于30-33℃的恒温干燥箱中过夜干片。组织固定液包括含体积分数50％乙醇的pbs溶液，其中含有质量分数1％的聚乙二醇。

二、ctcs荧光原位杂交

1、将180μlpbs缓冲液于37℃预热30min，向其中加入20μl质量分数5％的多聚甲醛细胞固定液，混匀后，均匀滴加至上述玻片上，覆盖所有细胞干迹，避光孵育10min。

2、吸弃所有液体，滴加200μlpbs缓冲液清洗玻片2次，每次2min。

3、吸弃所有液体后，将玻片浸入无水乙醇中2min。

4、吹风机凉风吹干玻片，滴加10μlcep8探针，盖上盖玻片，并用封片胶封闭。于原位杂交仪杂交，条件为：76℃，10min；37℃，3h。

5、杂交结束后，撕下封片胶，浸入50mlpbs缓冲液中1min，轻轻取下盖玻片，在浸入pbs缓冲液中，5min，清洗未杂交上的探针。

三、tcpp储备液配置

1、用去离子水配制110ml体积分数50％的异丙醇。

2、取上述溶液90ml，加入400mgnahco3。

3、加入100mgtcpp，搅拌溶解3-5min。

4、再用体积分数50％异丙醇定容到100ml。tcpp浓度为1mg/ml。

5、保存于棕色瓶中，用锡箔纸包裹，冷藏保存。

四、tcpp工作液配置

1、先称取5.33gmes粉末，去离子水定容到250ml，使其终浓度为100mm,再用1m的naoh溶液调节ph值为5.8-6.5。mes缓冲液ph6.1最佳。

2、取2mltcpp母液，加入容量瓶，再加入48ml的上述mes缓冲液，使tcpp终浓度为40μg/ml。

3、棕色瓶避光且冷藏存放，现用现配。

五、tcpp暴露过程

1、取前述杂交后的玻片向细胞区域加200μl细胞破膜液，避光孵育10min。然后用pbs冲洗玻片2次，每次5min。所述破膜液为含有体积分数0.5％tritonx-100的pbs溶液。

2、将玻片浸入50ml的25-42℃预热的tcpp工作溶液中30min，避光孵育。优选预热温度为36℃。

3、室温下，用mes缓冲液洗玻片3次，每次1min。

4、吹风机冷风吹干玻片，滴加10μldapi染色液，盖玻片封片。

5、封片后1-24h内，使用荧光显微镜观察玻片，并计数ctcs细胞。

ctcs的判断方法为：荧光显微镜下，dapi染色在蓝光通道下细胞蓝色、tcpp染色在绿光通道下细胞呈绿色。在橙光通道下，可以根据橙光数目判断8号染色体核型。其中显微镜滤光块参数建议为：蓝光：365±50nm、绿光485±20nm、橙光546±10nm。

六、结果

由图2可知，正常细胞在各光通道下显示正常，未出现假阳性。

实施例3

检测肿瘤细胞的富集率。

一、富集循环肿瘤细胞ctcs

1、采集健康人外周血6ml于acd采血管中，并向其中加入25个h460肿瘤细胞系。

2、上述样本以400g转速离心15min，弃上清。用pbst细胞清洗液补足6ml，并上下颠倒数次，混匀。其中pbst细胞清洗液包括体积分数0.02％tween20的pbs溶液。

3、将血样缓缓叠加至3ml的淋巴细胞分离液ficoll上，保证液面分层清晰。以350g转速离心6min。

4、离心后分成三层，上层为淡黄色血浆层，中间层为白膜层(ctcs和白细胞主要在这一层)，下层为红细胞层。吸取上层和中间层于心的50ml离心管中，下层丢弃。切忌勿吸到红细胞层。

5、向吸取的液体中缓慢滴加300μl表面偶联有cd45抗体的免疫磁珠，然后置于摇床，以30°-45°角度倾斜，120转/分的速度摇20min。

6、将上述离心管置于磁力架上2min，然后从离心管中心吸取所有液体于另一新的50ml离心管中，结合免疫磁珠的白细胞被去除。

7、向上述离心管中补加pbst细胞清洗液，补足45ml，500g离心5min。

8、弃上清。向上述离心管中补加pbst细胞清洗液，补足45ml，400g离心5min。

9、弃上清，至管底留约50μl液体。向其中加入2μl的荧光增强液。涡旋震荡仪轻微震荡以悬浮细胞，室温避光孵育10min。荧光增强液为含0.1mg/mlsds的pbs溶液，其中含有质量分数1％的聚乙二醇。

10、向上述溶液中再加入150-200μl细胞通透液，室温避光孵育20min。细胞通透液由含有体积分数0.2％tritonx-100的pbs构成。

11、收集所有的溶液于新的15ml离心管中，补足14ml，以500g/min转速离心5min。

12、吸弃上清液至留100μl，加入100μl组织固定液，轻微吹打混匀，将之均匀涂布于格式化载玻片上，并置于30-33℃的恒温干燥箱中过夜干片。组组织固定液包括含体积分数50％乙醇的pbs溶液，其中含有质量分数1％的聚乙二醇。

二、ctcs荧光原位杂交

1、将180μlpbs缓冲液于37℃预热30min，向其中加入20μl质量分数5％的多聚甲醛细胞固定液，混匀后，均匀滴加至上述玻片上，覆盖所有细胞干迹，避光孵育10min。

2、吸弃所有液体，滴加200μlpbs缓冲液清洗玻片2次，每次2min。

3、吸弃所有液体后，将玻片浸入无水乙醇中2min。

4、吹风机凉风吹干玻片，滴加10μlcep8探针，盖上盖玻片，并用封片胶封闭。于原位杂交仪杂交，条件为：76℃，10min；37℃，3h。

5、杂交结束后，撕下封片胶，浸入50mlpbs缓冲液中1min，轻轻取下盖玻片，在浸入pbs缓冲液中，5min，清洗未杂交上的探针。

三、tcpp储备液配置

1、用去离子水配制110ml50％的异丙醇。

2、取上述溶液90ml，加入400mgnahco3。

3、加入100mgtcpp，搅拌溶解3-5min。

4、再用体积分数50％异丙醇定容到100ml。tcpp浓度为1mg/ml。

5、保存于棕色瓶中，用锡箔纸包裹，冷藏保存。

四、tcpp工作液配置

1、先称取5.33gmes粉末，去离子水定容到250ml，使其终浓度为100mm，再用1m的naoh溶液调节ph值为5.8-6.5。mes缓冲液ph6.1最佳。

2、取2mltcpp母液，加入容量瓶，再加入48ml的上述mes缓冲液，使tcpp终浓度为40μg/ml。

3、棕色瓶避光且冷藏存放，现用现配。

五、tcpp暴露过程

1、取前述杂交后的玻片向细胞区域加200μl细胞破膜液，避光孵育10min。然后用pbs冲洗玻片2次，每次5min。所述破膜液为含有体积分数0.5％tritonx-100的pbs溶液。

2、将玻片浸入50ml的25-42℃预热的tcpp工作溶液中30min，避光孵育。优选预热温度为36℃。

3、室温下，用mes缓冲液洗玻片3次，每次1min。

4、吹风机冷风吹干玻片，滴加10μldapi染色液，盖玻片封片。

5、封片后1-24h内，使用荧光显微镜观察玻片，并计数ctcs细胞。

ctcs的判断方法为：荧光显微镜下，dapi染色在蓝光通道下细胞蓝色、tcpp染色在绿光通道下细胞呈绿色。在橙光通道下，可以根据橙光数目判断8号染色体核型。其中显微镜滤光块参数建议为：蓝光：365±50nm、绿光485±20nm、橙光546±10nm。

六、结果

图3中，a表示蓝光通道下dapi染色的细胞；b表示绿光通道下tcpp染色的细胞；c表示橙光通道下染色体核型图，对于识别肿瘤细胞是否为异倍体，观察染色体着丝粒的数目，正常的细胞是二倍体，而非二倍体细胞即为异倍体细胞；d表示a、b和c的融合图。

由图3可知，本实施例共检出19个h460细胞，本方法的肿瘤细胞富集率为76％。

实施例4

液相法检测循环肿瘤细胞。

一、富集循环肿瘤细胞ctcs

1、采集肿瘤患者外周血6ml于acd采血管中。室温保存，48h内处理。

2、样本以400g转速离心15min，弃上清。用pbst细胞清洗液补足6ml，并上下颠倒数次，混匀。其中pbst细胞清洗液由pbs缓冲液及体积分数0.02％的tween20构成。

3、将血样缓缓叠加至3ml的淋巴细胞分离液ficoll上，保证液面分层清晰。以350g转速离心6min。

4、离心后分成三层，上层为淡黄色血浆层，中间层为白膜层(ctcs和白细胞主要在这一层)，下层为红细胞层。吸取上层和中间层于心的50ml离心管中，下层丢弃。切忌勿吸到红细胞层。

5、向吸取的液体中缓慢滴加300μl表面偶联有cd45抗体的免疫磁珠，然后置于摇床，以30°-45°角度倾斜，120转/分的速度摇20min。

6、将上述离心管置于磁力架上2min，然后从离心管中心吸取所有液体于另一新的50ml离心管中，结合免疫磁珠的白细胞被去除。

7、向上述离心管中补加pbst细胞清洗液，补足45ml，500g离心5min。

8、弃上清。向上述离心管中补加pbst细胞清洗液，补足45ml，400g离心5min。

9、弃上清，至管底留约50μl液体。向其中加入2μl的荧光增强液。涡旋震荡仪轻微震荡以悬浮细胞，室温避光孵育10min。荧光增强液可为含tritonx-100、二甲基亚砜、np-40、十二烷基磺酸钠(sds)中的任一种的pbs溶液。最优选的为十二烷基磺酸钠的pbs溶液，浓度为0.01-1mg/ml。染色增强液中还含有质量分数0.1-3％的聚乙二醇(peg)。

10、向上述溶液中再加入200μl细胞通透液，室温避光孵育10min。

细胞通透液由含有体积分数0.1％tritonx-100的pbs构成。

11、向其中加入15ml95％乙醇固定溶液，固定细胞30min。95％乙醇固定溶液由体积分数95％无水乙醇和体积分数5％的ph6.1的mes缓冲液组成。

12、上述溶液以500g/min转速离心5min，弃上清至0.2ml。

二、tcpp工作液配置

1、先称取5.33gmes粉末，去离子水定容到250ml，使其终浓度为100mm，再用1m的naoh溶液调节ph值为6.1。

2、取2mltcpp母液，加入容量瓶，再加入48ml的上述mes缓冲液，使tcpp终浓度为40μg/ml。

3、棕色瓶避光且冷藏存放，现用现配。

三、tcpp暴露

1、取10mltcpp工作液加入到上述细胞溶液中，37℃暗处孵育20min。tcpp暴露时间为2min-2h，10min为优选。

2、400g/min转速离心5min，弃上清，至留0.2ml。

3、上述溶液低俗涡旋震荡混匀，转移至15ml离心管，mes缓冲液补足14ml。

6、500g/min转速离心5min，弃上清，至留0.1ml。

7、吸弃上清液至留100μl，加入100μl组织固定液1，轻微吹打混匀，将之均匀涂布于格式化载玻片上，并置于30-33℃的恒温干燥箱中过夜干片。组织固定液1由50％的乙醇pbs溶液，其中含有1％的聚乙二醇。

四、ctcs荧光原位杂交

1、将180μlpbs缓冲液于37℃预热30min，向其中加入20μl5％的多聚甲醛细胞固定液，混匀后，均匀滴加至上述玻片上，覆盖所有细胞干迹，避光孵育10min。

2、吸弃所有液体，滴加200μlpbs缓冲液清洗玻片2次，每次2min。

3、吸弃所有液体后，将玻片浸入无水乙醇中2min。

4、吹风机凉风吹干玻片，滴加10μlcep8探针，盖上盖玻片，并用封片胶封闭。于原位杂交仪杂交，条件为：76℃，10min；37℃，3h。

5、杂交结束后，撕下封片胶，浸入50mlpbs缓冲液中1min，轻轻取下盖玻片，在浸入pbs缓冲液中，5min，清洗未杂交上的探针。

6、吹风机冷风吹干玻片，滴加10μldapi染色液，盖玻片封片。

7、封片后1-24h内，使用荧光显微镜观察玻片，并计数ctcs细胞。

ctcs的判断方法为：荧光显微镜下，dapi染色在蓝光通道下细胞蓝色、tcpp染色在绿光通道下细胞呈绿色。在橙光通道下，可以根据橙光数目判断8号染色体核型。其中显微镜滤光块参数建议为：蓝光：365±50nm、绿光485±20nm、橙光546±10nm。

五、结果

图4中，a表示蓝光通道下dapi染色的细胞；b表示绿光通道下tcpp染色的细胞；c表示橙光通道下染色体核型图，对于识别肿瘤细胞是否为异倍体，观察染色体着丝粒的数目，正常的细胞是二倍体，而非二倍体细胞即为异倍体细胞；d表示a、b和c的融合图。

由图4可知，液相法检测结果和固相法基本一致。