一种适用于甜菊花药培养的花药分离方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种甜菊(SteviarebaudianaBertoni)植物花药分离方法，可用于甜菊花药离体培养诱导单倍体植株的研究。

背景技术：

甜菊(SteviarebaudianaBertoni)作为新兴的天然高甜度低热量糖源植物，其种质资源研究和优良新品种培育对甜菊产业的发展十分重要。因为甜菊具有异花授粉和自交不亲和的特性，其自交结实率极低，由于遗传背景复杂，杂交后代群体性状分离显著，难以直接获得自交系及纯合体植株，在一定程度上减缓了甜菊育种进程。

通过组织培养等方法诱导植物大孢子、小孢子获得单倍体植株再加倍是获得纯合体植株卓有成效的方法，在玉米、小麦、甘蓝等许多植物中已获得成功，然而在甜菊中鲜有研究，目前尚无成功的报道。诱导单倍体植株通常采用小孢子处于单核靠边期的花药进行花药培养、游离小孢子培养，或进行未受精胚珠、未受精子房培养等。由于甜菊的花十分微小，小孢子处于单核靠边期时对应的花蕾仅长约2毫米，使得分离花药十分困难。而本发明首次公开一种可以简单快速地从微小甜菊花蕾中完整分离出花药的方法，提高了分离成功率，并有效降低了花药培养中的污染情况。

技术实现要素：

技术问题

本发明目的是要解决从长约2毫米的甜菊微小花蕾中分离出完整花药的技术问题，提供一种适用于甜菊花药培养的花药分离方法。

技术方案

本发明的技术方案如下：

一种适用于甜菊花药离体培养的花药分离方法，其步骤如下：

(1)花序采集：于甜菊盛花期从植株上采集花蕾1.8-2.2毫米长，苞片紧闭的头状花序，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，4℃冰箱中保存备用；

(2)花序消毒：在超净工作台中，将头状花序先用75％乙醇消毒30秒后，1％升汞浸泡3-4分钟，再用无菌水清洗3-4次，然后将花序放置于铺有无菌滤纸的培养皿中晾干；

(3)花药分离：用无菌小镊子剥开苞片，从花序中拔取一个花蕾，用无菌解剖针针尖刺破花蕾的花冠顶部，再用无菌解剖针针尖段从花冠基部向顶部滚动式碾压，将筒状花药从花冠顶部破口处挤出。

所述培养皿为：在干净培养皿中铺3-4张滤纸，用报纸包裹，高温高压灭菌备用。

所述花药分离过程中：用无菌小镊子剥开苞片，从花序中拔取一个花蕾，并将其置于75％乙醇消毒的左手食指指腹上，用右手持解剖针刺破花蕾的花冠顶部并从花冠基部向顶部滚动式碾压。

有益效果

本专利首次针对甜菊花蕾微小，小孢子处于单核靠边期时对应的花蕾仅长约2毫米，使得分离花药十分困难的问题，巧妙地利用花药合生成筒状的特征，发明了该方法，提供了一种简单高效的甜菊花药分离方法，所得花药可直接用于单倍体诱导培养。

采用本发明方法可极大地降低了剥取甜菊微小花药的操作难度，保证了所得花药的完整性，并有效降低了培养中的污染率，提高了工作效率。

附图说明

图1：甜菊花序、花蕾、花药

①甜菊头状花序；②小孢子单核靠边期对应的花序大小；③花蕾；④花药

图2：甜菊花蕾结构示意图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

本发明为一种适用于甜菊花药培养的花药分离方法，包括以下操作步骤：

(1)无菌培养皿的准备：在干净培养皿中铺3-4张滤纸，用报纸包裹，按常规高温高压灭菌方法灭菌备用。

(2)花序采集：于甜菊(品种‘中山5号’，见高苷甜菊新品种中山5号的选育-《中国糖料》2015年04期)盛花期从植株上采集苞片紧闭，花蕾长约2毫米的头状花序，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，4℃冰箱中保存备用。

(3)花序消毒：在超净工作台中，将头状花序先用75％乙醇消毒30秒后，1％升汞浸泡3-4分钟，再用无菌水清洗3-4次，然后将花序放置于铺有无菌滤纸的培养皿中晾干。

(4)花药分离：用无菌小镊子剥开苞片，从花序中拔取单个花蕾，并将其置于75％乙醇消毒的左手食指指腹上，右手持解剖针用针尖刺破花蕾的花冠(图2)顶部，再用无菌解剖针针尖段从花冠基部(即花冠与子房连接处)向花冠顶部滚动式碾压，将筒状花药从花冠顶部破口处挤出。

所得花药可作为外植体直接接种于培养基上，进行单倍体诱导培养，或进行小孢子分离，用于游离小孢子培养。

采用本发明方法可极大地降低了剥取甜菊微小花药的操作难度，保证了所得花药的完整性，并有效降低了培养中的污染率，提高了工作效率。