本发明属于烟草育种技术领域，具体涉及一种同时改善烤烟植株抗病性、氮利用率和烟碱含量的方法。
背景技术：
烟草是卷烟的主要原料作物，也是中国的重要经济作物，而品种是烤烟生产的基础。长期以来，我国烤烟生产上使用的主栽品种一直是云烟87和k326，这主要是因为其烟叶品质好而深受卷烟工业的喜爱。但是，近些年来，这两大主栽品种遇到了三大问题：一是由于这两大主栽品种种植历史长，致使普通花叶病(tmv)等病毒病和气候斑点病等叶面病害的危害日趋严重，严重降低了烟草产量和品质，经济损失惨重，已成为我国优质烤烟生产的重要制约因素；二是由于这两大主栽品种对氮肥的利用效率不高，因而在栽培种植的过程中，为了保证产量，而需要施用大量的化学肥料，尤其是需要施用大量的氮肥，从而造成氮肥资源的巨大浪费，增加种烟成本，并构成水体富营养化的面污染源；三是由于这两大主栽品种在栽培种植过程中氮肥施用量过大，加之近几年烟叶生产过程要求去除部分上部叶和部分下部叶，导致有效留叶数较少，进而造成上部烟叶烟碱含量偏高，工业可用性下降。如果采用传统的育种方法，针对上述三大问题，对这两大主栽品种进行改良，则又会面临着两大问题：一是采用传统育种方法对这两大品种进行改良，难以保障改良品种仍然保持这两大品种原来具有的深受卷烟工业喜爱的烟叶风格特征；二是采用传统育种方法对这两大品种进行改良，所需年限较长，难以在短时间内满足烟叶生产的需求。近几年来出现了一些通过嫁接来改良烤烟植株特性的新技术，接穗生长所需的水分、矿质养分由砧木根系提供，砧木所需同化产物由接穗供给，嫁接后的烟株既能保持接穗品种的优良性状，又能利用砧木的有利特性。通过嫁接改良的烟株当年即可应用于大田生产，而不需要花费太长年限。如中国专利件201110387997.7公开了一种以玫瑰葡萄为砧木、采用舌接法嫁接来改良k326烤烟品种的方法，专利件201110388642.x公开了一种以香叶天竺葵为砧木、采用靠接法嫁接来改良云烟87烤烟品种的方法，专利件201110387720.4公开了一种以香菊为砧木、采用腹接法嫁接来改良云烟97烤烟品种的方法，专利件201110387818.x公开了一种以青蒿为砧木、采用插接法嫁接来改良中烟100烤烟品种的方法，专利件201110388641.5公开了一种以墨红玫瑰为砧木、采用芽接法嫁接来改良nc102烤烟品种的方法，专利件201110387785.9公开了一种以法国野葡萄为砧木、采用舌接法嫁接来改良nc297烤烟品种的方法，专利件201310737512.1公开了一种以油菜为砧木、采用插接法嫁接来改良烤烟植株的培育方法，专利件201410020314.8公开了一种以茄属茄子抗青茄砧为砧木、采用插接法嫁接来改良烟株青枯病抗性的方法。这些专利件都是以非烟草植物为砧木，通过不同嫁接方法来改良烤烟品种的。众所周知，烟碱是由烟草根系合成的，然后通过烟株茎秆运输到烟株叶片中。虽然烟草之外的茄科植物根系也能合成烟碱，但其烟碱合成量与烟草相比，几乎可以忽略不计。烟碱是烟叶的特征化学成分，内在质量好的烤烟烟叶一般要求烟碱含量在1.5％-3.5％之间，以2.5％左右为宜。若烟叶中烟碱含量过高，则生理强度大，吃味变劣，刺激性增强，卷烟工业上不好使用，反之，烟碱含量过低，则烟叶吃味平淡，不能满足吸食需要，卷烟工业上也不喜欢。因此，上述几件专利所公开的方法尽管能够提高烟株的抗病虫能力或抗逆能力，甚至赋予烟叶特殊的香气，但所获得的烟株因砧木根系无法合成烟碱或合成的烟碱几乎为零，致使烟叶失去特征化学成分烟碱，进而降低了烟叶的特征香气和吃味，因此，采用这些方法去改良目前烤烟生产上大面积使用的主栽品种，在烤烟生产中无实际意义。况且，这些方法都未涉及嫁接后烟株氮肥利用效率的表现，这些方法采用非烟草植物作为砧木，其需肥特性与烤烟本身的需肥特性有很大差异，因而对烟株的氮肥利用率是否有改良效果也就不得而知。中国专利件201310415281.2公开了一种以籽粒苋为砧木、采用合接法嫁接来改良烤烟植株的培育方法。这一方法虽然能够提高烟叶钾含量，但对所获得烟株的抗病性和氮肥利用率不得而知，而且同样存在所获得的烟株因砧木根系无法合成烟碱，致使烟叶失去特征化学成分烟碱的问题，因而在烤烟生产中也无实际意义。中国专利件201310737474.x公开了一种以大豆为砧木、采用插接法嫁接来改良烤烟植株的培育方法。该方法试图利用大豆根瘤菌的生物固氮作用，以减少烟株施氮量。但是，烟草属于大株距大行距作物，个体较大，而大豆属于密植作物，个体较小，因而大豆根系发育受到一定限制，难以支撑烟株个体的充分发育，致使烟株容易倒伏。此外，该方法所得烟株的抗病性如何不得而知，也同样存在着所获得的烟株因砧木根系无法合成烟碱，致使烟叶失去特征化学成分烟碱的问题，因而在烤烟生产中也无实际意义。中国专利件201210064290.7公开了一种以黄花烟草为砧木、采用劈接法嫁接来改良烤烟植株的培育方法，试图利用黄花烟草根系富集cd的能力，以降低cd在烟叶中的积累量。黄花烟草多属地方品种或野生种，综合抗病抗逆能力较强，因而以黄花烟草为砧木，所获得的烤烟植株的抗病抗逆能力也会有所改善，但由于黄花烟草非常耐肥，且其根系合成烟碱能力显著高于烤烟，因而以黄花烟草为砧木，难以改善所获得烤烟植株的氮利用率和烟碱含量。中国专利件201210389062.7公开了一种通过嫁接来整合烟草品种特性的方法。该方法以抗病品种为砧木、感病优质品种为接穗，整合的只是烟草品种的抗病性，并未涉及所获得烟株的氮利用率及其烟叶中的烟碱含量。本领域技术人员都知晓，在众多的烟草种质资源中，不乏兼抗根茎类病害和叶面病害的种质，也不乏氮利用率高而根系合成烟碱量较少的种质，但仅有少数一些种质材料既表现氮利用率高、根系合成烟碱量较少，又兼抗根茎类病害和叶面病害，如cv87、k8等。然而这些种质材料不宜直接作为砧木，通过嫁接去解决烤烟主栽品种k326和云烟87存在的上述三大问题。如cv87、k8等种质材料，由于根系非常发达，因而氮肥利用率非常高，虽然能够抗旱抗倒伏，但对氮肥非常敏感，不易烘烤。若用其作为砧木通过嫁接来改良烤烟品种k326和云烟87，则所获嫁接后烟株同样因根系过于发达而对氮肥非常敏感，加之植烟土壤的肥力千差万别，致使烟农对嫁接后烟株的施肥量难以控制，进而影响烟叶烘烤质量。此外，这些种质材料若作为砧木通过嫁接来改良烤烟品种k326和云烟87，虽然由于其根系合成烟碱量较少而能解决目前烤烟主栽品种k326和云烟87上部叶烟碱含量偏高问题，但又会使嫁接后烟株表现出烟叶中烟碱含量偏低的问题。因此，如若利用嫁接技术来改良烤烟主栽品种k326和云烟87，那么采取有效的手段使cv87、k8等种质材料的氮肥敏感性得以缓冲，根系合成烟碱能力稍有提高，进而成为理想的砧木就显得尤为重要。申请人试图将嫁接技术与传统育种方法相结合，为此进行了试验研究，探讨出了一种同时改善烤烟植株抗病性、氮利用率和烟碱含量的方法。
技术实现要素：
本发明提供一种同时改善烤烟植株抗病性、氮利用率和烟碱含量的方法，既能使改良后的烤烟植株保持烤烟主栽品种k326和云烟87的原有烟叶风格特征，又能使改良后的烤烟植株提高抗病抗逆性、氮利用率和上部烟叶的工业可用性，节省肥料和农药投资成本，减少环境污染,并大大缩短育种周期。
本发明提供的技术方案：所述一种同时改善烤烟植株抗病性、氮利用率和烟碱含量的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)以广适、抗黑胫病而感tmv和气候斑点病的生产上使用的烤烟品种为母本，以兼抗黑胫病、tmv和气候斑点病，且根系发达、氮利用率高、烟叶中烟碱含量偏低的常规烤烟种质材料为父本，杂交得到杂交组合f1代种子；
(2)以步骤(1)获得的杂交组合f1代幼苗作为砧木，以生产上使用的烤烟品种幼苗作为接穗进行嫁接，得到嫁接植株并进行培育；
(3)将步骤(2)获得的嫁接成活烟株按照当地烤烟生产技术要求方法移栽至大田。
本发明方法中，步骤(1)中所述母本品种与步骤(2)中所述接穗品种是一致的，包括k326和云烟87或其不育系。
本发明方法中，步骤(1)中所述父本包括cv87或k8。cv87和k8均是中国农业科学院烟草研究所用抗tmv、赤星病、气候斑点病主抗源cv58作母本，以美国引进抗根茎病害优质品种主亲源g28、nc82、g80等品种的f1代组合做父本，进行多亲本复交选育而成的烤烟新种质，1994年通过烟草行业专家鉴定，并提交国家烟草种质库保存，同时发放给各烟草育种单位使用。
本发明方法中，步骤(2)中接穗品种按正常的烤烟育苗节令播种育苗，砧木材料比接穗品种提前5-10天播种育苗，以控制两种烟苗的生长势，备嫁接；育苗方法选用烟草漂浮育苗技术育苗；漂浮育苗在温室大棚内进行，育苗基质按草炭与珍珠岩体积比为2﹕1配制，每m3基质加50％多菌灵可湿性粉剂200g，氮、磷、钾含量为15﹕15﹕15三元复合肥3kg，肥药混合均匀。
本发明方法中，步骤(2)中，嫁接一般选择在阴天或者晴天的早上和下午为宜；嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人员的手需清洗干净。
本发明方法中，步骤(2)中，嫁接时，砧木选取苗龄45-55天，茎高4.0-6.0cm，直径0.20-0.40cm的健壮无病的砧木材料的烟苗作为砧木；接穗选取苗龄40-50天，茎高3.5cm以上，直径0.15-0.25cm的健壮无病的接穗品种的烟苗作为接穗。
本发明方法中，步骤(2)中，嫁接方法可采用劈接法、斜劈接法、舌接法或合接法，嫁接后将嫁接烟株移入愈合养护室。
其中，k326由美国northrupking种子公司用mcnair225×(mcnair30×nc95)杂交选育而成，1983年在美国开始推广，1985年引入我国并提交国家烟草种质库保存，同时发放给各烟草育种单位，1989年经过试验示范，由全国烟草品种审定委员会审定为优良品种，并在全国推广。为了杜绝烟农自留种现象并防止品种混杂退化，本世纪初，中国农科院烟草研究所将k326转育成不育系msk326，并替代常规品种k326在全国推广，目前烤烟生产上大面积种植的k326既有常规品种k326，也有k326雄性不育系msk326。云烟87由云南省烟草科学研究所以云烟2号为母本、k326为父本杂交选育而成，2000年由全国烟草品种审定委员会审定为优良品种，并在全国推广，同时提交国家烟草种质库保存，并发放给各烟草育种单位。为了杜绝烟农自留种现象并防止品种混杂退化，近年来，云南玉溪烟草种子公司将云烟87转育成不育系ms云烟87，并替代常规品种云烟87在全国推广，目前烤烟生产上大面积种植的云烟87既有常规品种云烟87，也有云烟87雄性不育系ms云烟87。
所述劈接法即插接法，具体做法是：去除砧木的生长点，将其茎杆纵轴用刀片垂直向下劈深1-1.5cm的切口；接穗切除根部并去除部分较大地叶片，在近子叶节处两边各削一刀形成楔形，削面长度1-1.5cm，将削好的接穗垂直插入砧木的劈口，使砧木与接穗削面平整对齐，为了使砧木与接穗切面紧密贴合，用嫁接夹固定或用塑料薄膜条带捆扎结实。
所述斜劈接法即腹接法，具体做法是：将接穗根部切除并去除部分较大地叶片，用刀将接穗下端削成缓斜的楔形平面，用刀斜角向下切至砧木直径的1/4处，将接穗插入砧木的切口，用透明胶布绑缚。嫁接成活后，将嫁接位以上的砧木剪去。
所述舌接法，具体做法是：去除砧木的生长点，从上向下斜切一刀，切面长为1-1.5cm；接穗切除根部并去除较大地叶片，仅保留1叶1心，然后在近子叶节处同样斜切一刀，切面长度与砧木切面长度保持一致；再在砧木斜面上靠近尖端1/3处和接穗斜面上靠近尖端2/3处，各自垂直向下切一刀，深约1-1.5cm，将接穗和砧木“舌”形切口相卡，并对准形成层，上下挤紧，将两舌间插合在一起。此法结合非常紧密，可不用捆扎。
所述合接法，具体做法是：去除砧木的生长点，从上向下斜切一刀，切面长为0.8-1.2cm；接穗切除根部并去除较大地叶片，仅保留1叶1心，然后在近子叶节处同样斜切一刀，切面长度与砧木切面长度保持一致；使用塑料套管嫁接，将砧木的切面朝上插进套管，再把接穗的烟苗切面朝下插进套管中，使砧木与接穗的切面紧紧贴合在一起。
本发明方法中，步骤(2)中，嫁接后前3天注意遮光，保温、保湿，控制空气湿度在80％以上，温度20-28℃；3天后通风和见光，控制空气湿度以接穗不萎蔫为基准，至完全愈合，7-10天后移出养护室，并拿掉嫁接夹(套)或解除绑条。
有益效果
(1)本发明方法以生产上使用的烤烟主栽品种为母本，以兼抗多种病害、氮利用率高而烟碱含量偏低的种质材料为父本，配制杂交组合，将得到的杂交组合f1代作为砧木，将得到的杂交组合的母本作为接穗，得到的嫁接改良烟株能够最大程度地维持接穗品种原有的卷烟工业所喜爱的烟叶风格特征。
(2)本发明方法以生产上使用的抗根茎类病害黑胫病而感tmv、气候斑点病等叶面病害的烤烟主栽品种为母本，以根系非常发达、兼抗根茎类病害黑胫病和叶面病害tmv、气候斑点病等多种病害的种质材料为父本，配制杂交组合，则得到的杂交组合f1代同样根系非常发达，且兼抗根茎类病害黑胫病和叶面病害tmv、气候斑点病等多种病害。将得到的杂交组合f1代作为砧木，将得到的杂交组合的母本作为接穗，得到的嫁接改良烟株与接穗品种相比，不仅具有抗黑胫病和抗旱、抗倒伏性能，而且在生育期、形态特征、农艺性状、经济性状、烘烤和吸食品质方面与原接穗品种无明显差异，在抗tmv、气候斑点病等叶面病害以及适应性方面优于接穗品种。
(3)本发明方法以生产上使用的极度耐肥的烤烟主栽品种为母本，以根系非常发达、因氮肥利用率非常高而对氮肥非常敏感的种质材料为父本，配制杂交组合，则得到的杂交组合f1代同样根系非常发达，且氮肥利用率和对氮肥的敏感性居于母本和父本之间。将得到的杂交组合f1代作为砧木，将得到的杂交组合的母本作为接穗，得到的嫁接改良烟株的氮肥利用率较接穗品种明显提高，且又对氮肥的敏感性较杂交组合f1代的父本明显降低。嫁接改良烟株与接穗品种进行比较的结果表明，嫁接烟株在保证烟叶正常产量和质量的条件下，能够明显降低烟株施氮量，并且单株施氮量容易为烟农控制。
(4)本发明方法以生产上使用的烤烟主栽品种为母本，以烟叶中烟碱含量偏低的种质材料为父本，配制杂交组合，则得到的杂交组合f1代烟叶中烟碱含量居于母本和父本之间。将得到的杂交组合f1代作为砧木，将得到的杂交组合的母本作为接穗，得到的嫁接改良烟株的上部叶烟碱含量较接穗品种明显降低，且又较杂交组合f1代的父本明显提高。嫁接改良烟株与接穗品种进行比较的结果表明，嫁接烟株上部叶烟碱含量处于适宜范围，上部叶的工业可用性得到提高。
(5)本发明方法以广适、抗黑胫病而感tmv和气候斑点病的生产上使用的烤烟品种为母本，以兼抗黑胫病、tmv和气候斑点病，且根系发达、氮利用率高、烟叶中烟碱含量偏低的常规烤烟种质材料为父本，配制杂交组合，将得到的杂交组合f1代作为砧木，将得到的杂交组合的母本作为接穗，得到的嫁接改良烟株不仅抗病性得以提高，氮肥利用率也得以提高，既降低了肥料和农药投资成本，又减少了环境污染。
(6)本发明方法以广适、抗黑胫病而感tmv和气候斑点病的生产上使用的烤烟品种为母本，以兼抗黑胫病、tmv和气候斑点病，且根系发达、氮利用率高、烟叶中烟碱含量偏低的常规烤烟种质材料为父本，配制杂交组合，将得到的杂交组合f1代作为砧木，将得到的杂交组合的母本作为接穗，得到的嫁接烟株在抗病性、氮利用率和上部叶烟碱含量方面同时都得到了改善，而花费的时间仅需1年，与传统育种方法相比，大大地缩短了育种周期。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例一：利用种质材料k8改良烤烟品种k326
烤烟品种k326烟叶品质优良，深受卷烟工业喜爱，长期的田间表现情况观察和鉴定结果表明，烤烟品种k326中抗根茎类病害黑胫病，但易感叶面性病害普通花叶病毒病(tmv)、马铃薯y病毒病(pvy)、赤星病和气候斑点病，田间表现极度耐肥，需氮量高，加之近些年来要求去除部分上部叶和部分下部叶，导致有效留叶数较少，进而造成上部烟叶烟碱含量偏高，工业可用性下降。而常规种质材料k8根系非常发达，抗旱抗倒伏，兼抗根茎类病害黑胫病和叶面性病害tmv、pvy、赤星病和气候斑点病，但因氮肥利用率非常高而对氮肥非常敏感，不易烘烤，且烟叶中烟碱含量偏低。
在海南三亚南繁基地，同时种植烤烟品种k326和种质材料k8，并于元月份盛花期以k326为母本，以k8为父本进行杂交，得到杂交组合f1代种子，记作(k326×k8)f1。
将得到的(k326×k8)f1以及k326和k8在恩施州利川育种基地育苗大棚内进行漂浮育苗，育苗基质按草炭与珍珠岩体积比为2﹕1配制，每m3基质加50％多菌灵可湿性粉剂200g，氮、磷、钾含量为15﹕15﹕15三元复合肥3kg，肥药混合均匀。2月20日播种(k326×k8)f1，3月1日播种k326和k8。按烟草漂浮育苗技术要求进行苗期管理。
各品种于播种后10-12天开始出苗。4月20-25日进行嫁接。砧木材料(k326×k8)f1选取苗龄45-55天，茎高4.0-6.0cm，直径0.20-0.40cm的健壮无病的烟苗作为砧木。接穗品种k326选取苗龄40-50天，茎高3.5cm以上，直径0.15-0.25cm的健壮无病的烟苗作为接穗。在早上或下午采用劈接法嫁接。去除砧木的生长点，将其茎杆纵轴用刀片垂直向下劈深1-1.5cm的切口；接穗切除根部并去除部分较大地叶片，在近子叶节处两边各削一刀形成楔形，削面长度也是1-1.5cm，将削好的接穗垂直插入砧木的劈口，使砧木与接穗削面平整对齐，为了使砧木与接穗切面紧密贴合，用嫁接夹固定或用塑料薄膜条带捆扎结实。嫁接烟株记作k326/(k326×k8)f1。
嫁接时注意嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人员的手需清洗干净。嫁接结束后，将嫁接烟株移入愈合养护室。前3天注意遮光，保温、保湿，控制空气湿度在80％以上，温度20-28℃。3天后通风和见光，控制空气湿度以接穗不萎蔫为基准，至完全愈合，7-10天后移出养护室，并拿掉嫁接夹或解除绑条。
5月10日，将k326/(k326×k8)f1、(k326×k8)f1、k326和k8一起移栽至大田，进行不同施氮量的小区比较试验。采用裂区试验设计，品种(k326/(k326×k8)f1、(k326×k8)f1、k326、k8)为主处理，施氮量(0、2.5、4.5、6.5kg/亩)为副处理。其中施氮量6.5kg/亩为目前大田生产上k326正常施氮量，施氮量2.5kg/亩为k8正常施氮量。各处理氮磷钾配比均为1∶1.5∶3。每小区种植80株，3次重复。行距和株距分别为120cm和60cm。四周设置保护行。其它栽植方法和大田管理按照当地烤烟生产技术要求进行。成熟摘叶采收，密集式烤房烘烤。烘烤结束后除施氮量0kg/亩处理外，各品种均按小区计产计质，各处理分别取中部叶混合样和上部叶混合样测定烟碱含量，同时各品种取c3f等级烟样进行评吸鉴定。试验过程中，在每个品种中选用施氮量6.5kg/亩的处理，选取均匀一致的5株烟进行定株，按生育进程采集根、茎、叶(成熟一片采一片)、顶和杈等进行杀青、烘干、称重，并分别测定其n含量，以施氮量0kg/亩处理为不施氮肥的空白对照，采用差减法测算各品种的氮利用率。此外，还将k326/(k326×k8)f1、(k326×k8)f1、k326和k8烟苗移栽入黑胫病病圃和病毒病病圃，均采用随机区组设计，3次重复，每小区20株，以进行黑胫病和tmv抗性接种鉴定，同时田间调查气候斑点病发病情况。上述试验结果分别列于表1、表2和表3。
试验结果表明，嫁接改良烟株对黑胫病、tmv和气候斑点的抗性均较接穗品种k326有明显改善。嫁接改良烟株的氮利用率也比接穗品种k326明显提高，与作为砧木的(k326×k8)f1的氮利用率相近，又比砧木(k326×k8)f1的父本k8的氮利用率有所降低。从经济性状来看，接穗品种在亩施氮量6.5kg时综合经济性状表现最好，但上部烟叶中烟碱含量超出适宜范围3.5％；而嫁接改良烟株在亩施氮量4.5kg时综合经济性状表现最好，且与接穗品种在亩施氮量6.5kg时的综合经济性状表现相当，此时中部叶和上部叶烟碱含量都处于适宜范围，接近最佳值2.5％，随着施氮量增加，嫁接改良烟株因烟叶落黄成熟变得困难而经济性状变差，上部叶烟碱含量也远离最佳值。从评吸质量来看，嫁接改良烟株与接穗品种k326相当。由上可见，在保障烟叶品质风格和综合经济性状的情况下，嫁接改良烟株综合抗病性得到了改善，氮利用率得到了提高，而施氮量明显降低，上部叶烟碱含量也明显降低且更趋于适宜。
表1各品种的氮利用率与病情指数
表2各品种的不同施氮量经济性状表现与烟碱含量
表3各品种的评吸结果
实施例二：利用种质材料k8改良烤烟品种云烟87
烤烟品种云烟87烟叶品质优良，深受卷烟工业喜爱，长期的田间表现情况观察和鉴定结果表明，烤烟品种云烟87中抗根茎类病害黑胫病，但易感叶面性病害tmv、pvy、赤星病和气候斑点病，田间表现极度耐肥，需氮量高，加之近些年来要求去除部分上部叶和部分下部叶，导致有效留叶数较少，进而造成上部烟叶烟碱含量偏高，工业可用性下降。而常规种质材料k8根系非常发达，抗旱抗倒伏，兼抗根茎类病害黑胫病和叶面性病害tmv、pvy、赤星病和气候斑点病，但因氮肥利用率非常高而对氮肥非常敏感，不易烘烤，且烟叶中烟碱含量偏低。
在海南三亚南繁基地，同时种植烤烟品种云烟87和种质材料k8，并于元月份盛花期以云烟87为母本，以k8为父本进行杂交，得到杂交组合f1代种子，记作(云烟87×k8)f1。
将得到的(云烟87×k8)f1以及云烟87和k8在恩施州利川育种基地育苗大棚内进行漂浮育苗，育苗基质按草炭与珍珠岩体积比为2﹕1配制，每m3基质加50％多菌灵可湿性粉剂200g，氮、磷、钾含量为15﹕15﹕15三元复合肥3kg，肥药混合均匀。2月28日播种(云烟87×k8)f1，3月5日播种云烟87和k8。按烟草漂浮育苗技术要求进行苗期管理。
各品种于播种后10-12天开始出苗。4月25-30日进行嫁接。砧木材料(云烟87×k8)f1选取苗龄45-55天，茎高4.0-6.0cm，直径0.20-0.40cm的健壮无病的烟苗作为砧木。接穗品种云烟87选取苗龄40-50天，茎高3.5cm以上，直径0.15-0.25cm的健壮无病的烟苗作为接穗。在早上或下午采用斜劈接法嫁接。将接穗根部切除并去除部分较大地叶片，用刀将接穗下端削成缓斜的楔形平面，用刀斜角向下切至砧木直径的1/4处，将接穗插入砧木的切口，用透明胶布绑缚。嫁接烟株记作云烟87/(云烟87×k8)f1。
嫁接时注意嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人员的手需清洗干净。嫁接结束后，将嫁接烟株移入愈合养护室。前3天注意遮光，保温、保湿，控制空气湿度在80％以上，温度20-28℃。3天后通风和见光，控制空气湿度以接穗不萎蔫为基准，至完全愈合，7-10天后移出养护室，并将嫁接位以上的砧木剪去。
5月15日，将云烟87/(云烟87×k8)f1、(云烟87×k8)f1、云烟87和k8一起移栽至大田，进行不同施氮量的小区比较试验。采用裂区试验设计，品种(云烟87/(云烟87×k8)f1、(云烟87×k8)f1、云烟87、k8)为主处理，施氮量(0、2.5、4.5、6.5kg/亩)为副处理。其中施氮量6.5kg/亩为目前大田生产上云烟87正常施氮量，施氮量2.5kg/亩为k8正常施氮量。各处理氮磷钾配比均为1∶1.5∶3。每小区种植80株，3次重复。行距和株距分别为120cm和60cm。四周设置保护行。其它栽植方法和大田管理按照当地烤烟生产技术要求进行。成熟摘叶采收，密集式烤房烘烤。烘烤结束后除施氮量0kg/亩处理外，各品种均按小区计产计质，各处理分别取中部叶混合样和上部叶混合样测定烟碱含量，同时各品种取c3f等级烟样进行评吸鉴定。试验过程中，在每个品种中选用施氮量6.5kg/亩的处理，选取均匀一致的5株烟进行定株，按生育进程采集根、茎、叶(成熟一片采一片)、顶和杈等进行杀青、烘干、称重，并分别测定其n含量，以施氮量0kg/亩处理为不施氮肥的空白对照，采用差减法测算各品种的氮利用率。此外，还将云烟87/(云烟87×k8)f1、(云烟87×k8)f1、云烟87和k8烟苗移栽入黑胫病病圃和病毒病病圃，均采用随机区组设计，3次重复，每小区20株，以进行黑胫病和tmv抗性接种鉴定，同时田间调查气候斑点病发病情况。上述试验结果分别列于表4、表5和表6。
试验结果表明，嫁接改良烟株对黑胫病、tmv和气候斑点的抗性均较接穗品种云烟87有明显改善。嫁接改良烟株的氮利用率也比接穗品种云烟87明显提高，与作为砧木的(云烟87×k8)f1的氮利用率相近，又比砧木(云烟87×k8)f1的父本k8的氮利用率有所降低。从经济性状来看，接穗品种在亩施氮量6.5kg时综合经济性状表现最好，但上部烟叶中烟碱含量超出适宜范围3.5％；而嫁接改良烟株在亩施氮量4.5kg时综合经济性状表现最好，且与接穗品种在亩施氮量6.5kg时的综合经济性状表现相当，此时中部叶和上部叶烟碱含量都处于适宜范围，接近最佳值2.5％，随着施氮量增加，嫁接改良烟株因烟叶落黄成熟变得困难而经济性状变差，上部叶烟碱含量也远离最佳值。从评吸质量来看，嫁接改良烟株与接穗品种云烟87相当。由上可见，在保障烟叶品质风格和综合经济性状的情况下，嫁接改良烟株综合抗病性得到了改善，氮利用率得到了提高，而施氮量明显降低，上部叶烟碱含量也明显降低且更趋于适宜。
表4各品种的氮利用率与病情指数
表5各品种的不同施氮量经济性状表现与烟碱含量
表6各品种的评吸结果
实施例三：利用种质材料cv87改良烤烟品种msk326
烤烟品种msk326烟叶品质优良，深受卷烟工业喜爱，长期的田间表现情况观察和鉴定结果表明，烤烟品种msk326中抗根茎类病害黑胫病，但易感叶面性病害tmv、pvy、赤星病和气候斑点病，田间表现极度耐肥，需氮量高，加之近些年来要求去除部分上部叶和部分下部叶，导致有效留叶数较少，进而造成上部烟叶烟碱含量偏高，工业可用性下降。而常规种质材料cv87根系非常发达，抗旱抗倒伏，兼抗根茎类病害黑胫病和叶面性病害tmv、pvy、赤星病和气候斑点病，但因氮肥利用率非常高而对氮肥非常敏感，不易烘烤，且烟叶中烟碱含量偏低。
在海南三亚南繁基地，同时种植烤烟品种msk326和种质材料cv87，并于元月份盛花期以msk326为母本，以cv87为父本进行杂交，得到杂交组合f1代种子，记作(msk326×cv87)f1。
将得到的(msk326×cv87)f1以及msk326和cv87在恩施州利川育种基地育苗大棚内进行漂浮育苗，育苗基质按草炭与珍珠岩体积比为2﹕1配制，每m3基质加50％多菌灵可湿性粉剂200g，氮、磷、钾含量为15﹕15﹕15三元复合肥3kg，肥药混合均匀。2月23日播种(msk326×cv87)f1，3月2日播种msk326和cv87。按烟草漂浮育苗技术要求进行苗期管理。
各品种于播种后10-12天开始出苗。4月22-27日进行嫁接。砧木材料(msk326×cv87)f1选取苗龄45-55天，茎高4.0-6.0cm，直径0.20-0.40cm的健壮无病的烟苗作为砧木。接穗品种msk326选取苗龄40-50天，茎高3.5cm以上，直径0.15-0.25cm的健壮无病的烟苗作为接穗。在早上或下午采用舌接法嫁接。去除砧木的生长点，从上向下斜切一刀，切面长为1-1.5cm；接穗切除根部并去除较大地叶片，仅保留1叶1心，然后在近子叶节处同样斜切一刀，切面长度与砧木切面长度保持一致；再在砧木斜面上靠近尖端1/3处和接穗斜面上靠近尖端2/3处，各自垂直向下切一刀，深约1-1.5cm，将接穗和砧木“舌”形切口相卡，并对准形成层，上下挤紧，将两舌间插合在一起。此法结合非常紧密，可不用捆扎。嫁接烟株记作msk326/(msk326×cv87)f1。
嫁接时注意嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人员的手需清洗干净。嫁接结束后，将嫁接烟株移入愈合养护室。前3天注意遮光，保温、保湿，控制空气湿度在80％以上，温度20-28℃。3天后通风和见光，控制空气湿度以接穗不萎蔫为基准，至完全愈合，7-10天后移出养护室。
5月13日，将msk326/(msk326×cv87)f1、(msk326×cv87)f1、msk326和cv87一起移栽至大田，进行不同施氮量的小区比较试验。采用裂区试验设计，品种(msk326/(msk326×cv87)f1、(msk326×cv87)f1、msk326、cv87)为主处理，施氮量(0、2.5、4.5、6.5kg/亩)为副处理。其中施氮量6.5kg/亩为目前大田生产上msk326正常施氮量，施氮量2.5kg/亩为cv87正常施氮量。各处理氮磷钾配比均为1∶1.5∶3。每小区种植80株，3次重复。行距和株距分别为120cm和60cm。四周设置保护行。其它栽植方法和大田管理按照当地烤烟生产技术要求进行。成熟摘叶采收，密集式烤房烘烤。烘烤结束后除施氮量0kg/亩处理外，各品种均按小区计产计质，各处理分别取中部叶混合样和上部叶混合样测定烟碱含量，同时各品种取c3f等级烟样进行评吸鉴定。试验过程中，在每个品种中选用施氮量6.5kg/亩的处理，选取均匀一致的5株烟进行定株，按生育进程采集根、茎、叶(成熟一片采一片)、顶和杈等进行杀青、烘干、称重，并分别测定其n含量，以施氮量0kg/亩处理为不施氮肥的空白对照，采用差减法测算各品种的氮利用率。此外，还将msk326/(msk326×cv87)f1、(msk326×cv87)f1、msk326和cv87烟苗移栽入黑胫病病圃和病毒病病圃，均采用随机区组设计，3次重复，每小区20株，以进行黑胫病和tmv抗性接种鉴定，同时田间调查气候斑点病发病情况。上述试验结果分别列于表7、表8和表9。
试验结果表明，嫁接改良烟株对黑胫病、tmv和气候斑点的抗性均较接穗品种msk326有明显改善。嫁接改良烟株的氮利用率也比接穗品种msk326明显提高，与作为砧木的(msk326×cv87)f1的氮利用率相近，又比砧木(msk326×cv87)f1的父本cv87的氮利用率有所降低。从经济性状来看，接穗品种在亩施氮量6.5kg时综合经济性状表现最好，但上部烟叶中烟碱含量超出适宜范围3.5％；而嫁接改良烟株在亩施氮量4.5kg时综合经济性状表现最好，且与接穗品种在亩施氮量6.5kg时的综合经济性状表现相当，此时中部叶和上部叶烟碱含量都处于适宜范围，接近最佳值2.5％，随着施氮量增加，嫁接改良烟株因烟叶落黄成熟变得困难而经济性状变差，上部叶烟碱含量也远离最佳值。从评吸质量来看，嫁接改良烟株与接穗品种msk326相当。由上可见，在保障烟叶品质风格和综合经济性状的情况下，嫁接改良烟株综合抗病性得到了改善，氮利用率得到了提高，而施氮量明显降低，上部叶烟碱含量也明显降低且更趋于适宜。
表7各品种的氮利用率与病情指数
表8各品种的不同施氮量经济性状表现与烟碱含量
表9各品种的评吸结果
实施例四：利用种质材料cv87改良烤烟品种ms云烟87
烤烟品种ms云烟87烟叶品质优良，深受卷烟工业喜爱，长期的田间表现情况观察和鉴定结果表明，烤烟品种ms云烟87中抗根茎类病害黑胫病，但易感叶面性病害tmv、pvy、赤星病和气候斑点病，田间表现极度耐肥，需氮量高，加之近些年来要求去除部分上部叶和部分下部叶，导致有效留叶数较少，进而造成上部烟叶烟碱含量偏高，工业可用性下降。而常规种质材料cv87根系非常发达，抗旱抗倒伏，兼抗根茎类病害黑胫病和叶面性病害tmv、pvy、赤星病和气候斑点病，但因氮肥利用率非常高而对氮肥非常敏感，不易烘烤，且烟叶中烟碱含量偏低。
在海南三亚南繁基地，同时种植烤烟品种ms云烟87和种质材料cv87，并于元月份盛花期以ms云烟87为母本，以cv87为父本进行杂交，得到杂交组合f1代种子，记作(ms云烟87×cv87)f1。
将得到的(ms云烟87×cv87)f1以及ms云烟87和cv87在恩施州利川育种基地育苗大棚内进行漂浮育苗，育苗基质按草炭与珍珠岩体积比为2﹕1配制，每m3基质加50％多菌灵可湿性粉剂200g，氮、磷、钾含量为15﹕15﹕15三元复合肥3kg，肥药混合均匀。2月21日播种(ms云烟87×cv87)f1，3月3日播种ms云烟87和cv87。按烟草漂浮育苗技术要求进行苗期管理。
各品种于播种后10-12天开始出苗。4月25-30日进行嫁接。砧木材料(ms云烟87×cv87)f1选取苗龄45-55天，茎高4.0-6.0cm，直径0.20-0.40cm的健壮无病的烟苗作为砧木。接穗品种ms云烟87选取苗龄40-50天，茎高3.5cm以上，直径0.15-0.25cm的健壮无病的烟苗作为接穗。在早上或下午采用合接法嫁接。去除砧木的生长点，从上向下斜切一刀，切面长为0.8-1.2cm；接穗切除根部并去除较大地叶片，仅保留1叶1心，然后在近子叶节处同样斜切一刀，切面长度与砧木切面长度保持一致；使用塑料套管嫁接，将砧木的切面朝上插进套管，再把接穗的烟苗切面朝下插进套管中，使砧木与接穗的切面紧紧贴合在一起。嫁接烟株记作ms云烟87/(ms云烟87×cv87)f1。
嫁接时注意嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人员的手需清洗干净。嫁接结束后，将嫁接烟株移入愈合养护室。前3天注意遮光，保温、保湿，控制空气湿度在80％以上，温度20-28℃。3天后通风和见光，控制空气湿度以接穗不萎蔫为基准，至完全愈合，7-10天后移出养护室，并去除塑料套管。
5月11日，将ms云烟87/(ms云烟87×cv87)f1、(ms云烟87×cv87)f1、ms云烟87和cv87一起移栽至大田，进行不同施氮量的小区比较试验。采用裂区试验设计，品种(ms云烟87/(ms云烟87×cv87)f1、(ms云烟87×cv87)f1、ms云烟87、cv87)为主处理，施氮量(0、2.5、4.5、6.5kg/亩)为副处理。其中施氮量6.5kg/亩为目前大田生产上ms云烟87正常施氮量，施氮量2.5kg/亩为cv87正常施氮量。各处理氮磷钾配比均为1∶1.5∶3。每小区种植80株，3次重复。行距和株距分别为120cm和60cm。四周设置保护行。其它栽植方法和大田管理按照当地烤烟生产技术要求进行。成熟摘叶采收，密集式烤房烘烤。烘烤结束后除施氮量0kg/亩处理外，各品种均按小区计产计质，各处理分别取中部叶混合样和上部叶混合样测定烟碱含量，同时各品种取c3f等级烟样进行评吸鉴定。试验过程中，在每个品种中选用施氮量6.5kg/亩的处理，选取均匀一致的5株烟进行定株，按生育进程采集根、茎、叶(成熟一片采一片)、顶和杈等进行杀青、烘干、称重，并分别测定其n含量，以施氮量0kg/亩处理为不施氮肥的空白对照，采用差减法测算各品种的氮利用率。此外，还将ms云烟87/(ms云烟87×cv87)f1、(ms云烟87×cv87)f1、ms云烟87和cv87烟苗移栽入黑胫病病圃和病毒病病圃，均采用随机区组设计，3次重复，每小区20株，以进行黑胫病和tmv抗性接种鉴定，同时田间调查气候斑点病发病情况。上述试验结果分别列于表10、表11和表12。
试验结果表明，嫁接改良烟株对黑胫病的抗性与接穗品种ms云烟87相当，但对tmv和气候斑点的抗性均较接穗品种有明显改善。嫁接改良烟株的氮利用率也比接穗品种ms云烟87明显提高，与作为砧木的(ms云烟87×cv87)f1的氮利用率相近，又比砧木(ms云烟87×cv87)f1的父本cv87的氮利用率有所降低。从经济性状来看，接穗品种在亩施氮量6.5kg时综合经济性状表现最好，但上部烟叶中烟碱含量超出适宜范围3.5％；而嫁接改良烟株在亩施氮量4.5kg时综合经济性状表现最好，且与接穗品种在亩施氮量6.5kg时的综合经济性状表现相当，此时中部叶和上部叶烟碱含量都处于适宜范围，接近最佳值2.5％，随着施氮量增加，嫁接改良烟株因烟叶落黄成熟变得困难而经济性状变差，上部叶烟碱含量也远离最佳值。从评吸质量来看，嫁接改良烟株与接穗品种ms云烟87相当。由上可见，在保障烟叶品质风格和综合经济性状的情况下，嫁接改良烟株综合抗病性得到了改善，氮利用率得到了提高，而施氮量明显降低，上部叶烟碱含量也明显降低且更趋于适宜。
表10各品种的氮利用率与病情指数
表11各品种的不同施氮量经济性状表现与烟碱含量
表12各品种的评吸结果