一种三倍体泥鳅的培育方法与流程

本发明属于水产科学领域，涉及一种三倍体泥鳅的培育方法。

背景技术：

大鳞副泥鳅(paramisgurnusdabryanus)与泥鳅(misgurnusanguillicaudatus)近缘，分别隶属于鲤形目(cypriniformes)、鳅科(cobitidae)的副泥鳅属(paramisgurnus)和泥鳅属(misgurnus)，外形相似且常常同域存在，广泛分布于中国大陆、台湾以及朝鲜半岛、日本、俄罗斯及印度等地。台湾泥鳅是大鳞副泥鳅的一种，其个体比泥鳅大，体近圆筒形，头较短。台湾泥鳅味道鲜美，营养丰富，含蛋白质较高而脂肪较低。与泥鳅相比，台湾泥鳅具有不钻泥、生长快、规格大、养殖周期短、易驯养、产量高等生产上的优势。

台湾泥鳅是我国常见的鲤形目鳅科的小型鱼类，多栖息于淤泥多的沟、渠和水田等浅水区，是一种杂食性底栖鱼类；生长适宜水温20～30℃，可用鳃、皮肤及肠进行呼吸，对低氧环境的抵抗力远胜于其他鱼类，是一种生产潜力较大的养殖品种。台湾泥鳅肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，有较高药用食疗价值。我国每年都大量出口泥鳅，尤其是日本、韩国需求量较大，每年出口约1万t，价值达2000万美元。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本专利第一方面提供了一种三倍体泥鳅的培育方法，所述培育方法包括如下步骤：

(a)取泥鳅精子和泥鳅卵子受精，形成受精卵；

(b)受精后2-4min采用35-50mpa的静水压休克处理1.5-5min优选3min所述受精卵；

(c)孵化所述受精卵，得到所述三倍体泥鳅。

在一些实施方式中，所述泥鳅选自台湾泥鳅。

在一些实施方式中，所述泥鳅精子是通过挤压成熟的雄性泥鳅的腹部得到的。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述泥鳅卵子的获取步骤为：

(1)所述雌性泥鳅胸鳍基部注射800-1200iu/kgbw绒毛膜促性腺激素和3-6μg/kgbw促黄体生成素释放激素类似物；

(2)使经注射的所述泥鳅在水中活动6-12小时；

(3)挤压所述泥鳅腹部获得所述泥鳅卵子。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述受精为干法受精。

在一些实施方式中，(b)受精后3min采用35、40、45或50mpa的静水压处理3min所述泥鳅受精卵。

在一些实施方式中，所述静水压操作步骤为：将所述激活的泥鳅受精卵与水混合放置在压力容器中，通过机械压力施加在压力容器上对所述激活的泥鳅受精卵与水施加所述静水压。

本发明第二方面提供了如本发明第一方面所述的培育方法在加快泥鳅育种步伐中的用途。

采用静水压法诱导结果显示：授精后3min，采用40mpa的静水压压力，休克处理3min，三倍体诱导率最高，达到35.6％。采用流式细胞仪和染色体制备检测了三倍体鱼苗细胞dna含量和染色体数目，结果显示：三倍体鱼苗细胞dna含量为二倍体对照组鱼苗的1.5倍；二倍体鱼苗的染色体数为2n＝48条，三倍体鱼苗的染色体数为3n＝72条。三倍体台湾泥鳅生长迅速。

附图说明

图1三倍体(下图)与二倍体(上图)台湾泥鳅的dna含量分布图。

图2为二倍体(a)和三倍体(b)台湾泥鳅幼鱼染色体分析图。

图3三倍体(下图)与正常二倍体个体(上图)台湾泥鳅的形态特征照片。

图4三倍体(上图)与正常二倍体个体(下图)台湾泥鳅的卵巢发育特征照片。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

本研究采用静水压法，对台湾泥鳅三倍体最佳诱导条件进行摸索并比较分析这两种方法(常用的热休克方法(39-42摄氏度处理2分钟)不适合台湾泥鳅，成活率在5％以下)诱导效果的差异，同时，采用流式细胞仪鉴定了三倍体和二倍体鱼苗细胞dna含量，采用染色体分析技术分析了三倍体鱼苗的染色体数量，证实了该技术的可行性，旨在探讨和完善台湾泥鳅三倍体的人工诱导方法，以期为台湾泥鳅三倍体的人工诱导和实际生产提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料

试验用鱼为台湾泥鳅(台湾泥鳅为大鳞副泥鳅的一种，在我国多分布于长江中下游和台湾岛西北部的浅滩河流，大鳞副泥鳅(misgurnusanguillicaudatus)属鲤形目,鳅科,泥鳅属。)，挑选体重在1000g左右，体型良好，性成熟且发育良好的个体，采用一次性胸鳍基部注射，混合使用绒毛膜促性腺激素(hcg)和促黄体生成素释放激素类似物(lhrh-a2)催产，剂量为1000iuhcg+5μglhrh-a2/kg体重，将已经注射过催产药物的雌鱼放在圆形的产卵池中，微流水刺激，10h后拉网起捕亲鱼，采用人工挤压腹部的方法获得卵子；雄性台湾泥鳅注射剂量减半(剂量为500iuhcg+2.5μglhrh-a2/kg)。缓慢挤压成熟的雄鱼的腹部，将挤出的干净白色精液。

1.2诱导方法

静水压诱导：所述静水压是通过对受精卵水溶液实现的，是通过对水溶液施静水压从而抑制受精卵第二极体排出实现，而不是直接压受精卵。水温为23±1℃，人工采集成熟的卵子和精液，干法受精后3min，分别将受精卵与曝气自来水混合放置在压力容器中，用活塞塞入压力容器口，然后放入压力机，在15秒内加压到相应压力(40mpa、45mpa、50mpa、55mpa和60mpa)，处理3min后再5秒钟内泄压至零，抑制第二极体的排出，使卵子的染色体加倍，共5个试验组，每组2个平行，分别在不同的孵化桶里孵化，每隔1～2h清洗1次孵化桶过滤网，直至出苗。通过计算每个试验组合的正常出苗率和三倍体诱导率，来确定合适的处理压力。

同时设置二倍体对照组(台湾泥鳅♀×♂)(对照就是人工受精孵化，不做静水压诱导处理)。

1.4.1dna含量测定

取5月龄休克诱导处理的台湾泥鳅幼鱼，用肝素钠溶液浸润过的1ml注射器，尾静脉抽血大约0.2ml，加入含1mlpbs的ep管中，混匀，1000rpm离心5min，弃上清，用pbs重复清洗沉淀2次，加入1ml预冷(4℃)的pbs-乙醇固定液，分散细胞，置于4℃冰箱过夜固定18h，1000rpm离心5min，弃上清，加入400μlpbs溶液，混匀，分别加入50μlpi染液和rnase溶液，处理30min，采用bdaccuri^tmc6型流式细胞仪进行检测。选用鸡血细胞(dna含量2.30pg)作为对照标准，进行台湾泥鳅三倍体dna含量测定。三倍体检出个体数与总检测个体比值数即为三倍体诱导率。

1.4.2染色体制备

将倍性分析仪检测出的三倍体台湾泥鳅和正常二倍体台湾泥鳅鲂分别在水族箱禁食暂养3天。按照10μg/g(鱼的体重)的剂量在其胸鳍基部注射pha，22h后按照4μg/g(鱼的体重)剂量注射秋水仙素，4h后剪断鱼两侧鳃耙进行放血，15min后，取其头肾，放于盛有鱼用生理盐水(0.75％)的小玻璃烧杯中，洗去其表面的血液，再加4～6ml生理盐水反复撕扯，使淋巴细胞充分释放；用300目的筛网将悬浮液过滤到6ml玻璃离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液；加入6ml0.5％的kcl溶液(现用现配，37℃恒温箱预热)，37℃低渗50min，1000rpm离心5min，弃上清液；加入6ml固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)(现用现配，-20℃冰箱预冷)，20min后，1000rpm离心5min，弃上清液，再以同样方法重复固定、离心2次；最后，剩余1～2ml固定液充分混匀后进行滴片，室温或37℃烘箱干燥1h，贝索吉姆萨染色液染色，超纯水冲洗，干燥后即可在显微镜下拍照、计数。

1.5数据分析

运用spss软件统计各个组诱导鱼苗出苗率和三倍体率，并进行单因素方差分析(one-wayanova)，利用最小显著极差法(leastsignificantdifference，lsd)对各个诱导组间的数据进行多重比较。

2结果

2.1静水压诱导

如表1所示，不同处理压力，静水压诱导台湾泥鳅受精卵的出苗率有显著差异(p<0.01)，随着压力的增加，鱼苗出苗率呈下降趋势。由不同压力对台湾泥鳅三倍体诱导率的影响可知(表1)，40mpa和45mpa休克处理对台湾泥鳅出苗率影响差异不明显。两组的三倍体诱导率差异显著(p<0.01)，40mpa静水压诱导台湾泥鳅三倍体率为85.6％，45mpa静水压诱导台湾泥鳅三倍体率为40.2％(表1)。综合考虑出苗率和诱导率2个因素，静水压诱导台湾泥鳅三倍体在受精后3min，40mpa压力下休克3min时效果最好。

表1静水压压力对台湾泥鳅三倍体诱导影响

2.2台湾泥鳅三倍体鱼苗dna相对含量的测定

经检测，三倍体台湾泥鳅dna含量是正常二倍体台湾泥鳅亲本dna含量的1.5倍。

三倍体台湾泥鳅取样30尾，用德国partec公司的cyflow倍性分析仪进行dna含量检测。三倍体台湾泥鳅的相对dna含量为50.15±2.42(n＝30尾)(图1上图所述)，而正常二倍体台湾泥鳅亲本dna含量为33.43±1.15(n＝30尾)(图1下图所示)。与鸡红细胞标准进行计算，得出三倍体台湾泥鳅血细胞dna绝对含量为3.90±0.05pg(m±sd)；正常个体台湾泥鳅为2.60±0.02pg(m±sd)。结果显示三倍体台湾泥鳅dna含量是正常二倍体台湾泥鳅亲本dna含量的1.5倍。

2.3台湾泥鳅三倍体鱼苗染色体分析

对流式细胞仪检测得到的正常二倍体、三倍体台湾泥鳅，分别制作染色体，结果如图2。由结果可知，台湾泥鳅二倍体鱼苗的染色体数目为2n＝48条(如(a)所示)；而经过休克处理的三倍体鱼苗的染色体数目为3n＝72条(如(b)所示)，此结果与倍性分析仪检测结果一致；核型分析结果显示，正常二倍体台湾泥鳅的核型公式为2n＝24m+20sm+4st，nf＝92；三倍体台湾泥鳅核型公式为3n＝36m+30sm+6st，nf＝138。正常台湾泥鳅共有两套染色体组，每套染色体组包含24条染色单体；而三倍体台湾泥鳅具有三套染色体组，比正常二倍体台湾泥鳅相比，多一套染色体组。

2.4台湾泥鳅三倍体的生长特征

经我们对3龄成年台湾泥鳅抽样统计，进行体长和体重的测量，结果显示三倍体台湾泥鳅的平均体长为20.3±5.6cm，体重为88.6±10.7g(体3下图)，而正常个体(n＝200尾)体长为15.5±3.5cm，体重为18.2±5.1g(图3上图)。三倍体台湾泥鳅个体显著大于正常二倍体个体，生长性能突出(图3)。通过解剖性腺，正常二倍体个体大小的台湾泥鳅的性腺发育正常(图4下图)，而三倍体台湾泥鳅的性腺(包括精巢和卵巢)发育不良，卵巢为线状，没看见成熟卵子(图4上图)。

经统计，三倍体台湾泥鳅平均体长为20.3cm，平均体重为88.6g，而正常二倍体个体平均体长为15.5cm，平均体重为18.2g，三倍体台湾泥鳅生长性能突出。三倍体台湾泥鳅性腺发育的较为低下，可将性腺发育能量或营养用于生长和肉质改良，因此三倍体台湾泥鳅在生长方面具有优势。

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。