本发明涉及水产生物育种技术领域，具体地涉及陆封型马苏大麻哈鱼的三倍体苗种的育苗方法。
背景技术：
马苏大麻哈鱼(oncorhynchusmasou)，属鲑科(salmonidas)、大麻哈鱼属，是仅分布在北太平洋亚洲一侧水域的溯河洄游性鱼类，在我国分布于图们江、绥芬河和台湾的大甲溪中。幼鱼在淡水生活期间，分化成降海型和陆封型两个生态群体。陆封型群体2年性成熟，秋季繁殖，一般个体100-200g，终生生活在淡水河流中，不营降海洄游，但参与洄游群体的繁殖，对马苏大麻哈鱼种群繁衍发挥重要的作用。国产陆封型马苏大麻哈鱼口味鲜美，具有很高的知名度，近几年进行了人工繁殖和养殖技术研究，表现出生长速度快、易驯化、抗病力强等优点，很有养殖前途。由于个体小，在原产地人工养殖2年一般体重250g左右，但性成熟后亲鱼绝大部分死亡，影响了规模化生产的推广。
三倍体鱼因染色体组成不平衡，性腺不能发育成熟，用于性腺发育的能量可全部用于生长，避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降、生长停滞和亲鱼死亡率上升。人工诱导的三倍体鱼具有不育、个体大、生长快、寿命长、肉质好、成活率高等优良品质。三倍体鱼是解决鲑科鱼类普遍存在的生物学死亡的有效办法，全世界生产的大型鲑科鱼类如大西洋鲑、虹鳟等普遍都是三倍体鱼。
目前，鱼类的三倍体育种技术主要采用物理方法和化学方法，生物方法在工厂化养殖过程中可操作性较差。物理方法的原理是抑制受精卵的第二次成熟分裂或第二极体的排出，主要包括温度休克法和静水压法，物理方法必须严格控制处理的起始时间和持续时间。化学方法的原理是影响纺锤丝内微管的形成，从而抑制减数分裂或有丝分裂纺锤体的正常收缩，导致第二次成熟分裂不排出第二极体，主要采用秋水仙素和细胞松弛素b。
现有技术中均未见对马苏大麻哈鱼三倍体育苗方法的报道，该领域存在空白。另一方面，化学方法诱导成功率要比物理学方法低，生物学方法操作复杂、耗时，且试验材料(受精卵)能用于试验处理的数量也受到限制，所以实践中应用化学和生物方法的不多。
虽然马苏大麻哈鱼和虹鳟、红点鲑、细鳞鲑等都属鲑科鱼类，但在热休克诱导条件的选取上，各种鱼类之间仍存在很大差异。例如在诱导时间方面，由于鲑科鱼类第二极体的排放一般在受精后15-40min，时间跨度很大。有研究表明虹鳟在受精10-20min、细鳞鲑在受精15-25min、美洲红点鲑在受精25-30min基础上可进行诱导，由此可现鲑科鱼类之间的热休克诱导时间差异性比较显著；同样，在诱导温度方面，很多研究表明鲑科鱼类的热休克温度是在24℃到32℃之间，但有试验发现在虹鳟热休克诱导过程中26和26.5℃之间也有差异，这0.5℃的温差也会对最终结果造成影响。
因此，在目前未有对马苏大麻哈鱼进行三倍体诱导试验报道的情况下，对热休克诱导条件的选择仍然是存在于马苏大麻哈鱼进行三倍体诱导技术领域的主要瓶颈，不可简单模仿其他冷水鱼的诱导方式和条件。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种陆封型马苏大麻哈鱼三倍体苗种育苗方法，以克服现有技术的不足。
本发明通过热休克法对马苏大麻哈鱼进行三倍体苗种的制备，通过不同实验组的参数设置，筛选出综合性能最佳的诱导条件。
具体地，本发明提供的陆封型马苏大麻哈鱼三倍体苗种的育苗方法，包括以下步骤：
((1)将陆封型马苏大麻哈鱼雌、雄亲鱼的卵子和精子采用干法受精；
(2)热休克法处理受精卵；
(3)降温处理受精卵；
(4)受精卵在孵化容器中流水孵化。
本发明提供的育苗方法中，步骤(1)所述干法受精是陆封型马苏大麻哈鱼雌、雄亲鱼数量配比为5:3，人工采卵、取精；将雌鱼的卵和雄鱼的精液混合，15-20s后清洗杂质，加入清水静置，得受精率。
优选地，繁殖季节为秋季。挑选符合要求的雌雄亲鱼；1+龄鱼经过1个冬季越冬，培育至秋季达到2+龄；最小体质量：♀500g，♂250g；挑选副性征明显、性腺发育好的雌雄亲鱼：性成熟雄鱼吻部变成鹰嘴状，上下颌成钳形，体侧出现暗红色斑，后期腹部发黑，颜色越来越重，腹部狭窄，挤压后腹部可流出乳白色精液。雌鱼吻部平直不成钳形，腹部白色且圆润，后期体侧也变黑但较雄性色浅，生殖孔红肿外凸。
采卵受精过程避免阳光直射，擦干鱼体和盛卵盆，避免淋入水；人工挤卵或剖腹采卵入盛卵盆中；盛卵盆为里面套一个漏眼盆的塑料盆，直径30cm左右；用漏眼盆过滤掉体腔液后，将卵倒入干净的盛卵盆中。人工采卵时控制盛卵容器内水体的水温6-8℃。
本发明提供的的育苗方法所述步骤(2)热休克法处理方法为：鱼卵受精15-20min后，将受精卵迅速移入24-30℃水体中处理15-20min。
优选地，所述步骤(2)热休克法处理方法为：鱼卵受精15-18min后，将受精卵迅速移入26-28℃水体中处理17-20min。
更优选地，所述步骤(2)热休克法处理方法为：鱼卵受精15min后，将受精卵迅速移入28℃水体中处理20min。
在本发明的一个实施例中，热休克处理是在不锈钢水槽中进行。不锈钢水槽具备电子控温、恒温和微循环功能，水温误差<0.5℃，灵敏度0.1℃；热休克处理前用精密温度计矫正水温；受精后15-20min，将受精卵放入直径15cm的不锈钢漏罐(可选择调料包)中，置入水温28℃的不锈钢水槽中，持续15-20min。
本发明提供的育苗方法所述步骤(3)降温处理方法为：将步骤(2)热休克法处理后的受精卵迅速移入6-8℃水体中。移入水体后，本领域技术人员可参照常规操作检查并检测受精率的死亡率，通常该过程时间为1-2h，挑出死卵；捡卵后把受精卵放入孵化器中孵化。
步骤(4)受精卵的孵化条件为5-10℃水体孵化40-60天，溶解氧>5mg/l。整个孵化期积温350-390度·日。
所述水体为符合国家渔业水质标准的孵化用水。
本发明的实施例中，孵化操作为，采用虹鳟孵化常用的孵化桶+玻璃钢平列槽孵化方法；发眼前在孵化桶中孵化，每周用50mg/l浓度甲醛流水处理1小时，控治水霉菌；发眼后将受精卵倒入小平列槽(45cm×30cm)中，挑出死卵；控制孵化水温稳定在5-10℃，溶解氧＞5mg/l；整个孵化期积温需要350-390度·日，约40-60天。
孵化后还包括稚鱼驯化和鱼苗培育过程，具体操作为以下：
稚鱼驯化：驯化摄食人工配合饵料。在受精卵孵化的大玻璃钢平列槽(45cm×250cm)中流水进行；仔鱼上浮超过80％后，投喂进口鲑鳟鱼开口料(微粒子饲料，粗蛋白含量≥60％)，间隔2-3h/1次，日投饵率10％；每次投喂前用吸管吸除残饵、粪便和死鱼。
鱼苗培育：在室内玻璃钢槽(45cm×200cm)或盆(直径200cm)中流水培育至体质量5g或体长5cm；投喂进口鲑鳟鱼料或国产鲑鳟鱼饲料，每日投喂4-5次，日投饵率8％。每次投喂前用吸管吸除残饵、粪便和死鱼。
随后对育苗倍性检测，检测dna含量，确定倍性。鱼苗培育至体长5-10mm，随机抽样30尾，普通二倍体3尾作为对照，活体经麻醉后尾静脉采血，用pacfeccyfiowcube8流式细胞仪检测血液dna相对含量，计算三倍体率。
本发明提供了上述育苗方法在培育个体大、寿命长、肉质好、成活率高、生长速度快、抗病力强的陆封型马苏大麻哈鱼中的应用。
本发明将陆封型马苏大麻哈鱼雌、雄亲鱼的卵子和精子采用干法受精，将受精卵热休克处理后，入水体中孵化40-60天，受精卵孵化出仔鱼。孵化期间受精卵发眼率高达93.84％，苗种孵化率达到60.92％以上，得到的仔鱼经流式细胞仪检测，三倍体率为52.28％-78.81％。本发明提供的陆封型马苏大麻哈鱼三倍体苗种的育苗方法避免了陆封型马苏大麻哈鱼性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降、生长停滞和亲鱼死亡率上升等问题，在生长速度和抗病能力上明显优于二倍体陆封型马苏大麻哈鱼，具有较好的经济效益和市场价值，有利于在实际养殖过程中进行三倍体苗种的示范推广。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明的陆封型马苏大麻哈鱼雌鱼、雄鱼均来自(图们江支流密江河畔的吉林延边马苏大麻哈水产良种场。国产鲑鳟鱼饲料购自北京汉业科技有限公司的虹鳟鱼专用饲料，进口鲑鳟鱼微粒子饲料购自青岛越洋公司的丹麦aller(爱乐)鲑鳟鱼饲料。孵化用的桶就是市售的普通无毒塑料桶，容积5l。
本发明实施例的亲鱼选择原则为：繁殖季节为秋季，挑选符合要求的雌雄亲鱼；1+鱼经过1个冬季越冬，培育至秋季达到2+龄；最小体质量：♀500g，♂250g；挑选副性征明显、性腺发育好的雌雄亲鱼：性成熟雄鱼吻部变成鹰嘴状，上下颌成钳形，体侧出现暗红色斑，后期腹部发黑，颜色越来越重，腹部狭窄，挤压后腹部可流出乳白色精液。雌鱼吻部平直不成钳形，腹部白色且圆润，后期体侧也变黑但较雄性色浅，生殖孔红肿外凸。
本发明实施例采用的热休克处理方式是在不锈钢水槽中进行。不锈钢水槽具备电子控温、恒温和微循环功能，水温误差<0.5℃，灵敏度0.1℃；热休克处理前用精密温度计矫正水温。
实施例1陆封型马苏大麻哈鱼三倍体苗种的育苗方法
1、人工采卵受精采用干法受精。采卵受精过程避免阳光直射，擦干鱼体和盛卵盆，避免淋入水；人工挤卵或剖腹采卵入盛卵盆中；盛卵盆为里面套一个漏眼盆的塑料盆，直径30cm左右；用漏眼盆过滤掉体腔液后，将卵倒入干净的盛卵盆中。雌雄配比为5:3，每盆一次采5条雌鱼的卵，挤入3条雄鱼的精液，轻轻搅拌均匀，加入鱼池同温度水，15-20s后，用清水冲洗掉血块、卵皮和过多的精液，加入清水静置，得受精卵；其中人工采卵时控制水温稳定在6-8℃。
2、热休克处理：在不锈钢水槽中进行。不锈钢水槽具备电子控温、恒温和微循环功能，水温误差<0.5℃，灵敏度0.1℃；热休克处理前用精密温度计矫正水温；受精后15-20min，将受精卵放入直径15cm的不锈钢漏罐(可选择调料包)中，置入水温28℃的不锈钢水槽中，持续15-20min。
3、赐除死卵：热处理达到时间后即刻将受精卵放入装有与采卵水温相同水的容器中，静置2h检出死卵；对照组受精后放入相同条件容器中，与热处理卵同时挑选死卵；捡卵后放入相同孵化器中孵化。
4、孵化管理：流水孵化，采用虹鳟孵化常用的孵化桶+玻璃钢平列槽孵化方法；发眼前在孵化桶中孵化，每周用50mg/l浓度甲醛流水处理1小时，控治水霉菌；发眼后将受精卵倒入小平列槽(45cm×30cm)中，挑出死卵；控制孵化水温稳定在5-10℃，溶解氧＞5mg/l；整个孵化期积温需要350-390度·日，约40-60天。
5、稚鱼驯化：驯化摄食人工配合饵料。在受精卵孵化的大玻璃钢平列槽(45cm×250cm)中流水进行；仔鱼上浮超过80％后，投喂进口鲑鳟鱼开口料(微粒子饲料，粗蛋白含量≥60％)，间隔2-3h/1次，日投饵率10％；每次投喂前用吸管吸除残饵、粪便和死鱼。
6、鱼苗培育：在室内玻璃钢槽(45cm×200cm)或盆(直径200cm)中流水培育至体质量5g或体长5cm；投喂进口鲑鳟鱼料或国产鲑鳟鱼饲料，每日投喂4-5次，日投饵率8％。每次投喂前用吸管吸除残饵、粪便和死鱼。
7、倍性检测：检测dna含量，确定倍性。鱼苗培育至体长5-10mm，随机抽样30尾，普通二倍体3尾作为对照，活体经麻醉后尾静脉采血，用pacfeccyfiowcube8流式细胞仪检测血液dna相对含量，计算三倍体率。
以下实施例围绕受精率热休克的方法选择不同的参数进行效果验证。
实施例2受精卵在受精后15min采用不同时间热休克处理的受精率2h死亡率、孵化率、三倍体率
受精卵在受精后15min，热休克处理温度26℃和28℃条件下，持续处理20min组的受精卵2h死亡率分别为0.14％和1.26％低于持续处理15min组的死亡率(0.43％和1.33％)，说明持续处理时间20min效果好于15min。
而26℃和28℃条件下，持续处理20min组的26℃的孵化率和三倍体率是49％和36.7％；28℃的孵化率和三倍体率是60.92％和53.1％，28℃的综合效果更好，可见热休克处理20min组的孵化率和三倍体率显著高于持续处理15min组(41.34％、23.3％和47.5％、46.7％)。
实施例3受精卵在受精后20min采用不同时间热休克处理的受精率2h死亡率、孵化率、三倍体率
温度26℃和28℃条件下，在受精后20min，持续处理20min组的2h死亡率分别为1.74％和1.58％高于持续处理15min组(分别为1.21％和0.79％)，同时也高于实施例2的受精后15min温度26℃和28℃条件下的处理20min组(0.14％和1.26％)；26℃条件下，受精后20min，持续处理20min的孵化率和三倍体率分别为39.4％和33.3％；28℃条件下，受精后20min，持续处理20min的孵化率和三倍体率分别为34.02％和54.8％。
26℃条件下，受精后20min，持续处理15min的孵化率和三倍体率分别为60.55％和33.3％；28℃条件下，受精后20min，持续处理15min的孵化率和三倍体率分别为50.53％和56.5％。
26℃条件下，受精后15min，持续处理20min的孵化率和三倍体率分别为49％和36.7％；28℃条件下，受精后15min，持续处理20min的孵化率和三倍体率分别为60.92％和63.1％)。说明受精后15min进行热休克处理的效果好于受精后20min。
实施例4
热休克处理对受精卵发眼率影响较小，实验组发眼率都在80％左右，最高为93.84％，与对照组(对照组为未进行热休克处理的组)(83.45％)接近。
实施例5
热休克处理对受精卵的成活影响较大，孵化率随处理温度的升高而降低。26、28、30℃均有4个试验组，处理方式分别为：(1)受精后15min、热休克持续处理15min；(2)受精后15min、热休克持续处理20min；(3)受精后20min、热休克持续处理15min；(4)受精后20min、热休克持续处理20min。
最高的是24℃组(68.35％)，最低的是30℃组(1.95％)。26℃和28℃组孵化率也只有50％(34.02-60.92％)左右，明显低于对照组(86.62％)。30℃组平均孵化率只有6.8％，说明30℃是诱导的极限温度。孵化率是统计了各个温度条件下的指标，24℃是68.35％，26℃条件下各实验组的孵化率为41.34％、49.00％、60.55％、31.40％，28℃条件下各实验组的孵化率为47.50％、60.92％、50.53％、34.02％，30℃条件下各实验组孵化率为12.46％、8.04％、4.74％、1.95％。
实施例6
26、28、30℃均有4个试验组，处理方式分别为：(1)受精后15min、热休克持续处理15min；(2)受精后15min、热休克持续处理20min；(3)受精后20min、热休克持续处理15min；(4)受精后20min、热休克持续处理20min。
三倍体率随处理温度升高而提高，最高为90.91％。平均三倍体率：24℃组13.3％，26℃组31.65％，28℃组52.28％，30℃组78.81％。
实施例7
试验鱼尾静脉采血后，经流式细胞仪检测分析，马苏大麻哈鱼二倍体dna相对含量为33，三倍体dna相对含量为51。
实施例8
综合上述实施例，经对起始处理时间和持续处理时间进行筛选后，按孵化率占60％，三倍体率占40％综合评分标准，本实验条件下，马苏大麻哈鱼三倍体诱导的最佳条件是：水温28℃，卵子受精后15min持续处理20min，发眼率72.57％，孵化率60.92％，可获得53.1％的三倍体鱼。
上述最佳条件下的综合评分结果是57.79，其它各组综合评分为32.65-49.45，均不超过50。(评分方法参考gervaij,peters,nagya,etal.inducedtriploidyincarp,cyprinuscarpiol[j].jfishbiol,1980,17(6):667-671.和陈春山，魏凯，韩姝伊，等.热休克诱导细鳞鲑三倍体的初步研究[j]淡水渔业，2018,48(6)：3-11.)
本实施例对另外一种鲑科鱼类——哲罗鲑进行了热休克诱导试验中，参考本发明的马苏大麻哈鱼的最优试验参数，结果各实验组26℃和28℃条件下分别设4个试验组，顺序为(1)受精后15min、热休克持续处理15min；(2)受精后15min、热休克持续处理20min；(3)受精后20min、热休克持续处理15min；(4)受精后20min、热休克持续处理20min。三倍体诱导率均不超过15％，可见每一种鱼仍需要对3个诱导指标(受精后时间、诱导温度和诱导持续时间)进行大量细致的组合试验，才能获得最佳的诱导条件。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。