将经渗析的金纳米星添加到乙醇（添加有共振拉曼染料、TEOS以及 氨）中并且使其反应1小时。通过离心（3,500Xg，15min)分离粒子并且用乙醇洗涤。为 了实现PEG化，通过在72°C下，在含有1% (v/v)MPTMS的乙醇中加热经二氧化硅涂布的纳 米星持续1小时用硫氢基修饰二氧化硅表面。用乙醇洗涤纳米星以除去MPTMS并且再次 分散于含有1 % (w/v)甲氧基封端的（m)PEG2qqq-顺丁烯二酰亚胺的IOmM MES缓冲剂（pH 7.1)中。使顺丁烯二酰亚胺-mPEG2_与经硫氢基修饰的二氧化硅表面在环境条件下反应 2小时。洗涤PEG化共振拉曼活性纳米星并且再次分散于过滤灭菌的IOmM MES缓冲剂（pH 7.3)中并且在注射之前储存在4°C下。合成粒子在图1中说明。
[0164] SE(R)RS粒子在以下数个方面是独特的：1)其具有全世界所报道的任何类似粒子 的最高检测灵敏度。2)其允许观察肿瘤而不需要特异靶向其表面上的部分，这依赖于"增强 的渗透率和滞留"（EPR)效应。3)其具有独特的"指纹"拉曼光谱，允许具有明确特异性的 检测。4)其将全身3D成像方法与最佳识别肿瘤边缘的超高灵敏度检测方法进行组合。5) 其稳定地截留在肿瘤内，允许用单次静脉内注射进行手术前分期以及手术期间的切除。6) 非常类似的金-二氧化硅基粒子的严格毒性评估已发现其在活体内是安全的。
[0165] 实例2:特性描述
[0166] 超高灵敏度：如图2中所示，在实例1中合成的SE (R) RS粒子通过透射电子显微法 (TEM JEOL 1200EX ;USA)、尺寸分布来表征，并且通过纳米粒子示踪分析（NTA ;Nanosight， UK)来测定浓度。在配备有300mW 785nm (近IR)二极管激光器和1吋电荷偶合装置检测器 (光谱分辨率为I. 07CHT1)的雷尼绍InVIA拉曼显微镜上测定等摩尔量的粒子的拉曼活性。 用WiRE 3. 4软件（雷尼绍，UK)分析拉曼光谱。
[0167] 纳米粒子示踪分析（NTA):如图3中所示，通过NTA测定水中IpM粒子的尺寸分布。
[0168] 实例3 :动物测试
[0169] 参考图4到10,用在实例1中合成的150uL 2. 5nM SE(R)RS粒子注射带有肿瘤的 小鼠（去分化脂肉瘤模型、PyMT-MMTV (fvb)转基因乳癌模型、Hi-MYC转基因前列腺癌模型、 RCAS/TV-a转基因神经胶瘤模型）。18小时后或更迟处死动物，并且在上文所描述的系统上 扫描拉曼活性。采集肿瘤、器官和淋巴结并且另外进行活体外成像并且随后嵌入蜡。处理 嵌入组织以便于组织学观察（H&E染色、肿瘤标记物染色、巨噬细胞染色）。
[0170] 参考图11到16，MPR_纳米星用于检测具有组织学相关性的小鼠体内的结肠癌、前 列腺癌以及乳癌。实验进一步说明MPR-纳米星在广泛多种不同癌症模型中的用途。
[0171] 活体内-活体外多模式MRI-拉曼-组织学相关性：我们将表明SE (R) RS粒子能够 可靠地描绘肿瘤的存在并且在三个不同异种移植小鼠肉瘤模型（每个模型η = 5)中具有 细微精确度。植入于这些小鼠模型中的细胞来源于实际人类肿瘤。1号小鼠模型将为去分 化脂肉瘤模型，2号小鼠模型为粘液纤维肉瘤模型并且3号小鼠模型为多形恶性纤维组织 细胞瘤（FMH)模型。已知所有3种模型都会产生局部肿瘤浸润以及环绕原发肿瘤的卫星微 小转移灶。已知2号和3号模型还会产生到肺脏和骨骼的癌转移，并且我们还将评定我们的 方法检测这些远距离癌转移的能力。我们将用SE(R)RS粒子（150 μ 1，5ηΜ)静脉内注射带 有肿瘤的小鼠；在24小时之后进行MRI ;随后处死动物并且使用大切片机（与MRI具有相 同片层厚度）进行全身组织学切片；随后用我们现有的拉曼显微镜（雷尼绍）使这些片层 成像；以及最后在组织学上处理相同的片层（Η&Ε染色、肿瘤标记物染色、巨噬细胞染色）。 这将允许我们评定这一多模式SE(R)RS粒子方法的精确度，因为我们将能够对相同片层进 行拉曼信号与MRI信号的比较；并且评定如组织学所证明的肿瘤细胞的存在。
[0172] 小鼠中的生物分布和剂量发现研宄：我们将使用标记有PET示踪剂（锆-89,89Zr) 的SE (R) RS粒子进行活体内PET-CT研宄。用89Zr标记SE (R) RS粒子将与在MSKCC的路易 斯（Lewis)实验室合作进行。89Zr-SE(R)RS粒子将被静脉内注射入带有肉瘤的小鼠（以上 每一肿瘤类型η = 3)中并且动态PET-CT成像在0小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12 小时、18小时、24小时、48小时、5天、7天、10天以及14天进行。PET数据将提供Α)肿瘤内 的SE (R) RS粒子的准确浓度以允许计算目标3所使用的粒子剂量，并且B)测定SE (R) RS粒 子肿瘤内积聚和滞留的动力学。
[0173] 在患有骨肉瘤的狗中测试拉曼导引肉瘤手术：我们将表明可以如何使用SE(R) RS粒子和手持式拉曼检测器在大型动物中切除肉瘤。手持式扫描仪的规格非常类似于我 们的雷尼绍台式拉曼显微镜，包括使用在近红外（785nm)具有相同波长和相同激光功率 (300mW)的激光器。手持式粒子可以直接靠着相关组织固持，当其检测我们的SE(R)RS粒子 时用声音（或光学信号，若需要）指示。
[0174] 这一目标将与位于曼哈顿62号大街的动物医疗中心（Animal Medical Center， AMC) (http: //www. amcny. org)合作讲行。这一动物诊所为通常对动物进行手术（包括肉瘤 手术）的高度专业化机构。骨肉瘤在狗中的发病率较高，并且因此将存在足够数目的此类 患病狗，其中属主将同意手术与我们的成像引导方法一起进行。
[0175] 我们会将呈目标2中所测定的浓度的SE(R)RS粒子静脉内注射入狗体内（η = 10)。24小时之后，将用异氟烷麻醉来麻醉动物。在动物的无菌准备之后，肿瘤将以手术方式 暴露并且可以明确由外科医生用肉眼识别的肿瘤块体将被切除。当切除进行到靠近肿瘤边 缘时，将使用手持式拉曼粒子来验证残余肿瘤的存在并且搜索手术床中局部微小转移灶的 存在。如果SE(R)RS粒子仍存在，那么拉曼扫描仪将用"哔哔"的声音通知外科医生（参见 图17)。随后切除将继续进行直至切除所有拉曼阳性病灶；将传送切除的组织标本以供病 理学评估（组织学和肿瘤标记物）。随后，将切除另一块5cm边缘的组织（大概无肿瘤）并 且同样将其传送以供病理学评估，从而验证拉曼导引手术实际上能够移除所有肿瘤细胞。
[0176] 其它实施例和等效物
[0177] 所属领域的技术人员顶多使用常规实验即可识别或能够确定本文所描述的本发 明的特定实施例的许多等效物。本发明的范围不打算限于上述【具体实施方式】，而是如随附 权利要求书中所阐述。
【主权项】
1. 一种组合物，其包含： 纳米级核屯、； 连于所述核屯、上的多个覆盖剂实体； 外部密封剂层；W及 多个渗杂剂实体，所述渗杂剂实体分布于选自由W下组成的群组的位置处：所述纳米 级核屯、之上或之内、覆盖剂实体之上或之间、所述密封层之上或之内，W及其组合。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中渗杂剂实体分布于所述核屯、上的覆盖剂实体之 间或之中。
3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述渗杂剂实体中的至少一些在所述密封 剂层内。
4. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述渗杂剂实体中的至少一些安置在所述纳米 级核屯、表面的lOnm范围内。
5. 根据权利要求1到4中任一权利要求所述的组合物，其中所述渗杂剂实体为SEW RS-活性剂。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物的检测阔值为20fM或低于20fM。
7. 根据权利要求1到6中任一权利要求所述的组合物，所述组合物实质上不含表面底 涂剂。
8. 根据权利要求1到7中任一权利要求所述的组合物，其中所述纳米级核屯、为非球形。
9. 根据权利要求1到8中任一权利要求所述的组合物，其中所述纳米级核屯、为金属或 合金或包含金属或合金。
10. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述金属选自由W下组成的群组：金、银、铜或 能够维持局部表面等离子共振的任何其它材料，W及其组合。
11. 根据权利要求1到10中任一权利要求所述的组合物，其中所述密封剂包含选自由 二氧化娃、二氧化铁、氧化错、氧化错、氧化侣或其组合组成的群组的氧化物。
12. 根据权利要求1到11中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含一或多种试剂。
13. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述一或多种试剂选自由MRI试剂、阳T试 剂、S阳CT试剂、CT试剂或其组合组成的群组。
14. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述MRI试剂选自；Gd盐、氧化铁、顺磁CEST 试剂W及其组合。
15. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述一或多种试剂直接连于所述密封剂表面 上。
16. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述一或多种试剂通过连接子间接连于所述 密封剂表面上。
17. 根据权利要求1到16中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物的直径为约 Inm到约lOnm或约lOnm到约300nm。
18. -种将密封剂层施加到纳米级核屯、上的方法，所述方法包含W下步骤： 提供覆盖组合物，其包含： 纳米级核屯、，其实质上涂布有： W可移置方式与所述纳米级核屯、表面相连的多个覆盖剂实体； 使所述覆盖组合物与w下各物接触： 多个渗杂剂实体；W及 多个密封剂前驱体实体， 所述接触是在足W允许W下各项的条件和时间下进行： 渗杂剂实体积聚于所述核屯、表面上或附近；W及 由所述密封剂前驱体实体形成外部密封剂层，从而产生包含W下各物的组合物： 纳米级核屯、； 连于所述核屯、上的多个覆盖剂实体； 外部密封剂层；W及 多个渗杂剂实体，所述渗杂剂实体分布于选自由W下组成的群组的位置处；所述核屯、 之上或之内、覆盖剂实体之上、所述密封层之内、所述密封层之上W及其组合。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述提供步骤包含提供不包括任何表面底涂剂 添加物的覆盖组合物。
20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述接触步骤不包括与任何表面底涂剂接触。
21. -种包含向个体投与粒子集合的步骤的方法，所述粒子集合包含： 纳米级核屯、； 连于所述核屯、上的多个覆盖剂实体； 外部密封剂层；W及 多个渗杂剂实体，所述渗杂剂实体分布于选自由W下组成的群组的位置处：所述纳米 级核屯、之上或之内、覆盖剂实体之上、所述密封层之内、所述密封层之上W及其组合。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述个体具有实体肿瘤。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述实体肿瘤选自由W下组成的群组：脑肿瘤、 肺肿瘤、乳房肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤、膜腺肿瘤、喉部肿瘤、食道肿瘤、睾丸肿瘤、肝脏肿瘤、 腮腺肿瘤、胆道肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾脏肿 瘤、膀脱肿瘤、前列腺肿瘤、甲状腺肿瘤、头部及颈部肿瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细 胞瘤W及神经内分泌肿瘤。
24. 根据权利要求22或23所述的方法，其中所述投与步骤包含W使得来自所述集合的 粒子定位到所述实体肿瘤上的位置和量投与。
25. 根据权利要求21到24中任一权利要求所述的方法，其中所述粒子进一步包含祀向 实体。
26. 根据权利要求21到25中任一权利要求所述的方法，其中所述纳米级核屯、为金。
27. 根据权利要求21到26中任一权利要求所述的方法，其中所述渗杂剂实体为SE (时 RS-活性剂。
28. 根据权利要求21到27中任一权利要求所述的方法，其中所述粒子进一步包含MRI 试剂、PET试剂、S阳CT试剂、CT试剂或其任何组合。
29. 根据权利要求28所述的方法，其进一步包含使定位的粒子成像的步骤。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述成像步骤包含： 获得MRI或阳T或S阳CT或CT信号，其中所述信号用于产生与W下各项中的一或多种 相对应的图像：完整肿瘤的定位、所述完整肿瘤的宏观定界W及残余肿瘤； 获得光声信号，其中所述光声信号用于产生与具有深层组织穿透性的肿瘤相对应的图 像； 获得拉曼振动信号，其中所述拉曼振动信号用作界定所述肿瘤边缘的导引；W及 使用所述MRI信号、所述光声信号W及所述拉曼振动信号产生所述肿瘤和所述肿瘤边 缘的图像。
【专利摘要】本发明特别提供一种组合物，其包括纳米级核心；连于所述核心上的多个覆盖剂实体；外部密封剂层；以及多个掺杂剂实体，所述掺杂剂实体分布于选自由以下组成的群组的位置处：所述纳米级核心之上或之内、覆盖剂实体之上或之间、所述密封层之上或之内，以及其组合。所提供的技术可以使掺杂剂实体密度和/或表面定位达到前所未有的水平，对于SE(R)RS活性剂掺杂剂来说，这使得信号强度和/或成像灵敏度显著提高。
【IPC分类】A01N25-34, A01N61-00
【公开号】CN104684398
【申请号】CN201380050659
【发明人】莫里茨·基尔舍, 斯特凡·哈姆森, 马修·瓦尔
【申请人】索隆-基特林癌症研究协会
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年8月30日
【公告号】CA2882388A1, EP2892352A1, US20150258218, WO2014036470A1