利用矿物成核剂进行冷冻的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及利用矿物成核剂来冷冻容器中的生物实体或制剂的含水质 (water-containingquantity)的方法、该矿物作为成核剂的用途W及在其整个或部分表 面上或表面中具有该矿物的容器。
【背景技术】
[0002] 存在两种相关的方法用于生物学材料的保藏。在低温保存中，W冷冻状态冷冻并 储存生物学材料。在冷冻干燥（冻干）中，从冷冻的生物学样品中除去水，然后将其W干燥 状态储存。冷冻干燥也被用于（例如）药物的储存或溶质的样品化中（patterning)。
[0003] 低温保存被广泛应用于保持生物学样品的长期活力W用于医学、生物技术和兽医 学。为了在解冻后获得高活力，必需加入保护性化合物（已知为低温保存添加剂或低温保 存剂）并且W受控速率冷却样品。对于许多细胞类型，在冷却过程中通过受控成核来诱发 冰形成而不是使冰自发成核是合乎需要的。
[0004] 用于低温保存的样品通常被置于例如W下的专用低温容器中：
[000引?吸管（Straws)，其是直径为2mm至4mm，长度达140mm，且容量为0. 2ml至0. 5ml 的薄壁管.
[0006]?冷冻管（化yovials)，其是直径为约12. 5mm且容量为0. 5ml至5. 0ml的短粗 (wide short)管；
[0007] ?用于较大体积的低温保存的容量为5ml至1000ml的柔性袋；W及
[000引 ?在机器人技术和高通量筛选中使用的微孔板、介质管（matrixtube)和其他SBS 形式。
[0009] 一系列设备可被用于W受控速率来冷冻吸管和冷冻管。该些设备可使用液氮作为 制冷剂或通过机械制冷来冷却。另外存在一些被动冷却装置。该些装置中的某些使样品中 的冰受控成核，该可W手动或自动进行。
[0010] 在W受控速率冷冻之后，将样品在低温（通常为液氮的温度（-196°C))下保持冷 冻。在此温度下，如果细胞能够在低温下存活，则其生存力与储存时间无关。当需要使用时， 将样品快速解冻（通常处于保持在37°C的水浴中）并除去低温保存剂。
[0011] 冷冻干燥（冻干）被广泛用于生物技术、医学和兽医学领域W长期稳定细胞、疫 苗、蛋白和其他生物活性化合物。冷冻干燥也被用于产生结构材料，例如应用于再生医学中 (MassieI等（2011),TissueE；ngPartCMethods. 17:765-774)和新型陶瓷制造中的支架 和基质。在冷冻干燥过程中，将含水样品置于专用容器（通常为玻璃瓶）中并在冷冻干燥 机中的冷却架上冷冻。冷冻之后，降低局部气压并且冷冻样品中的冰升华。在从样品除去 水之后，在真空下使瓶升温冰将其密封。可在环境温度下分装该样品并通过加入水进行恢 复。
[0012] 在冷冻干燥中，样品往往会普遍过度冷却，该会导致样品之间具有不同的冰晶 结构。冰在接近烙点的温度下成核会导致样品具有快速升华的大冰晶。相对而言，其中 冰在远离烙点的温度下成核的样品会具有小的冰晶并且W慢速升华（SearlesJA等 (2001),Journalof化armaceuticalSciences90:860-871)。当处理大量的样品时， 通常选择处理条件W适应具有最小冰晶的群（population)的缓慢干燥，导致处理时间 延长并且设备和设施低效使用。冰成核温度被认为确定处理时间和生物学活性恢复的 关键因素(KasperJC,FriessW(2011),EuropeanJournalofPharmaceuticsand Bio地armaceutics78:248-263)。
[0013] 按照常规低温保存的哺乳动物胚胎的成功复原依赖于在高的零下温度（通常 为-7°C)下的受控冰成核。由于大量的过度冷却而形成细胞内冰，其中使冰自发成核的样 品具有差的复原（Whittin曲amDG(1977),CibaFoundation52.ElsevierAmsterdamEds KElliotandJWhelanpp97-127)。通过控制冰成核也提高了许多细胞类型（包括哺乳 动物精子和干细胞）的生存力。该通常是通过冷却低温容器W使内容物低于其烙点并且然 后手动使该低温容器的外部与制冷工具接触或机械揽拌该低温容器来进行的。该一过程通 常被称作"接种（seeding)"。接种的缺点在于其是一种手动步骤，该意味着能够被处理的 样品较少并且需要物理介入（physicalaccess)该样品。
[0014] 已经提出了其他的物理方法来诱导成核。例如在冷冻干燥机中，之后落入样品中 的水蒸汽的结晶（雪）诱导成核。最近，普莱克斯公司（PraxairCo巧oration)已经引进 了 '压致移动（pressureshift)'工艺，其中用氣气将冷冻干燥机中的样品加压至28psig， 然后冷却至期望的成核温度。然后将该压力降低至IpsigW诱导成核化onstantinidisA K等（2011),Journalof化armaceuticalSciences100:；3453-3470)。然而，该种方法仍 然是试验性的，成本高昂，难W更新改造并且不适用于小型冷冻干燥机。
[0015] 针对低温保存样品的冰成核，已经考察了大量的化学成核剂（有时被称为成 核催化剂）。该些成核剂促使被称作异相成核化eterogeneousnucleation)或促进成 核（facilitatednucleation)的现象发生。实例包括舰化银的晶体、细菌了香假单胞 杆菌（Pseudomonassyringeae)和胆固醇的晶体。将该成核剂加入到样品中，然后将样 品冷却。当在样品内部达到充分水平的过度冷却时，就会发生冰成核。该种过程使得大 量的样品经过处理，但也存在有关其毒性或潜在毒性或其细菌源性化acterialorigin) 或动物源性的缺点。已知的成核剂不太可能与细胞一起使用于临床应用。当大量的该 些成核剂在较高的零下温度下诱导冰形成时，它们在药品生产质量管理规范（GMP)的 标准下被制造是不太可能的并且它们会具有毒性（SaridakisE等（2008),Trendsin Biotechnology. 27:99-106) 〇
[0016] 一些细菌菌株能够在高达-2°C的温度下使冰成核（ValiG. (1995).Principles oficenucleation.BiologicalicenucleationandItsApplication.R.E.Lee,G. Warren和L.Gusta.St.Paul,Minnesota,APS出版社）。然而，细菌的冰成核活性对于环 境生长条件高度敏感并且所得的蛋白是热敏感的。该种对于环境条件的敏感性使得其 不适于该一应用。存在其他（非细菌）生物学材料在高的零下温度下使冰成核的报道 化enderson-BeggSK.等（2009).AtmosphericScienceLetters10:215-219)。然而，在 加热下冰核往往不稳定并且仍具有非常差的特性。舰化银已经显示出在非常高的温度下对 冰形成的催化作用（VonnegutB等（1984),J.Appl.Meteor. 23(3) :486-490)，但不能与样 品一起用于临床应用。
[0017] 矿物粉尘被认为是相对低效的冰核。总结了浸于水滴中的固体颗粒的冰成核 数据的综述性文章引述了矿物粉尘的最高冷冻温度（约-15°C)0tooseC和0M加ler口012),AtmosphericChemistiTand曲ysics. 12:9817 - 9854;和MurrayB.J等 (2012),QiemicalSocietyReviews. 41:6519-6554)。
[001引刮板式换热器（scrapedsurfaceheatexchanger)被用于冷冻较大体积的水、 糖、乳制品、色素、风味剂和其他添加剂的混合物W形成冰洪淋或冰沙饮料。该刮板式换热 器在高压和恒定揽拌下冷却混合物。成核通常在较少数量的位置中自发地发生。冰晶持续 生长并且被机械打碎W使最终产品中存在的冰晶的尺寸最小。小的冰晶被认为是合乎需求 的，因为相比于含有较大冰晶的冰洪淋，其赋予冰洪淋更加顺滑的质感。然而由于冰洪淋的 高糖含量，当在-l0°C至-2(TC之间的温度下储存时，其往往会部分融化和再结冰，该导致 较大的冰晶生长。
【发明内容】
[0019] 本发明设及通过采用冰的控制成核用的矿物来改善含水产品的冷冻处理。
[0020] 因此，根据第一方面，本发明提供了用于冷冻生物实体或制剂的含水质的方法，包 括：
[0021] (A)使所述含水质与矿物成核剂在容器中接触；W及
[0022] 做冷却所述含水质，W使所述矿物成核剂起到促进冰的非自发形成的作用。
[0023] 通过促进冰的非自发形成，所述矿物成核剂有利地提供了在冰成核过程中的控制 元素，所述冰成核有助于保持所述生物实体或