糜泻，克罗恩病，溃疡性结肠炎，以及其他自身免疫性疾病的发展有关。参见， 如，Wong和Wen(2004)WhatcantheHLAtransgenicmousetellusaboutautoimmune diabetes?,Diabetologia47:1476-87;Taneja和David(1998)HLATransgenicMice asHumanizedMouseModelsofDiseaseandImmunity,J.Clin.Invest. 101:921-26 ； Bakkeretal. (2006),同上；和InternationalMHCandAutoimmunityGenetics Network(2009)MappingofmultiplesusceptibilityvariantswithintheMHCregion for7immune-mediateddiseases,Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:18680-85.
[0125] 因此，本申请所述的制备人源化MHC II复合物的动物的方法可以用于引入MHC II 分子，所述MHC II分子被认为与特定的人类自身免疫性疾病相关联，并且可以研究人类自 身免疫性疾病的进展。此外，本申请所述的非人类动物可用于开发人类自身免疫性疾病的 动物模型。根据本发明，携带本申请中所描述的人源化MHC II蛋白的小鼠可用于确定潜在 的自身抗原，以得到涉及疾病进展的表位图，并设计用于自身免疫性疾病调节的策略。
[0126] 此外，本申请描述的基因修饰动物，可以在人类过敏性反应的研究中使用。由于过 敏性反应似乎与MHCII等位基因相关，本申请中所描述的基因修饰动物可被用来确定过敏 原特异性T细胞应答的HLA限制，并发展针对过敏反应的策略。
[0127] 此外，本发明的基因修饰动物以及其表达的人或人源化的HLA分子可用于检验阻 断由人类疾病进展相关的人类HLA分子呈递的抗原的抗体。因此，本发明提供了一种测定 抗体是否能够通过与人类疾病相关的HLA分子阻断抗原的呈递，例如上述的人类疾病，其 包括将表达本申请描述的人或人源化的HLA的细胞暴露于测试抗体并测定所述测试抗体 是否能够阻断由人或人源化的HLA对免疫细胞（例如，T细胞）呈递抗原，例如，通过测量 其阻断人或人源化HLA限制性免疫应答的能力来确定。在一个实施方式中，该方法是在表 达人或人源化的HLA的动物中进行的，例如，表达疾病相关的人类或人源化HLA的动物，所 述动物用作针对疾病的疾病模型。 实施例
[0128] 将通过下述非限制性实施例对本发明进行进一步解释。列出这些实施例用于帮助 理解本发明，其不以任何方式构成对其保护范围的限制。所述实施例不包括对本领域普通 技术人员熟知的常规方法（分子克隆技术等）的详细描述。除非另有明示，以重量份表示 重量，分子量是平均分子量，以摄氏度表示温度和压力为处于或接近大气压。
[0129] 实施例1.删除内源性MHCII类H-2A和H-2E基因座
[0130] 使用VELOCIGENE3?基因工程技术制备用于引入内源性MHCII类的H-2Abl、 化2六3、11-2￡131、11-2￡匕2和11-2￡3缺失的靶向载体（参见，例如美国专利号6,586,251和 Valenzuela等，同上）。对细菌人工染色体（BAC)RP23_458i22 (Invitrogen)DNA进行修饰 以删除内源性MHCII类基因H-2Abl、H-2Aa、H-2Ebl、H-2Eb2jPH-2Ea。
[0131] 简言之，通过对H-2Abl基因5'端和来自H-2Ea基因3'端位置的小鼠的BACDNA 分别进行PCR产生上游和下游同源臂。如图5所描绘的，这些同源臂被用来制备通过细菌 同源重组（BHR)删除RP23-458i22的~79kb的表达盒，所述表达和包括MHCII类基因座的 基因H-2Abl，H-2Aa，H-2Ebl，H-2Eb2,和H-2Ea。这个区域被替换为lox66和lox71位点之 间的潮霉素选择性表达盒。从5'至3'的最终靶向载体包括34kb的同源臂，其包括内源性 MHCII类基因座的H-2Abl基因5'端的小鼠基因组序列、5'端的lox66位点，潮霉素选择 性表达盒，3'端的lox71位点并且63kb的同源臂包括内源性MHCII类基因座（MAID5111， 见图5)的H-2Ea基因3'端的小鼠基因组序列。
[0132] 将BACDNA靶向载体（如上所述）用于对小鼠ES细胞进行电穿孔以形成 包括内源性MHCII类基因座缺失的经修饰的ES细胞。使用TAQMAN?探针通过定 量PCR分析对含缺失的内源性MHCII类基因座的阳性ES细胞进行鉴定（Lieand Petropoulos(1998)Curr.Opin.Biotechnology9:43-48)〇 通过使用引物 511IU F(CAGAACGCCAGGCTGTAAC;SEQIDN0:1)和 5111UR(GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC;SEQ IDN0:2)和探针 5111UP(CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA;SEQIDN0:3)进行PCR以 确认经删除的基因座的上游区域。而使用引物5IllDF(GTGGGCACCATCTTCATCATTC; SEQIDN0:4)和 5111DR(CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC;SEQIDN0:5)和探针 5111D P(AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT;SEQIDN0:6)确定所述缺失的基因座的下游区域。通过使用 和探针HYGP(ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC;SEQIDN0:9)确认来自靶向载体的潮霉素选择性 表达盒的存在。跨过上游缺失点（SEQIDNO: 10)的核苷酸序列包含以下内容，其表明在缺 失点上游的内源性小鼠序列（包含在下方的括号内）与在所述缺失点的选择性表达盒序列 连续地连接：（TTTGTAAACAAAGTCTACCCAGAGACAGATGACAGACTTCAGCTCCAATGCTGATTGGTT CCTCACTTGGGACCAACCCT)CTCGAGTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGCATCCGG GTAGGGGAGG。跨过下游缺失点（SEQIDN0:11)的核苷酸序列包含以下内容，其表明选 择性表达盒序列与在所述缺失点下游的内源性小鼠序列（包含在下方的括号内）连续：
随后用阳性ES细胞克隆使用VELOCIMOUSE?方法（如下描述）植入雌性小鼠以产生含 有内源性MHCII类基因座缺失的同窝小鼠。
[0133] 将如上所述的靶向的ES细胞用作供体ES细胞并用VELOCIMOUSE?:方法引 入8细胞期的小鼠胚胎（见，例如，美国专利号7, 294, 754和Poueymirou等人（2007)FO generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targeted EScellsallowingimmediatephenotypicanalyses,NatureBiotech. 25(I):91-99)〇对 在内源性MHCII类基因座中带有H-2Abl、H-2Aa、H-2Ebl、H-2Eb2和H-2Ea基因缺失的小 鼠用改良等位基因检测法通过基因分型（Valenzuela等人，同上）来鉴定，所述改良等位基 因检测法检测到潮霉素选择性表达盒的存在，并确认不存在内源性MHCII类序列。
[0134] 可将在内源性MHCII类基因座带有H-2Abl、H-2Aa、H-2Ebl、H-2Eb2和H-2Ea基 因缺失的小鼠与Cre清除小鼠品系交配（参见，例如，国际专利申请公开号W02009/114400) 以除去如在ES细胞或在胚胎阶段由所述未除去的靶向载体引入的任何在loxP位点之间 的潮霉素选择性表达盒。可选地，将潮霉素选择性表达盒保持在小鼠中。
[0135] 实施例2.产生包括嵌合HLA-DR4/H-2E基因的大型靶向载体（LTVEC)
[0136] 如图4所示设计了为引入人源化MHCIi序列的靶向载体。使用velocigenek^ 因工程技术，将细菌人工染色体（BAC)RP23-458i22DNA在不同步骤中进行修饰：（1)制备 包含来自BALB/cH-2Ea基因的功能性I-Ea外显子1(图4A) ;(2)制备包括用人DRM*04 的外显子2和3取代小鼠I-E基因的外显子2和3以及用人DRa1*01的外显子2和3取 代小鼠I-Ea的外显子2和3的载体（图4B) ; (3)制备载体，所述载体在保留的小鼠I-EP 外显子的同时携带人DRP1*04的外显子2和3,和在保留包括来自BALB/c小鼠的功能性 I-Ea外显子1的小鼠I-Ea外显子的同时携带人DRa1*01的外显子2和3(步骤（1)(图 4C);并且⑷在经（3)中产生的载体中移除隐蔽剪接位点（图4D)。
[0137] 特别地，因为在C57BL/6小鼠中，由于存在非功能性的外显子1，所以所述I-Ea 基因是假基因，首先，制备了包括来自BALB/c小鼠H_2Ea基因的功能性I-Ea外显子1 的载体（图4A)。由细菌同源重组（LBHR)对RP23-458i22BAC进行修饰以用大观霉素 (spectromycin)抗性基因取代氯霉素抗性基因。所得载体通过BHR进一步修饰，以便用在 重组位点（2.BHR)之间的新霉素选择性表达盒取代整个I-A和I-E编码区。通过包含编码 BALB/cI-Ea前导（外显子1)和在PI-SceI和I-CeuI限制性位点之间的氯霉素基因的 外显子的构建体的另一轮的BHR(3.BHR)获得了包含功能性的BALB/cH-2Ea外显子1的载 体。
[0138] 独立地，为了生成包括用人DRP1*04的外显子2和3取代小鼠I-EP基因的外显 子2和3以及用人DRa1*01的外显子2和3取代小鼠I-Ea的外显子2和3的载体，通过 几个同源重组步骤修饰RP23-458i22BAC，4.BHR- 8.BHR(图4B)。所得核酸序列在PI-SceI/ I-CeuI限制性位点之间，以允许连接到上述携带BALB/cI-Ea外显子1的构建体（图4C)。
[0139] 图4C所示的最终构建体的序列在BALB/c内含子的3'端含有隐蔽剪接位点。进行 几个BHR步骤（11.BHR-12.BHR)随后进行缺失步骤，以获得最终的靶向载体（MAID1680)， 所述载体用于经电穿孔引入ES细胞（图4D)。
[0140] 详细地，最终靶向载体（MAID1680)，从5'到3'，由以下组成：5'小鼠同源臂 (由~26kb的小鼠基因序列组成，所述小鼠基因组序列恰好在内源性MHCII类基因座的 H2Abl基因的上游结束）；~59kb的包含所述人源化MHCIIf3链基因（人源化H-2Ebl基 因）和人源化MHCIIa链基因（人源化H_2Ea基因）和在loxP位点之间的新霉素选择 性表达盒的插入；和3'小鼠同源臂（由~57kb的小鼠基因组序列组成，所述小鼠基因组序 列恰好在内源性MHCII类基因座的H-2Ea基因的下游起始）。跨越5'臂和所述插入（SEQ IDN0:12)之间的连接处的核苷酸序列包括以下：（TGCTGAITGGTTCCTCACTTGGGACCAACC Otaagcttta tctatgtcgg gtgcggagaa agaggtaatg aaatggcaca aggagatcac acacccaaac CAAACTCGCC，其中斜体序列是独特的PI-SceI位点，并且在5'同源臂中的小鼠基因组序列 是在括号中。跨越插入和3'臂之间的连接处的核苷酸序列（SEQIDNO: 13)包括以下： CACATCAGTGAGGCTAGAATAAATTAAAATCGCTAATATGAAAATGGGG(ATTTGTACCTCTGAGTGTGA AGGCTGGGAAGACTGCTTTCAAGGGAC)，其中在3'同源臂中的小鼠的基因组序列在括号中。
[0141] 在所述~59kb的插入中，对所述H-2Ebl基因进行如下修饰：H-2Ebl的5136bp的 区域，包括内含子1，外显子2,内含子2,外显子3的最后的153bp，并且内含子3的前122bp 被取代为人HLA-DRB1*04的3111bp同源区，包括内含子1，外显子2,内含子2,外显子3的 最后的148bp，和内含子3的前132bp。在内含子3的人类和小鼠序列之间的连接处插入了 由5'l〇X2372位点的选择性表达盒，UbC启动子，新霉素抗性基因，和3'l〇X2372位点。所得 基因编码嵌合的HLA-DRBl*04/H-2Ebl蛋白，所述蛋白包括小鼠H-2Ebl前导，来自DRB1*04 的人M和32±或，以及小鼠跨膜域和胞质尾。在内含子I(SEQIDNO: 14)中跨越小鼠 / 人连接处的核苷酸序列包括：（TCCATCACTTCACTGGGTAGCACAGCTGTAACTGTCCAGCCTG) GGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTTGATCGAGCTCCCTG GGCTGCAGGTGGTGGGCGTTGCGGGTGGGGCCGGTTAA，其中斜体序列是在克隆步骤中引入的多 克隆位点，小鼠内含子1序列在括号中。跨越人内含子3和新霉素选择性表达盒之间的 连接处的核苷酸序列（SEQIDN0:15)包括如下：(ATCTCCATCAGAAGGGCACCGGT)ATAACTT CGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTATATGCATGGCCTCCGCGCCGGGTT，其中的 5'lox2372 位点为 斜体，并且人内含子3序列在括号中。跨越新霉素选择性表达盒和小鼠内含子3之间的 连接处的核苷酸序列（选择性表达16)包括如下：ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAG TTATCTCGAG(TGGCTTACAGGTAGGTGCGTGAAGCTTCTACAAGCACAGTTGCCCCCTGG)，其中 3'l〇X2372位点是斜体，并且小鼠内含子3的序列在括号中。
[0142] 还是在~59kb插入中，对所述H-2Ea基因作如下修饰：H-2Ea的1185bp的区 ±或，包括内含子1，外显子2,内含子2,外显子3的最后lOlbp，和内含子3的前66bp，被人 HLA-DRA1*01的1189bp的同源区，包括内含子1，外显子2,内含子2,外显子3的最后的 104bp和内含子3的前66bp取代。如上所述，由于所述H-2Ea的C57BL/6等位基因的外显子 1包含使得该基因无功能的缺失，因此H-2Ea外显子1和内含子1的其余部分被来自H-2Ea 的BALB/c等位基因的等价2616bp区域（其是功能性的）取代。所得基因编码的嵌合H-2Ea/ HLA-DRA1*01蛋白包括来自BALB/c的小鼠H-2Ea前导，来自DRA1*01的人a1和a2,以及 小鼠跨膜域和胞质尾。在内含子1中跨越小鼠/人连接处的核苷酸序列（SEQIDNO: 17) 包括以下：（CTGITTCTTCCCTAACTCCCATTCTATGCTCTTCCATCCCGA)CCGCGGCCCAATCTCTCTCC ACTACTTCCTGCCTACATGTATGTAGGT，其中斜体序列是在克隆步骤引入的限制酶位点，BALB/ c内含子1的序列在括号中。在内含子3中跨越人/小鼠连接处的核苷酸序列（SEQID N0:18)包括以下：CAAGGTTTCCTCCTATGATGCTTGTGTGAAACTCGGGGCCGGCC(AGCATTTAAC AGTACAGGGATGGGAGCACAGCTCAC)，其中斜体序列是在克隆步骤引入的限制酶位点，和小 鼠内含子3的序列在括号中。在外显子1的5'端的跨越C57BL/6-BALB/C连接处（SEQ IDNO: 19)的核苷酸序列包括：（GAAAGCAGTCITCCCAGCCTTCACACTCAGAGGTACAAAT) CCCCAITITCATATTAGCGATITTAAITTATTCTAGCCTC，其中所述的C57BL/6特异性序列在括号 中。在外显子1的3'端的跨越BALB/c-C57BL/6连接处（SEQIDN0:20)的核苷酸序列包括： TCTTCCCTAACTCCCATTCTATGCTCTTCCATCCCGACCGCGG(CCCAATCTCTCTCCACTACTTCCTGCC TACATGTATG)，其中SacII限制性位点为斜体，C57BL/6的序列在括号中。
[0143] 实施例.3基因修饰的HLA-DR4小鼠的产生
[0144] 用于使用实施例2的载体产生人源化MHC II小鼠的策略的简化图示于图5和8。
[0145] 特别地，MAID1680BACDNA(如上所述）被用于对MAID5111ES细胞电穿孔以形成 修饰的ES细胞，其包含用包括嵌合的人DR4/小鼠I-E基因座的基因组片段取代内源性小 鼠I-A和I-E基因座。阳性ES细胞包含缺失的内源性I-A和I-E基因座，其被包括嵌合 的人DR4/小鼠I-E基因座的基因组片段所取代，所述阳性ES细胞通过使用TAQMAN?探针 (Lee和Petropoulos，同上）进行定量PCR分析确定。所述人DRa序列的插入通过使用引 物hDRAlF(CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG;SEQIDN0:21)、hDRAlR(CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC; SEQIDN0:22)和探针hDRAlP(CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG;SEQIDN0:23)经PCR确认。 所述人DRP序列的插入通过使用引物hDRAlF(AGGCTTGGGTGCTCCACTTG;SEQIDN0:24)、 hDRBlR(GACCCTGGTGATGCTGGAAAC;SEQIDN0:25)和探针hDRBlP(CAGGTGTAAACCTCTCCACTC CGAGGA;SEQIDN0:26)经PCR证实。用引物HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC;SEQIDN0:7)和 NO:9)对来自靶向载体的潮霉素选择性表达盒的缺失进行确认。
[0146] 然后使用盤方法（同上）将阳性ES细胞克隆植入雌性小鼠以产 生同窝小鼠，其含有用嵌合的人DR4/小鼠I-E基因座取代内源性I-A和I-E基因座的取代。 将如上所述经靶向的ES细胞用作供体ES细胞并用VELOC丨MOUSE贫方法导入8-细胞期 的小鼠胚胎。带有嵌合人DR4/小鼠的I-E基因座的小鼠通过使用等位基因测定法的基因 型分型来鉴定（ValenzueIa等人，同上），所述方法检测出嵌合的人DR4/小鼠I-E基因座的 存在。
[0147] 可以将带有嵌合人DR4/小鼠的I-E基因座的小鼠与Cre清除小鼠品系（参见，例 如，国际专利申请公开号WO2009/114400)交配以除去，例如，在ES细胞或在胚胎阶段，由 未被去除的靶向载体引入的任何在IoxP位点之间的新霉素选择性表达盒，（参见图6)。
[0148] 实施例4.在基因修饰的小鼠中表达嵌合HLA-DR4/H-2E
[0149] 将来自WT或杂合的人源化HLA-DR4小鼠的脾脏（"1681HET"）用胶原酶D(罗氏 生物科学）灌流并且用ACK裂解液裂解红细胞。用25微克/毫升的聚（I:C)培养脾细胞 两天以刺激MHC-II基因的表达。通过使用荧光染料缀合的抗-⑶3 (17A2)、抗-⑶19 (1D3)、 抗-CDllc(N418)、抗F480(BM8)、抗I-A/I-E(M15)和抗HLADR(L243)经FACS分析人HLA-DR4 在细胞表面的表达。使用BD-LSRII进行流式细胞术分析。人HLA-DR4的表达在⑶19+B细 胞的表面上可清楚地检测到并且在通过Toll样受体（toll-likereceptor)激动剂聚（I: C)的刺激后显著上调（参照图9)。
[0150] 实施例5.基因修饰的HLA-DQ2. 5、HLA-DQ8和HLA-DR2小鼠
[0151] 用VELOCIGENE?基因工程技术制备携带嵌合的人HLA-DQ2. 5/H-2A、HLA-DQ8/ H-2A和HLA-DR2/H-2E的小鼠（见，例如，美国专利号6, 586, 251和Valenzuela等人，同 上）。通过基因合成和经细菌同源重组以及消化/连接技术对BAC的修饰产生带有人源化 基因的LTVEC。
[0152] 蓝鹭基因合成公司（华盛顿州，美国）基于公开可得的基因序列合成了人 HLA-DQ2. 5、-DQ8. 1和DR2a和0链序列。具体地，修饰合成的人HLA-DQ2. 5a(DQA1*05) 和P(DQB1*02)链和小鼠BACRP23-444J20并用于产生带有嵌合的HLA-DQ2. 5/H-2A的 LTVEC，如图IOA所示。同样地，修饰合成的人HLA-DQ8.Ia(DQA1*0301)和P(DQB1*0302) 链和小鼠BACRP23-444J20并用于产生带有嵌合的HLA-DQ8. 1/H-2A的LTVEC，如图IOB所 示。对于HLA-DR2/H-2E，使用合成的人HLA-DR2P链（DRB1*1501)来产生载体，所述载体 包含DRP1*02(1501)外显子和内含子，并且通过使用细菌