本发明涉及动物饲料
技术领域：
：，特别是涉及一种含有耐高温木聚糖酶的动物饲料及其在提高动物体重和/或饲料转化率中的应用。
背景技术：
：：由于玉米、豆粕等饲料原料严重短缺，为满足快速发展的饲料需求,客观要求充分地利用我国资源丰富的小麦麸、米糠、菜粕、棉粕等。而这些植物性原料存在着抗营养因子主要是非淀粉多糖，特别是可溶性非淀粉多糖。为有效利用这些饲料原料，需要同时使用木聚糖酶等酶制剂。同时，随着我国食品安全日益得到重视，抗生素等易产生残留、污染环境的饲用添加剂的使用将受到限制或禁用，而木聚糖酶等饲用酶制剂作为无公害饲料添加剂，将会得到大力推广。木聚糖酶用作饲料添加剂已多年。事实上一些但不是全部木聚糖酶已显示出提高动物绝对体重增加和供给饲料的饲料转化率中的一者或二者。木聚糖酶降解高纤维日粮中的可溶性和不可溶性非淀粉多糖抗营养因子，从而打破细胞壁增加动物自身分泌内源酶与相应底物接触机会。为了起作用，用作饲料添加剂的木聚糖酶应在接近于动物胃肠道的条件的pH和温度下是稳定的和具有活性。现有文献公开了很多用作饲料添加剂的木聚糖酶，但绝大多数不耐高温，所以，当添加木聚糖酶的制作饲料，制作饲料过程中高温瞬间就使得木聚糖酶不可逆地失活。鉴于此，开发饲料用耐高温木聚糖一直是研究者们研究的重点。技术实现要素：为解决上述问题，本发明的一方面是提供一种含有耐高温木聚糖酶的动物饲料，包括基础日粮，所述耐高温木聚糖酶降解木聚糖的最适温度为75℃，且在90℃处理4～8分钟还能保留42％～65％的木聚糖降解活性。所述耐高温木聚糖酶的耐高温性能是由所述耐高温木聚糖酶的N端结构域与催化中心之间增加二硫键形成。优选地，所述耐高温木聚糖酶的N端结构域与催化中心之间增加两个二硫键，且耐高温木聚糖酶的N端结构域与催化中心之间共有三个二硫键。上述耐高温木聚糖酶的N端结构域与催化中心之间增加二硫键的过程为：通过DisulfidebyDesign软件对重组木聚糖酶Xyn-CDBFV上的二硫键进行了在线分析预测。经分析，存在26个可以形成二硫键的潜在位点。它们分别是：4位/172位；7位/217位；7位/218位；11位/45位；28位/65位；29位/42位；50位/60位；55位/58位；57位/204位；61位/198位；70位/74位；83位/172位；83位/218位；91位/208位；95位/117位；95位/118位；97位/115位；100位/200位；102位/195位；129位/145位；131位/143位；141位/164位；176位/179位；184位/189位；199位/219位；205位/208位。其中，NTR和催化中心之间除了已形成的4位/172位二硫键外，还有7位/217位和11位/45位可以设计形成二硫键。结合预测结果，理性的在NTR和催化中心之间设计引入7位/217位和11位/45位二硫键，这样在耐高温木聚糖酶中，NTR和催化中心之间将有三个二硫键，它们使NTR这个“夹子”更稳固的夹住催化中心，使木聚糖酶在高温下更加稳定。这里，我们将耐高温木聚糖酶命名为木聚糖酶xyn-LVK。所述耐高温木聚糖酶xyn-LVK的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述耐高温木聚糖酶xyn-LVK的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述SEQIDNO.1的序列如下：QSFCSSCSHSCQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWADSGNNSATFYScGSFSCTFQNAGDYLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQNSSNVGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPPGDWVGNKKHGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSIDGDTTFNQYFSIRQQARDCGTIDISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFcYAKVYIGD。所述SEQIDNO.2的序列如下：CAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAA。所述耐高温木聚糖酶xyn-LVK可在任何合适的宿主生物体中表达。特别适合的宿主是细菌、酵母和真菌。优选的细菌宿主是大肠杆菌和杆菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。优选的酵母宿主是酿酒酵母、毕赤酵母或解脂耶罗维亚酵母的菌株。优选的真菌宿主是曲霉、青霉和木霉的菌株。优选地，所述动物饲料以基础日粮计含10mg/kg～50mg/kg的所述耐高温木聚糖酶xyn-LVK。所述含有耐高温木聚糖酶xyn-LVK的动物饲料，还包括植物材料，所述植物材料选自小麦、大麦、高粱、黑麦、荞麦、DDGS、米糠、棕榈粕、棉粕、豆粕和玉米中的一种或两种以上。动物饲料可以包括谷物，如小麦、大麦、黑麦、玉米、稻米、高粱、黑小麦或燕麦，或谷物副产品如麦麸、大麦稿杆、玉米穗轴、燕麦粉、粗小麦粉、小麦麸质饲料、稻米胚芽、或玉米糠，或其他植物材料如大豆或其他豆类、油菜籽、羽扇豆、豌豆、木薯粉、甜菜糖蜜、马铃薯渣、花生饼粉。所述含有耐高温木聚糖酶xyn-LVK的动物饲料还包含至少一种植物蛋白质或蛋白质源。植物蛋白质或蛋白质源的实例为大豆和谷物，如大麦、玉米、燕麦、稻米、黑麦、高粱和小麦。所述含有耐高温木聚糖酶xyn-LVK的动物饲料还可以包含额外的饲料成分或添加剂如酶、益生元(prebiotics)、有益菌种(probiotics)、矿物质和微量元素、维生素和维生素原、植物(vegetable，蔬菜)、微生物或动物蛋白、氨基酸、它们的盐和类似物、淀粉、纤维、碳水化合物和糖或甜味剂、油和油粕粉、植物或动物脂肪、染料或其他着色剂、乳化和稳定剂、增稠和胶凝剂、粘结剂、防结块剂和凝结剂、防腐剂、酸度调节剂、类胡萝卜素和叶黄素、脲及其衍生物、消化性增强剂、肠道菌群稳定剂、球虫抑制剂和其他药物。优选的，额外的酶选自脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶和半纤维素酶中一种或两种以上。优选的，矿物质选自盐（氯化物、硫酸盐、氟化物、碳酸盐、氧化物、……)、钙、磷、镁、钾、钠、锰、锌、镍、钼、铜、铁、硒、钴和碘中的一种或两种以上。优选的，维生素选自维生素A、胡萝卜素、抗坏血酸、维生素D、D3、E、K、B1硫胺（维生素b1）、B6吡哆醇（维生素b6）、生物素、胆碱、叶酸、烟酸、泛酸、B2核黄酸（维生素b2）、氰钴维生素（氰钴胺）中的一种或两种以上。合适的蛋白质选自植物、微生物或动物蛋白中的一种或两种以上。合适的氨基酸选自蛋氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苯基丙氨酸、络氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸中的一种或两种以上。合适的微生物属于但不限于曲霉属、杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、乳酸菌属、乳球菌属、明串珠菌属、片球菌属、酵母属、链球菌属。其他可能的添加剂可被使用，例如在中华人民共和国农业部发布的《饲料添加剂品种目录2013》中出现的添加剂。本发明另一方面提供一种含有耐高温木聚糖酶的动物饲料在提高动物体重和/或饲料转化率中的应用。优选地，所述动物为非反刍脊椎动物或甲壳类动物，优选鱼、猪或家禽，更优选猪或家禽。在本发明的一个实施例中，所述动物为家禽时，所述动物饲料中以基础日粮计含10mg/kg～30mg/kg的所述耐高温木聚糖酶。在本发明的另一个实施例中，，所述动物为猪时，所述动物饲料中以基础日粮计含10mg/kg～50mg/kg的所述耐高温木聚糖酶。本发明的有益效果是：区别于现有大多数木聚糖酶在饲料制作时高温瞬间失活的情况，本发明的含有耐高温木聚糖酶的动物饲料中的耐高温木聚糖酶降解木聚糖的最适温度为75℃，且在90℃处理4～8分钟还能保留42％～65％的木聚糖降解活性，本发明的含有耐高温木聚糖酶的动物饲料应用于提高动物体重和/或饲料转化率，能使肉鸡的出栏重增加2.33%～3.49%，料肉比降低1.73%～4.49%；能使断奶猪的日增重和日采食量增加以及提高饲料转化率，并能降低腹泻率。附图说明图1为木聚糖酶xyn-LVK的最适pH；图2为木聚糖酶xyn-LVK的pH稳定性；图3为木聚糖酶xyn-LVK的最适温度；图4为木聚糖酶xyn-LVK的热稳定性。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本发明进行进一步描述：本发明中，木聚糖酶的酶活检测方法参照《GB/T23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》。实施例1：耐高温木聚糖酶xyn-LVK的制备一、实验条件（1）菌株与载体大肠杆菌E.coliTop10购自Invitrogen公司，里氏木霉QM9414购自美国模式菌种收藏中心（ATCC），pUC19、pMD19-Tsimplevector购自TaKaRa。质粒pAN7-1（带有真菌筛选标记潮霉素抗性基因hph和大肠杆菌筛选标记氨苄青霉素抗性基因Ap）。（2）酶类及其他生化试剂各种DNA工具酶，DNAMarker，DNA胶回收纯化试剂盒（AgaroseGelDNAPurificationKit）、DNA纯化试剂盒（FragmentPurificationKitVer.2.0）购自TaKaRa。T4DNA连接酶购自Fermetas公司。其它生化试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。（3）培养基LB培养基：用于培养大肠杆菌，含1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠；用NaOH调pH值至7.0；加1.5%（w/v）琼脂粉（固体培养基）。里氏木霉液体基本培养基：含100mL/LMandels营养液浓缩液，1.0mL/LMandels微量元素浓缩液，18g/L无水葡萄糖，1.0g/L蛋白胨，50mL/LpH4.5的1mol/L的柠檬酸缓冲液，1.0-2.0g/L吐温80。Mandels营养盐浓缩液配制：(NH4)2SO4：14g/L，尿素：3g/L，KH2PO4：20g/L，CaCl2·2H2O：4g/L（或CaCl2：3g/L），MgSO4·7H2O：3g/L，加水至1000mL。Mandels微量元素浓缩液配制：FeSO4·7H2O：5g/L，ZnSO4·7H2O：1.7g/L(或ZnCl2：0.7g/L)，CoCl2·6H2O：3.7g/L（或CoCl2：2g/L），MnSO4·H2O：1.6g/L（或MnCl2：1.67g/L，或MnSO4·7H2O：2.6g/L），加水至1000mL。1mol/L柠檬酸缓冲液配制：柠檬酸：210g，加NaOH(纯度96%)约78g，加水750mL，冷却后加水至1000mL。PDA固体培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20%土豆浸出液，2%葡萄糖，1.5%Agar。20%土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20g土豆加水100mL，煮沸30min，用三层纱布过滤，加入葡萄糖后定容。筛选里氏木霉转化子时加入终浓度为100g/mL的潮霉素。产酶培养基：50g/L黄豆饼粉，70g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，100ml/LMandels营养盐浓缩液，1ml/LMandels微量元素浓缩液，50mL/LpH4.5的1mol/L的柠檬酸缓冲液，0.5g/L吐温80，加水到1000ml。二、耐高温木聚糖酶xyn-LVK的制备方法如下：（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；所述里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的序列如SEQIDNO.3所示，为：GACGCAGAAGAAGGAAATCGCCCCGCCGGTTCCGTAAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCACAGCCTTGGCCCTGGGCCTAGCCTTGCGCCTTGTTTGATGCAATCGGCGACATGTCGAATGCTGTAATTTTTTTTGTTTAGGTTCCCCTTTTCCTTTTGTGTTAATAATAATTCTCGAAGGGCGCTGATTTTGAAATTTGTCGGTGAGAGCCAAACGGATATACAGGCGCGGCTGATGAATAATGATGAATCGAGCTGACTTGATGCTGTATGTACAATATTGACTGCGAGGACCATCAGGTGTTGTATGGATGGAATCATTCTGTAACCACCAAGGTGCATGCATCATAAGGTATTCTCCTCAGCTCACCAACAACGAACGATGGCCATGTTAGTAAAGGCACCGTGATGGCAAGATAGAACCACTATTGCATCTGCGCTTCCCACGCACAGTACGTCAATGTAACGTCAAAGCCGCCCTCCCGTAACCTCGCCCGTTGTTGCTCCCCCCGATTGCCTCAATCACATAGTACCTACCTATGCATTATGGCGCCTCAACCCACCCCCCCAGATTGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAA。里氏木霉cbh1信号肽序列如SEQIDNO.4所示，为：ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCACGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT。里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子如SEQIDNO.5所示，为：GTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGAGAAGGAATGGTAGGACCTCTCAGGCGTCCACCATCTGTGCTGCAAATCCAAGAAACCCCCCAAAAGCACCTACCTATCTACCTAGAGTAATCTGCACGAGAAAAGAAAAGGAGCAGAAGAAGAATGATCTCAAGAGGCCGTGAACGCAGAAACACACTCCTCCCAACTTTTCAAGTTTTGAACAAAAAAAGAAAGATGAGGACTAGAAGATGGAGTATTTCCTTCTTAGAGAGCTCTCGGTGAGGTGACCTGTCAGGGTTTACCTCAAACCGTCTGTGGTTCTATCCAATTAATCAAGTCCCTCTCCTCTCCTCTTCTCTCCTGTCCTTTCATAGAATCCCTTTTCCTTGTTGCTTGATCGAAGCGGGTTATCGACGCCACCAAAGTATTGTCTTGGTGACTTATCAAATCCCTTTGGTGATCAAACAGCCCCCGAGTGATCAGATCCGTAA。表达框序列如下：GACGCAGAAGAAGGAAATCGCCCCGCCGGTTCCGTAAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCACAGCCTTGGCCCTGGGCCTAGCCTTGCGCCTTGTTTGATGCAATCGGCGACATGTCGAATGCTGTAATTTTTTTTGTTTAGGTTCCCCTTTTCCTTTTGTGTTAATAATAATTCTCGAAGGGCGCTGATTTTGAAATTTGTCGGTGAGAGCCAAACGGATATACAGGCGCGGCTGATGAATAATGATGAATCGAGCTGACTTGATGCTGTATGTACAATATTGACTGCGAGGACCATCAGGTGTTGTATGGATGGAATCATTCTGTAACCACCAAGGTGCATGCATCATAAGGTATTCTCCTCAGCTCACCAACAACGAACGATGGCCATGTTAGTAAAGGCACCGTGATGGCAAGATAGAACCACTATTGCATCTGCGCTTCCCACGCACAGTACGTCAATGTAACGTCAAAGCCGCCCTCCCGTAACCTCGCCCGTTGTTGCTCCCCCCGATTGCCTCAATCACATAGTACCTACCTATGCATTATGGCGCCTCAACCCACCCCCCCAGATTGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAAATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCACGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAAGTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGAGAAGGAATGGTAGGACCTCTCAGGCGTCCACCATCTGTGCTGCAAATCCAAGAAACCCCCCAAAAGCACCTACCTATCTACCTAGAGTAATCTGCACGAGAAAAGAAAAGGAGCAGAAGAAGAATGATCTCAAGAGGCCGTGAACGCAGAAACACACTCCTCCCAACTTTTCAAGTTTTGAACAAAAAAAGAAAGATGAGGACTAGAAGATGGAGTATTTCCTTCTTAGAGAGCTCTCGGTGAGGTGACCTGTCAGGGTTTACCTCAAACCGTCTGTGGTTCTATCCAATTAATCAAGTCCCTCTCCTCTCCTCTTCTCTCCTGTCCTTTCATAGAATCCCTTTTCCTTGTTGCTTGATCGAAGCGGGTTATCGACGCCACCAAAGTATTGTCTTGGTGACTTATCAAATCCCTTTGGTGATCAAACAGCCCCCGAGTGATCAGATCCGTAA。（2）利用PCR技术扩增表达框序列，然后利用限制性内切酶EcoRI，XbaI将表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；重组表达质粒构建引物序列如下：上游引物：CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC（下划线为EcoRI切位点），下游引物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG（下划线为，XbaI酶切位点）。（3）将重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组表达质粒。（4）抽提重组表达质粒，将10微克的重组表达质粒和10微克的pAN7-1载体轻轻混匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于5个含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养两天，待平板上长出菌丝，将菌丝转接到新的含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养五天；（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的PDA固体平板上长孢子；（6）将制得的孢子用无菌水制备孢子悬液，取105个孢子接种于30ml的基本培养基中，28℃，250r/min培养48小时后取1.5ml菌液后转接到30ml的产酶培养基中，28℃，250r/min培养196小时；取菌液，12,000×g离心5min，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子。三、发酵罐水平的小试表达里氏木霉基因工程菌发酵用5.0L发酵罐进行实验，将上述获得的高木聚糖酶活性转化子进行发酵水平发酵试验，产酶培养基发酵罐装液量3.0L，接装液量5%～10%的摇瓶种子培养液。发酵条件：28℃，搅拌速度300～500rpm，通气量0.5～1vvm，pH4.5。随着发酵时间的延长，发酵上清液中木聚糖酶酶活力显著增加，发酵170h后木聚糖酶活性可达101260U/mL，菌体湿重达323g/L。四、木聚糖酶xyn-LVK的纯化木聚糖酶xyn-LVK纯化的具体过程是，将实施例1中发酵罐表达的上清液用超滤膜进行浓缩，然后在每100mL的浓缩液中缓慢加入质量分数为70%的硫酸铵溶液，并不断搅拌2.5h，然后在10000rpm离心15min，收集沉淀。沉淀用少量pH8.0的20mMTris-HCl缓冲液溶解，并在大量该缓冲液中透析过夜，透析后的溶液过阴离子柱（HiTrapQSepharoseXL5mL）进行纯化。阴离子柱事先用pH8.0的20mMTris-HCl缓冲液平衡，上样后用0～1.0mol/L线性梯度的NaCl溶液洗脱，收集有木聚糖酶活性的洗脱管，收集液再用超滤离心管处理，使其浓缩，经SDS-PAGE确认后用于酶学性质的分析。五、木聚糖酶xyn-LVK的酶学性质（1）木聚糖酶xyn-LVK的最适pH和pH稳定性将纯化的木聚糖酶xyn-LVK稀释到所需浓度，将样品置于不同pH值下进行酶促反应以测定其最适pH，以最适pH值下的酶活作为100%对照，计算相对酶活，并作相对酶活曲线，结果如图1所示。由图1可知，木聚糖酶xyn-LVK最适pH为5.0。将纯化的木聚糖酶xyn-LVK稀释到所需浓度，将样品置于不同pH值的缓冲液中，室温放置24h，然后检测其酶活，以未处理的原酶液作为100%对照，作相对酶活曲线，结果如图2所示。由图2可知，木聚糖酶xyn-LVK在pH3.0时，相对酶活仍然能够达到61%，在pH7.0时，相对酶活能够达到82%，说明木聚糖酶xyn-LVK能很好地适应动物胃肠道的pH环境。（2）木聚糖酶xyn-LVK的最适温度和热稳定性将纯化的木聚糖酶xyn-LVK稀释到所需浓度，将样品置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃温度下测定酶活，以确定该酶的最适温度，以最适温度下的酶活作为100%对照，计算相对酶活，并作相对酶活曲线，结果如图3所示。由图3可知，xyn-LVK的最适温度为75℃，并且在90℃时的相对酶活仍然能够保持在60％左右。将纯化的木聚糖酶xyn-LVK稀释到所需浓度，将样品置于90℃的烘箱中，分别在2min、4min、6min、8min、10min、15min、20min取出酶液，冷却至室温，然后检测其酶活，以未处理的原酶液作为100%对照，作相对酶活曲线，结果如图4所示。由图4可知，xyn-LVK在90℃的热稳定性有了明显的提高，在90℃处理4min还能保留65％的酶活，处理8min后还有42％的剩余酶活性。xyn-LVK在90℃的稳定性实验结果表明，该木聚糖酶能够抵御饲料高温制粒时短暂的高温处理。实施例2本发明的含有耐高温木聚糖酶的动物饲料对黄羽肉鸡生长性能的影响。试验时间：2014年7月—8月；试验地点：广东某大型饲料企业；试验设计：选取1日龄黄羽肉鸡800只，分4个处理，分别为正对照组、试验I组、负对照组和试验II组。每个处理4个重复，每个重复50只，正式试验期42天。基础日粮由以下质量分数的组份组成：玉米66.50%、豆粕：19.50%、玉米蛋白粉7.10%、油脂3.00%、磷酸氢钙0.37%、石粉1.47%、赖氨酸0.57%、蛋氨酸0.22%、食盐0.17%、胆碱0.10%、预混料1%。预混料中含微量元素、维生素、消化酶和酸化剂。基础日粮上通过调整油脂添加量减掉50kcal/kg。测定指标：出栏重、料肉比。试验结果：由上表可知，与正对照组相比，试验I组出栏重增加3.49%；与负对照组相比，试验II组出栏重增加3.13%；与正对照组相比，试验II组出栏重增加2.33%；与正对照组相比，试验I组料肉比降低3.47%，与负对照组相比，试验II组料肉比降低4.49%；与正对照组相比，试验II组料肉比降低1.73%。由此可知，本发明的含耐高温木聚糖酶的动物饲料用于饲养肉禽可提高肉禽的体重和饲料转化率（料肉比越低，饲料转化率越高）。实施例3本发明的含有耐高温木聚糖酶的动物饲料对乳仔猪生长性能的影响。试验时间：2014年9月—10月；试验地点：广东某大型猪场；试验设计：选取21日龄体重相近的断奶乳猪150头，随机分成2个组，每个组5个重复，每个重复15头，正式试验期28天。基础日粮由以下质量分数的组份组成：玉米70.25%、豆粕22.15%、鱼粉5.0%、磷酸氢钙1%、石粉0.35%、食盐0.25%、预混料1%。预混料中含微量元素、维生素、消化酶和酸化剂。测定指标：日增重；日采食量；料肉比；腹泻率。试验结果：由上表可知，与对照组相比，试验I组、试验II组日增重分别增加9.07%、10.62%；与对照组相比，试验I组、试验II组日采食量分别增加6.81%、7.66%；与对照组相比，试验I组、试验II组料肉比分别降低2.19%、2.73%；与对照组相比，试验I组、试验II组腹泻率分别降低32%、34%。由此可知，本发明的含耐高温木聚糖酶的动物饲料用于饲养断奶猪能使断奶猪的日增重和日采食量增加以及提高饲料转化率（料肉比越低，饲料转化率越高），并能降低腹泻率。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表<110>深圳市绿微康生物工程有限公司<120>一种含有耐高温木聚糖酶的动物饲料及其应用<130>LVK201503<160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>225<212>PRT<213>瘤胃真菌（Neocallimastixpatriciarum）<400>1GlnSerPheCysSerSerCysSerHisSerCysGlnSerValLysVal151015ThrGlyAsnLysValGlyThrIleGlyGlyValGlyTyrGluLeuTrp202530AlaAspSerGlyAsnAsnSerAlaThrPheTyrSerCysGlySerPhe354045SerCysThrPheGlnAsnAlaGlyAspTyrLeuCysArgSerGlyLeu505560SerPheAspSerThrLysThrProSerGlnIleGlyArgMetLysAla65707580AspPheLysLeuValLysGlnAsnSerSerAsnValGlyTyrSerTyr859095ValGlyValTyrGlyTrpThrArgSerProLeuValGluTyrTyrIle100105110ValAspAsnTrpLeuSerProPheProProGlyAspTrpValGlyAsn115120125LysLysHisGlySerPheThrIleAspGlyAlaGlnTyrThrValTyr130135140GluAsnThrArgThrGlyProSerIleAspGlyAspThrThrPheAsn145150155160GlnTyrPheSerIleArgGlnGlnAlaArgAspCysGlyThrIleAsp165170175IleSerAlaHisPheAspGlnTrpGluLysLeuGlyMetThrMetGly180185190LysLeuHisGluAlaLysValLeuGlyGluAlaGlyAsnValAsnGly195200205GlyAlaSerGlyThrAlaAspPheCysTyrAlaLysValTyrIleGly210215220Asp225<210>2<211>678<212>DNA<213>瘤胃真菌（Neocallimastixpatriciarum）<400>2caaagtttctgtagttcatgttctcactcttgtcaaagtgtaaaggtaaccggcaacaag60gttggaactattggtggtgttggttacgaattatgggctgatagtggtaataacagtgct120actttctattcttgtggttccttctcatgtactttccaaaatgctggggattacttatgt180cgtagtggtctttctttcgatagtactaagaccccatctcaaattggtcgtatgaaggct240gatttcaaacttgtcaaacaaaatagttccaatgttggttattcctatgttggtgtttac300ggttggactagaagtccacttgtcgaatactacattgtcgataattggcttagtccattc360ccaccaggtgattgggttggtaacaagaagcatggttctttcactattgatggtgctcaa420tacactgtttatgaaaacactcgtactggtccatctattgatggtgataccaccttcaat480caatactttagtattcgtcaacaagctcgtgattgtggtaccattgatatttctgctcac540tttgatcaatgggaaaagcttggtatgactatgggtaaattacatgaagccaaggtttta600ggtgaagccggtaacgttaacggtggtgccagtggtactgctgatttctgttacgcaaag660gtttacattggtgattaa678<210>3<211>1437<212>DNA<213>里氏木霉（Trichodermareesei）<400>3gacgcagaagaaggaaatcgccccgccggttccgtaaaaaaaatatgagcgcagggacaa60gcacagccttggccctgggcctagccttgcgccttgtttgatgcaatcggcgacatgtcg120aatgctgtaattttttttgtttaggttccccttttccttttgtgttaataataattctcg180aagggcgctgattttgaaatttgtcggtgagagccaaacggatatacaggcgcggctgat240gaataatgatgaatcgagctgacttgatgctgtatgtacaatattgactgcgaggaccat300caggtgttgtatggatggaatcattctgtaaccaccaaggtgcatgcatcataaggtatt360ctcctcagctcaccaacaacgaacgatggccatgttagtaaaggcaccgtgatggcaaga420tagaaccactattgcatctgcgcttcccacgcacagtacgtcaatgtaacgtcaaagccg480ccctcccgtaacctcgcccgttgttgctccccccgattgcctcaatcacatagtacctac540ctatgcattatggcgcctcaacccacccccccagattgagagctaccttacatcaatatg600gccagcacctcttcggcgatacatactcgccaccccagccggggcgattgtgtgtactag660gtaggctcgtactataccagcaggagaggtgctgcttggcaatcgtgctcagctgttagg720ttgtacttgtatggtacttgtaaggtggtcatgcagttgctaaggtacctagggagggat780tcaacgagccctgcttccaatgtccatctggataggatggcggctggcggggccgaagct840gggaactcgccaacagtcatatgtaatagctcaagttgatgataccgttttgccaggatt900aggatgcgagaagcagcatgaatgtcgctcatccgatgccgcatcaccgttgtgtcagaa960acgaccaagctaagcaactaaggtaccttaccgtccactatctcaggtaaccaggtacta1020ccagctaccctacctgccgtgcctacctgctttagtattaatctttccacctccctcctc1080aatcttcttttccctcctctcctcttttttttttcttcctcctcttcttctccataacca1140ttcctaacaacatcgacattctctcctaatcaccagcctcgcaaatcctcaggttagtat1200tactactactacaatcatcaccacgatgctccgcccgacgatgcggcttctgttcgcctg1260cccctcctctcactcgtgcccttgacgagctaccccgccagactctcctgcgtcaccaat1320ttttttccctatttacccctcctccctctctccctctcgtttcttcctaacaaacaacca1380ccaccaaaatctctttggaagctcacgactcacgcaagctcaattcgcagatacaaa1437<210>4<211>51<212>DNA<213>里氏木霉（Trichodermareesei）<400>4atgtatcggaagttggccgtcatcacggccttcttggccacagctcgtgct51<210>5<211>909<212>DNA<213>里氏木霉（Trichodermareesei）<400>5gtgctgtgttcctcagaatgggccccagaagggcgtcgagcattgtctatgaatgcaaac60aaaaatagtaaataaatagtaattctggccatgacgaatagagccaatctgctccacttg120actatccttgtgactgtatcgtatgtcgaacccttgactgcccattcaaacaattgtaaa180ggaatatgagctacaagttatgtctcacgtttgcgtgcgagcccgtttgtacgttatttt240gagaaagcgttgccatcacatgctcacagtcacttggcttacgatcatgtttgcgatctt300tcggtaagaatacacagagtaacgattatacatccatcgctttctatgattaggtactca360gacaacacatgggaaacaagataaccatcgcatgcaaggtcgattccaatcatgatctgg420actggggtattccatctaagccatagtaccctcgagagaaggaatggtaggacctctcag480gcgtccaccatctgtgctgcaaatccaagaaaccccccaaaagcacctacctatctacct540agagtaatctgcacgagaaaagaaaaggagcagaagaagaatgatctcaagaggccgtga600acgcagaaacacactcctcccaacttttcaagttttgaacaaaaaaagaaagatgaggac660tagaagatggagtatttccttcttagagagctctcggtgaggtgacctgtcagggtttac720ctcaaaccgtctgtggttctatccaattaatcaagtccctctcctctcctcttctctcct780gtcctttcatagaatcccttttccttgttgcttgatcgaagcgggttatcgacgccacca840aagtattgtcttggtgacttatcaaatccctttggtgatcaaacagcccccgagtgatca900gatccgtaa909当前第1页1 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