一种Mcl‑shRNA真核表达质粒的应用的制作方法

本发明涉及一种真核表达质粒的应用，具体涉及一种Mcl-shRNA真核表达质粒的应用。
背景技术：
：结核病可累及全身多个脏器，其中肺结核最为常见。2015全球结核病报告数据显示，在2014年全球向WHO报告了600万例结核病新病例，估计有48万耐多药结核病病例，其中半数以上(54％)出现在印度，中国和俄罗斯，而且我国一直处于九个结核病高负担国家之一，我国三分之一左右的人口已感染了结核杆菌，受感染人数超过4亿，我国现有肺结核病人约500万。如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。卡介苗是现有的唯一一种抗结核病疫苗，在大部分结核病高发国家，儿童出生一年内就要接种卡介苗，但由于卡介苗不能可靠地预防肺结核，结核潜伏宿主巨噬细胞感染严重。目前，继卡介苗之后，在结核病防治疫苗研发过程中主要集中在亚单位疫苗、减毒活疫苗包括重组疫苗、非分歧杆菌的减毒活载体，裸DNA疫苗四个方向。而DNA疫苗作为第三代疫苗，与减毒、灭活疫苗(第一代疫苗)，亚单位疫苗(第二代疫苗)相比较具有明显的优势，而且制备方便快捷，已经成为结核病疫苗研究的一个热点。现有整合RNAi技术的结核核酸疫苗存在的问题：(1)核酸疫苗长期在体内存在，是否会引起机体的过程免疫或产生免疫耐受，导致机体的免疫抑制；(2)外源基因进入机体内是否会与宿主的基因发生整合，导致宿主细胞肿瘤基因活化，且进入宿主细胞DNA最终去向不定；(3)持续抗原表达所激起的强烈CTL应答可能对机体其他细胞产生毒性杀伤作用；(4)接种后会不会引起机体免疫功能发生紊乱，产生抗DNA抗体。目前，单核巨噬细胞在吞噬结核杆菌之后受结核杆菌调控不能正常凋亡而成为其理想的庇护所，其中一个主要原因既MCL-1抗凋亡基因受到正向调控而表达异常，并且越来越多的证据表明，在表达Mcl-1蛋白的细胞中，Mcl-1水平可能是决定细胞生存的关键因素。因此，针对我国结核病的发病率，患病率和死亡率的高水平以及卡介苗预防效果不佳、结核病与艾滋病等疾病交叉伴发以及结核杆菌多重耐药等问题，亟待研制一种新型的抗结核免疫制剂或疫苗。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于引起或产生宿主免疫应答的真核表达质粒Mcl-1-shRNA在制备结核杆菌疫苗中的应用。本发明基于RNAi具有高度的序列专一性且能有效的干扰、特异性地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量降低，以及shRNA表达载体能够在体内持续生成siRNA，可对靶基因维持较长时间的基因沉默的优点，构建出靶向Mcl-1的真核表达质粒Mcl-1-shRNA，将这个质粒应用在抗结核中，实验结果表明，这个质粒可以抑制抗凋亡基因mcl-1的表达，增加感染了结核的宿主巨噬细胞的凋亡，可以抑制结核的播散，为结核治疗提供新靶点和新思路。但在应用之前还需要对Mcl-1-shRNA靶向重组质粒进行筛选，筛选出对Mcl-1抑制效率较高的质粒表达载体MCL-1shRNA3。本发明基于RNAi技术，针对潜伏在宿主巨噬细胞内的结核分枝杆菌，通过构建靶向沉默Mcl-1的Mcl-1-shRNA真核表达质粒，引起或产生宿主巨噬细胞的免疫应答，来调控潜伏有结核分枝杆菌的宿主巨噬细胞的凋亡，当Mcl-1-shRNA真核表达质粒修饰的结核分枝杆菌经历预期抑制或降低Mcl-1表达的条件时，呈现潜伏有结核分枝杆菌感染的宿主巨噬细胞的凋亡率的显著增加。本发明Mcl-1-shRNA真核表达质粒修饰的结核分枝杆菌，主要针对潜伏在宿主巨噬细胞内的结核分枝杆菌，解决了结核潜伏感染严重的现状，可用于治疗和/或预防结核病改进疫苗的基础，弥补传统卡介苗防治不理想的缺陷。综上，本发明利用靶向Mcl-1的真核表达质粒Mcl-1-shRNA3修饰潜伏在宿主巨噬细胞内的结核分枝杆菌，不仅抑制MCL-1基因表达，显著增加了潜伏的结核分枝杆菌感染的宿主巨噬细胞的凋亡，而且靶向沉默Mcl-1基因对正常细胞无明显影响，并能激活邻近未感染的巨噬细胞，从而使吞噬有结核杆菌的宿主巨噬细胞启动凋亡程序正常凋亡，杀死寄生于其内的结核分枝杆菌,增强机体对结核分枝杆菌的杀伤能力，阻止结核分枝杆菌在体内的潜伏或播散,以保护免受结核病或降低由潜伏的结核分枝杆菌导致的宿主巨噬细胞感染，增强了宿主巨噬细胞的免疫应答反应，有效控制了结核病的潜伏感染和持续感染，是一种新型安全有效的弥补了以往抗结核疫苗(卡介苗)缺陷的抗结核方式。再则，采用分子靶向技术，有针对性地作用于感染的宿主巨噬细胞，确保了潜伏的结核分枝杆菌的有效清除，是一种不可或缺的抗结核的新型制剂。附图说明图1为shRNA工具载体图谱。图2为流式检测Mcl-1-shRNA3作用于H37Rv感染的Raw264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞，(A)和(B)为应用Mcl-1-shRNA3处理H37Rv感染的小鼠腹腔巨噬细胞后，小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡情况；(C)和(D)为应用Mcl-1-shRNA3处理H37Rv感染的Raw264.7细胞株后，Raw264.7细胞的凋亡情况。其中，流式图从左到右依次为空白对照组；Mcl-1-shRNA3处理组；H37Rv感染组；Mcl-1-shRNA3处理的H37Rv感染组。图3为Mcl-1-shRNA3作用于H37Rv感染的Raw264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞后CFU检测菌的存活情况，(A)小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl-1-shRNA3处理前后H37Rv存活情况；(B)Raw264.7细胞中Mcl-1-shRNA3处理前后H37Rv存活情况。图4为透射电镜观察Mcl-1-shRNA3作用于H37Rv感染的Raw264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞，(A)空白对照组；(B)Mcl-1-shRNA3处理组；(C)H37Rv感染组；(D)Mcl-1-shRNA3处理的H37Rv感染组，以上结果放大倍数为4000倍。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。实施例11、Mcl-1mRNA真核表达质粒的构建：遵循shRNA设计原则，在GenBank中查housemouseMcl-1序号为NM_008562，将Mcl-1mRNA序列交给上海吉凯基因化学技术有限公司处理，该公司针对Mcl-1构建、合成三个针对Mcl-1靶点的shRNA编码克隆和一个阴性对照(空质粒)。该质粒经测序已经证实插入的shRNA编码序列正确，见表1，图1。用Ambion公司“siRNATargetFinder”软件设计3个针对NM_008562靶向小鼠Mcl-1基因cDNA序列的短发夹RNA(shRNA)，并应用在线软件BLAST检索数据库排除其他基因的同源性序列，其携带绿色荧光蛋白“GFP”的Mcl-1-shRNA的真核表达质粒由上海吉凯基因公司构建并合成，并经测序证实，见表1。表1-Mcl-1shRNA构建框架序列ID5’stemloopstem3’Mcl1-RNAi(3328-1)-aGATCCCgtCTGGCATATCTAATAAGATCTCGAGATCTTATTAGATATGCCAGACTTTTTGGATMcl1-RNAi(3328-1)-bAGCTATCCAAAAAgtCTGGCATATCTAATAAGATCTCGAGATCTTATTAGATATGCCAGACGGMcl1-RNAi(3329-1)-aGATCCCgaAAGCTTCATCGAACCATTACTCGAGTAATGGTTCGATGAAGCTTTCTTTTTGGATMcl1-RNAi(3329-1)-bAGCTATCCAAAAAgaAAGCTTCATCGAACCATTACTCGAGTAATGGTTCGATGAAGCTTTCGGMcl1-RNAi(3330-1)-aGATCCCctCCGGAAACTGGACATTAAACTCGAGTTTAATGTCCAGTTTCCGGAGTTTTTGGATMcl1-RNAi(3330-1)-bAGCTATCCAAAAActCCGGAAACTGGACATTAAACTCGAGTTTAATGTCCAGTTTCCGGAGGG2、Mcl-1mRNA真核表达质粒的筛选与鉴定：首先采用半定量的RT-PCR和Westernblot检测不同巨噬细胞株中Mcl-1的表达，筛选出合适的细胞株作为实验用细胞；然后应用构建的三种真核表达质粒Mcl-1-shRNA1-3转染上述筛选出的细胞，通过实时荧光定量PCR和Westernblot检测Raw264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl-1mRNA和蛋白表达的情况，免疫组化检测小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl-1的表达情况，观察真核表达质粒Mcl-1-shRNA对筛选出的巨噬细胞中Mcl-1表达的抑制作用，筛选出抑制效率较高的质粒，最终成功在Raw264.7细胞株和小鼠巨噬细胞中筛选出能够稳定靶向沉默Mcl-1的真核表达质粒Mcl-1-shRNA3(3330-1)。参见2015年7月西安交通大学学报(医学版)的第36卷第4期“靶向沉默巨噬细胞中Mcl-1基因shRNA表达质粒的构建与鉴定”中558至564页的方法。3、Mcl-1mRNA真核表达质粒转染结核分枝杆菌感染的Raw264.7细胞模型和动物模型的构建(1)实验动物：实验小鼠为8周龄SPF级(无特定病原体动物)雌性BALB/c小鼠，重18±2g。(2)结核分枝杆菌菌株的培养、菌悬液的制备①将H37Rv菌株接种于罗氏培养基中，定期观察菌株的生长状况，生长良好的菌株应呈淡黄色颗粒或菜花样。②在生物安全柜内，以灭菌接种环挑取改良罗氏固体培养基上生长3～4周状态良好结核分枝杆菌菌落，置灭菌磨菌器中，加少量含0.05％Tween-80的生理盐水充分研磨，使其成均匀浑浊的菌悬液，然后利用麦氏比浊法调细菌浓度约1.0×107个/ml，标记清楚后置于-20℃冰箱保存、备用。(3)实验分组：将实验动物随机分为H37Rv感染组和对照组，每组10只。感染组小鼠腹腔注射H37Rv结核分枝杆菌造模，注射量约为0.3mL，对照组小鼠仅注射灭菌生理盐水溶液0.3mL，感染小鼠置生物安全三级实验室内，IVC笼具中饲养。Raw264.7巨噬细胞感染组以10:1作为细菌与巨噬细胞的比例感染Raw264.7巨噬细胞，与对照组细胞共同在细胞培养箱中以37℃、5％CO2培养。(4)Mcl-1mRNA真核表达质粒转染结核分枝杆菌感染的Raw264.7细胞模型和动物模型的构建：H37Rv感染组小鼠在感染后1天采用hydrodynamic技术将前期筛选好的Mcl-1-shRNA3注入小鼠体内，对照组采用同样的方法处理；3天后收集小鼠腹腔巨噬细胞，Raw264.7细胞在细菌感染4h后，将前期筛选出的Mcl-1shRNA3以LipofectamineTM2000为载体转染进入感染组和对照组细胞。(5)流式细胞仪检测不同时间段宿主巨噬细胞的凋亡率：刮下细胞，离心，用1ml冷的PBS将细胞洗涤两次；然后以用冷1×bindingbuffer重悬细胞并调节细胞浓度为1×106/ml，吸取100μl细胞悬液于干净的流式管中，每管中加入5μl的AnnexinV-APC和10μl的7-AAD，轻轻混合，于4℃冰箱中避光孵育15min。每管中细胞混合物用1×bindingbuffer补足到500μl，通过流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率并进行分析，试验结果见图2。由图2可知，应用真核表达质粒Mcl-1-shRNA3后，结核分枝杆菌H37Rv菌株感染的Raw264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率与对照组相比，均呈现显著的增加。其中，真核表达质粒Mcl-1-shRNA3修饰结核分枝杆菌H37Rv菌株后，小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率从7.4％增加到25.6％，Raw264.7细胞株的凋亡率也从8.9％增加到26.1％，且差异具有统计学意义(P<0.05)。由此充分说明真核表达质粒Mcl-1-shRNA3的应用可以明显增加感染了结核分枝杆菌的宿主巨噬细胞的凋亡。(6)结核分枝杆菌菌落计数：巨噬细胞感染后24h用含有0.1mL1％TritonX-100的冷PBS裂解，小鼠腹腔巨噬细胞在感染后3d裂解，以释放结核杆菌。结核分支杆菌用含OADC的Middlebrook7H9培养液做连续稀释，取100μl的稀释液接种于罗氏培养基，每个稀释度涂布3个平板，置于37℃温箱中培养，3周后进行菌落计数，试验结果见图3。由图3可知，应用真核表达质粒Mcl-1-shRNA3有效减少了动物模型和细胞模型中结核分枝杆菌H37Rv菌株的存活率，而且用真核表达质粒Mcl-1-shRNA3处理后，在小鼠腹腔巨噬细胞中结核分枝杆菌H37Rv菌株的存活率从log105.9降低到log103.0,约降低49％；而Raw264.7细胞株中也从从log106.9降低到log103.8,约降低45％。由此有力的证实了利用真核表达质粒Mcl-1-shRNA3修饰结核分枝杆菌可以有效降低潜伏的结核分枝杆菌的存活，促进潜伏有结核分枝杆菌的宿主巨噬细胞的凋亡。(7)透射电镜观察小鼠腹腔巨噬细胞形态：收集小鼠腹腔巨噬细胞并培养48小时后，固定在2.5％戊二醛溶液和四氧化锇溶液，通过梯度乙醇脱水，用环氧树脂封片。超薄切片进行收集，染色，用透射电子显微镜成像观察，试验结果见图4。由图4可知，结核分枝杆菌H37Rv菌株感染导致小鼠巨噬细胞的结构完整性被破坏，而用真核表达质粒Mcl-1-shRNA3处理以后，则诱导小鼠巨噬细胞出现核固缩和凋亡来杀死细胞内感染的结核分枝杆菌。由此更加充分的证明了应用真核表达质粒Mcl-1-shRNA3作用于结核分枝杆菌感染的宿主巨噬细胞能够有效应对结核分枝杆菌的感染，增强宿主巨噬细胞的免疫应答反应。综上，在细胞模型和动物模型中，均证实了真核表达质粒Mcl-1-shRNA3能显著增加潜伏的结核分枝杆菌感染的宿主巨噬细胞的凋亡。当前第1页1 2 3