具有肿瘤抑制作用的工频电磁场发生装置和加载方式的制作方法

本发明属于物理学、生物学与医学交叉领域，涉及医疗器械，尤其是肿瘤治疗性电磁场。

背景技术：

低频电磁场频率在300千赫(kHz)之内，不具有热效应但具有生物学效应，其机制尚不明，可能与作用于带电荷的大分子并改变其功能状态有关。磁场对肿瘤的抑制作用已有广泛报道(参见Artacho-Cordón Francisco等，2013，Int J Mol Sci；Tofani S，2015，Curr Topics in Med Chem)。欧盟与美国FDA已批准肿瘤治疗性磁场发生设备(以色列Novocure公司)用于多形性神经胶质母细胞瘤的临床治疗，该技术特征是采用100-300kHz的磁场(参见美国专利US8019414，US8019414，US8406870)。中国专利中也提出了多种具有肿瘤抑制效应的磁场加载方法，其中包括大于0.4特斯拉(T)的强磁场(参见中国专利90100152.X)和脉冲磁场(参见中国专利94111668.9)。在该领域的研究和应用中，电磁场自身属性与作用对象、方式不同，包括时间、强度、脉冲频率、载波频率、间隔时间等参数不同，会产生不同的生物效应。而且磁场的生物物理作用机制复杂，并非单一分子通路起作用，故对磁场的生物学效应，包括抑制肿瘤细胞的效应，并没有统一的和完整的认识。具体效果需针对某种特定的磁场加载方式和特定的作用对象来进行甄别验证。

有一种特殊的加载方式，将直流电产生的静态磁场与超低频交流电产生的交变磁场叠加。在理论上，这种叠加磁场对自由基孤对电子单线态-三线态跃迁的影响最大，可能增加能级跃迁几率、延长自由基的半衰期，从而扩大其生物效应(参见Tofani S,1999，Physica Medica；Barnes FS等，2015，Bioelectromagnetics)。

目前肿瘤治疗通常采用有创的手术治疗以及无创的放化疗。放疗可为全身性或局部性。化疗分为靶向与非靶向。对于放化疗抵抗并且目前没有有效靶向药物的病例，临床上亟待发现新的治疗方法，尤其是无创、低毒副作用的方法。在低频电磁场作用于动物和人类的过程中，尚未发现明显的全身性毒副作用(参见Tofani S等,2002,IEEE Transactions on Plasma Science；Ronchetto F等，2004，Bioelectromagnetics)。

细胞自噬具有重要的病生理功能，大隅良典因在此领域的开拓性贡献获得2016年诺贝尔医学与生理学奖。自噬对细胞命运决定具有双刃剑作用，可帮助细胞存活或诱导细胞凋亡，是恶性肿瘤的重要生物学特征与治疗靶点(参见White E等，2009，Clin Caner Res；Hanahan D等，2011，Cell；Booth LA等，2014，Cell Signal)。低频磁场具有诱导细胞自噬的作用(参见Marchesi N等，2014，Cellular Physiology)，但继而如何影响肿瘤细胞内存活和死亡，以及具体分子机制，均尚未明确了解。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有肿瘤抑制作用的工频电磁场发生装置，是一种超低频、低强度，可作用于生物体并产生特定生物学效应的磁场发生装置和加载方式，该装置和加载方法在体内外具有肿瘤抑制作用。

本发明提供一种工频电磁场发生装置，由工频电源、第一自耦变压器(交流AC)、第二自耦变压器(直流DC)、第一二极管电桥、第二二极管电桥，第一组线圈、第二组线圈、辐照部件、电压检测部件、磁场检测部件、测温部件和终端电脑组成，工频电源分别与第一自耦变压器和第二自耦变压器的一端连接，第一自耦变压器和第二自耦变压器的另一端分别与第一二极管电桥和第二二极管电桥连接，第一二极管电桥的另一端与第一组线圈连接，第二二极管电桥的另一端与第二组线圈连接，辐照部件置于第一组线圈和第二组线圈之间，电压检测部件一端分别与第一组线圈和第二组线圈连接，另一端与终端电脑连接，磁场检测部件和测温部件各自一端分别与辐照部件相连，各自的另一端分别与终端电脑相连。

辐照部件有两种，第一种为细胞辐照平台，针对细胞培养板和培养皿设计，由隔板一、隔板二、以及位于两个隔板之间的载物台组成，细胞培养板放置于载物台之上，隔板一和隔板二间距为12.9厘米，载物台高度可调，保证细胞培养板底部位于辐照区域正中位置。第二种辐照部件为动物辐照平台，主要针对小鼠设计，由隔板一、隔板二、以及位于两个隔板之间的6个动物辐照小室组成，组成动物辐照小室的部件包括前挡板、后挡板、中间隔板、以及小室隔板一、小室隔板二、小室隔板三、小室隔板四，其中前挡板和后挡板钻多个小孔作为透气孔，以免动物发生缺氧，隔板一和隔板二间距为12.9厘米，6个辐照小室位于辐照区域正中位置，每轮辐照可处理6只小鼠。辐照部件的材料选用透明树脂板，可以清洗与紫外消毒。

本发明的另一个目的是提供利用所述装置进行磁场加载的方法，通过以下步骤实现：

采用工频50/60Hz电源，通过直流与交流自耦变压器不断改变电压，从而在辐照部件内部产生叠加的静态(来自直流)与交变(来自交流)电磁场；具体改变电压方案与加载的磁场强度如下：分为T1-T8共8个时间段，T1时间段直流电压为3毫伏(mV)，产生静态电磁场强度为2.97毫特斯拉(mT)，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T2时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为2.5mV，产生交变电磁场平均强度为2.47mT；T3时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T4时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为2.5mV，产生交变电磁场平均强度为2.47mT；T5时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1mV，产生交变电磁场平均强度为1.08mT；T6时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T7时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1mV，产生交变电磁场平均强度为1.08mT；T8时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；辐照区域内部不同位置总磁场强度相同，T1至T8时间段平均磁场强度为5.5mT；T1-T8时间段每次改变电压持续辐照3.5-10分钟，每轮辐照时间累计30-90分钟，每日辐照2-4轮，对于细胞和动物每天总辐照时间为60-120分钟。

本发明描述的具有肿瘤抑制效应的电磁场，其频率在30-300Hz范围内，静态(直流)与交变(交流)电磁场总强度在1-10mT范围内，静态(直流)与交变(交流)电磁场强度比值在0.5-2.5范围内。

磁场作用时间为，各个时间段每次改变电压持续辐照3.5-10分钟，每轮辐照时间30-90分钟，对于细胞和动物每天总辐照时间为60-120分钟，此装置和加载方法对多种肿瘤产生显著的体内外抑制作用，磁场作用可以增加细胞内超氧自由基含量、并促进细胞自噬。

通过本发明中描述的电磁场发生装置和加载方式，对多种肿瘤产生显著的体内外抑制作用，磁场作用可以增加细胞内超氧自由基含量、并促进细胞自噬。在细胞体外培养和细胞活力实验中，显示所产生的磁场可以抑制多种肿瘤细胞生长，包括肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌，结直肠癌等细胞；在体外实验中，可以有效抑制结直肠癌和乳腺癌的生长和转移。

本发明具有如下有益效果：(1)装置设计合理，采用独特的工频，实施方便；(2)将直流电产生的静态磁场与交流电产生的交变磁场叠加，可影响磁场中的自由基，扩大其生物效应；(3)辐照部件内磁场强度均匀；(4)操作简便，通过改变电压即可实现加载方案；(5)持续监测辐照部件内部产生磁场的相关电压、磁场强度、温度，高度可控；(6)置于辐照部件内的生物体所受干扰小，无创伤；(7)对多种肿瘤具有显著的抑制作用，且毒副作用低；(8)对细胞自噬具有促进作用。

附图说明

图1是本发明电磁场发生装置结构示意图。

图2是本发明装置辐照部件之一，置于磁场中的细胞辐照平台示意图。

图3是本发明装置辐照部件之二，置于磁场中的动物辐照平台示意图。

图4是本发明电磁场加载方式的主要参数，即直流(DC)与交流(AC)电压变化方案与产生的对应电磁场强度，图中交流电压以平均值表示。

图5是本发明针对肾母细胞瘤细胞G401的抑制效果图。

图6是本发明针对神经母细胞瘤细胞CHLA255的抑制效果图。

图7是本发明针对体内生长结直肠细胞WiDr的抑制效果图。

图8是本发明针对乳腺癌细胞MBA-MD-435肺转移的抑制效果图。

图9是本发明中电磁场改变肾母细胞瘤细胞G401内超氧自由基含量的效果图。

图10是本发明中电磁场抑制肿瘤细胞G401与CHLA255的原理图，包括HRP化学发光法显影自噬相关蛋白条带。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1，本发明提供的一种具有肿瘤抑制作用的工频电磁场发生装置，由一个工频电源1、第一自耦变压器2(交流AC)、第二自耦变压器3(直流DC)、第一二极管电桥4、第二二极管电桥5，第一组线圈6、第二组线圈7、辐照部件8、电压检测部件9、磁场检测部件10、测温部件11和终端电脑12组成，工频电源1分别与第一自耦变压器2和第二自耦变压器3的一端连接，第一自耦变压器2和第二自耦变压器3的另一端分别与第一二极管电桥4和第二二极管电桥5连接，第一二极管电桥4的另一端与第一组线圈6连接，第二二极管电桥5的另一端与第二组线圈7连接，辐照部件8置于第一组线圈6和第二组线圈7之间，电压检测部件9一端分别与第一组线圈6和第二组线圈7相连，另一端与终端电脑12相连，磁场检测部件10和测温部件11各自一端分别与辐照部件8相连，各自的另一端分别与终端电脑12相连。

辐照部件8有两种，第一种为细胞辐照平台，针对细胞培养板和培养皿设计，由隔板一13、隔板二14、以及位于两个隔板之间的载物台15组成，细胞培养板放置于载物台之上，隔板一13和隔板二14间距为12.9厘米，载物台高度可调，保证细胞培养板底部位于辐照区域正中位置。

第二种辐照部件8为动物辐照平台，主要针对小鼠设计，由隔板一13、隔板二14、以及位于两个隔板之间的6个动物辐照小室16组成，组成动物辐照小室16的部件包括前挡板18、后挡板19、中间隔板20、以及小室隔板一21、小室隔板二22、小室隔板三23、小室隔板四24，其中前挡板18和后挡板19钻多个小孔17作为透气孔，以免动物发生缺氧，隔板一13和隔板二14间距为12.9厘米，6个辐照小室16位于辐照区域正中位置，每轮辐照可处理6只小鼠。辐照部件8的材料选用透明树脂板，可以清洗与紫外消毒。

具体磁场加载方式采取如图4所示方案，采用工频50/60Hz电源，通过直流与交流自耦变压器不断改变电压，从而在辐照部件内部产生静态与交变场叠加的电磁场；具体改变电压方案与产生的磁场强度如下：分为T1-T8共8个时间段，T1时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T2时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为2.5mV，产生交变电磁场平均强度为2.47mT；T3时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T4时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为2.5mV，产生交变电磁场平均强度为2.47mT；T5时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1mV，产生交变电磁场平均强度为1.08mT；T6时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；T7时间段直流电压为3mV，产生静态电磁场强度为2.97mT，交流电压平均值为1mV，产生交变电磁场平均强度为1.08mT；T8时间段直流电压为4mV，产生静态电磁场强度为3.95mT，交流电压平均值为1.5mV，产生交变电磁场平均强度为1.48mT；辐照区域内部不同位置总磁场强度相同，T1至T8时间段平均磁场强度为5.5mT；T1-T8时间段每次改变电压持续辐照3.5-10分钟，每轮辐照时间累计30-90分钟，每日辐照2-4轮，对于细胞和动物每天总辐照时间为60-120分钟。

实施例2，本发明作用于培养的肾母细胞瘤细胞G401，使用图1与图2所示装置，按照图4所述方案处理细胞，每次改变电压作用3.5分钟，每轮作用时间共约30分钟，每天处理4轮，共2小时电磁场辐照时间；阴性对照组将细胞置于未加载电磁场的线圈之间的置物台，时间相同；阳性对照为顺铂(江苏豪森药业股份有限公司)，给药浓度为500nM，每天给药1次。

具体实施过程是：

细胞系和培养方法：肾母细胞瘤细胞G401，此细胞为贴壁细胞，用含10％胎牛血清的McCoy培养基培养于37℃孵箱，含5％二氧化碳和饱和水蒸气；

主要设备：工频电磁场发生装置，细胞培养箱，活细胞计数仪，多功能酶标仪；

主要试剂：CCK8试剂盒，荧光探针DCFH-DA，BCA试剂盒，40％丙烯酰胺凝胶贮存液，Tris碱，TEMED，SDS，蛋白酶抑制剂，蛋白标准品，HRP化学放光检测试剂盒；

抗体：一抗包括LC3，GAPDH，p62，抗鼠与抗兔HRP偶联二抗；

细胞活力实验：将肾母细胞瘤细胞G401以1×10∧5个/孔的密度接种于6孔板，每个处理条件3个复孔，对照组、辐照组和顺铂组按照上述方案分别处理，每天收集前一天处理的细胞，用活细胞计数仪计数，根据读数计算细胞数目，做出细胞增殖曲线和电磁场对细胞的抑制曲线；

统计分析：每种辐照条件重复3次，每次3个复孔，结果以平均值±标准误表示，结果做T检验，以P<0.05作为具有显著性差异指标；

如图5所示，左侧图为细胞增殖曲线，其中X轴为磁场辐照天数，Y轴为细胞数，曲线一为对照组细胞增殖曲线，曲线二为辐照组细胞增殖曲线，曲线三为阳性对照顺铂组细胞增殖曲线；右侧图为细胞抑制曲线，其中X轴为磁场辐照天数，Y轴为抑瘤率(％)，曲线一为辐照组细胞抑制率曲线，曲线二为顺铂组细胞抑制率曲线；图中结果显示辐照组细胞增殖减慢，抑制率增加；

超氧自由基含量测定：将肾母细胞瘤细胞G401以1×10∧4个/孔的密度接种于96孔板，每个处理条件3个复孔，辐照组按照图4所述方案处理，每轮时间30分钟，对照组放在未加载电磁场的线圈之间的置物台，一共处理4轮，辐照时间共计120分钟，每轮处理结束后用荧光探针DCFH-DA(10μM)在培养箱内孵育20分钟，孵育后用PBS洗去未进入细胞的探针，用多功能酶标仪检测，激发波长488nm，吸收波长525nm，分别读取各组荧光强度值；如图9所示，其中X轴为磁场辐照时间，Y轴为细胞内探针荧光强度，即超氧自由基的相对含量，曲线一为对照组细胞内超氧自由基的相对含量，曲线二为辐照组细胞内超氧自由基的相对含量，图中结果显示辐照组细胞内超氧自由基在接受一轮30分钟的辐照后即比对照组有所增高，并且一直持续，直到120分钟时降至与对照组接近的水平，此结果说明此磁场加载方式的确可以提高细胞内自由基含量，并且显效迅速，时间在1小时之内。

免疫杂交实验：细胞处理后离心、PBS洗涤后，悬浮于预冷的RIPA缓冲液(加入蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)，试剂盒BCA法进行蛋白定量后，用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，每孔上样量为20μg，用适当的抗体进行免疫杂交后，HRP化学发光法显影蛋白条带，如图10所示，辐照后p62降低，LC3-II增加，说明辐照可诱导G401细胞自噬。

实施例3，本发明作用于培养的神经母细胞瘤细胞CHLA255，使用图1与图2所示装置，按照图4所述方案处理细胞，每次改变电压作用3.5分钟，每轮作用时间约30分钟，每天处理4轮，共2小时电磁场辐照时间；阴性对照组将细胞置于没有加载电磁场的线圈之间的置物台相同时间；阳性对照为顺铂(江苏豪森药业股份有限公司)，给药浓度为500nM，每天给药1次。

具体实施过程是：

细胞系和培养方法：神经母细胞瘤细胞CHLA255，此细胞为贴壁细胞，用含10％胎牛血清的IMDM培养基培养于37℃孵箱，含5％二氧化碳和饱和水蒸气；

主要设备：工频电磁场发生装置，细胞培养箱，活细胞计数仪；

主要试剂：CCK8试剂盒，BCA试剂盒，40％丙烯酰胺凝胶贮存液，Tris碱，TEMED，SDS，蛋白酶抑制剂，蛋白上样标准品，HRP化学放光检测试剂盒；

抗体：一抗包括LC3，GAPDH，p62，抗鼠与抗兔HRP偶联二抗；

细胞活力实验：将神经母细胞瘤细胞CHLA255以1×10∧5个/孔的密度接种于6孔板，每个处理条件3个复孔，对照组、辐照组和顺铂组按照上述方案分别处理，每天收集前一天处理的细胞，用活细胞计数仪计数，根据读数计算细胞数目，做出细胞增殖曲线和电磁场对细胞的抑制曲线；

统计分析：每种辐照条件重复3次，每次3个复孔，结果以平均值±标准误表示，结果做T检验，以P<0.05作为具有显著性差异指标；

如图6所示，左侧图为细胞增殖曲线，其中X轴为磁场辐照天数，Y轴为细胞数，曲线一为对照组细胞增殖曲线，曲线二为辐照组细胞增殖曲线，曲线三为顺铂组细胞增殖曲线；右侧图为细胞抑制曲线，其中X轴为磁场辐照天数，Y轴为抑瘤率(％)，曲线一为辐照组细胞抑制率曲线，曲线二为顺铂组细胞抑制率曲线，图中结果显示辐照组细胞增殖减慢，抑制率增加；

免疫杂交实验：细胞处理后离心、PBS洗涤后，悬浮于预冷的RIPA缓冲液(加入蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)，BCA法进行蛋白定量后，用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，每孔上样量为20μg，用适当的抗体进行免疫杂交后，HRP化学发光法显影蛋白条带，如图9所示，辐照后p62降低，LC3-II增加，说明辐照可诱导CHLA255细胞自噬。

实施例4，本发明作用于体内生长的结直肠癌细胞WiDr，

具体实施过程是：裸鼠皮下接种结肠腺癌细胞WiDr后，辐照组使用图1与图3所示装置，按照图4所述方案处理动物，每次改变电压作用10分钟，每轮辐照时间为70分钟，每天辐照1轮。对照组同时放入无磁场的动物辐照平台中。每日记录辐照组与对照组小鼠生存情况。如图7所示，辐照组小鼠生存期显著延长。

实施例5，本发明针对乳腺癌细胞MBA-MD-435，

具体实施过程是：SCID鼠皮下接种乳腺癌细胞MBA-MD-435，辐照组使用图1与图3所示装置，按照图4所述方案处理动物，每次改变电压作用10分钟，每轮辐照时间为70分钟，每天处理1轮，每周5天，连续4周。阴性对照组同时放入不加载磁场的辐照平台内。阳性对照组给予环磷酰胺，剂量为50mg/kg，每日1次。4周处理结束后处死动物，取肺脏固定，病理切片，观察并计数肺转移灶数目与大小，**P<0.01,***P<0.001，如图8所示，辐照组小鼠转移灶数目显著减少，效果与环磷酰胺相当，同时辐照组转移灶显著减小，辐照抗转移效果优于环磷酰胺。