预防蛋白质二硫键还原的制作方法
本披露涉及单克隆抗体和所得产物变体的还原。本文披露了用于增加含完整二硫键的蛋白质产量的方法、用于减少含二硫键蛋白质的还原的方法、以及用于减少含二硫键蛋白质的还原电位的方法。
背景技术：
单克隆抗体(mab)能够以高亲和力和异常的特异性结合多种靶标。因此，已成功设计mab以治疗多种疾病和病症，包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病和炎症、心血管疾病和眼科疾病。临床上mab的高成功率使其成为一类快速发展且日益重要的治疗方法。为了满足对这些救命分子日益增长的需求，已经投入大量精力来开发被设计用于增加抗体滴度同时保持一致产品质量的mab的制造工艺。在过去的十年中，抗体滴度已经实现快速增加，目前的制造工艺产生大于10g/l的mab。
许多蛋白质分子仅在形成稳定的分子间和分子内二硫键的情况下起作用，以正确地折叠和维持功能。这些蛋白质分子的实例是免疫球蛋白和含有免疫球蛋白结构域的细胞表面受体、核糖核酸酶、乳白蛋白、胰岛素、角蛋白、血球凝集素、病毒膜蛋白、神经内分泌蛋白7b2、表皮生长因子、雄性腺体激素、ap-1样转录因子yap1、乙酰胆碱受体、树眼镜蛇毒素、骨形态发生蛋白2-a、绒毛膜促性腺激素、组蛋白h3、血小板反应蛋白1、disintegrinschistatin、snaclecbotrocetin、乙酰胆碱酯酶胶原蛋白尾肽、蓝豆蛋白δ-2、氧化还原酶、硫化物脱氢酶和溶菌酶。标准抗体分子包括四条肽链，即两条重链和两条轻链。通过在四条链之间形成二硫键，这四条肽链在功能性抗体分子中正确地折叠在一起。抗体分子的肽链内形成的二硫键的数量根据抗体亚型而变化。
在制造期间可以发生含内部锚定二硫键蛋白质的二硫键的还原。早在2010年就针对制造免疫球蛋白报道了这个问题，并随后在整个行业范围内被观察到(hutterer等人，2013,mabs,5:608–613；和kao等人，2010,biotechnol.bioeng.[生物技术生物工程],107:622–632)。链间二硫键的还原导致功能性抗体的丧失，并且需要更复杂的纯化过程以去除无活性的副产物(mun等人，2014,biotechnol.bioeng.[生物技术生物工程],112(4):734-742)。在mab工艺开发期间，必须将片段和聚集体去除至足够的水平，因为它们具有与增加的免疫原性相关的风险和对药物功效的未知影响。此外，这些杂质的存在还会影响产品在储存期间的稳定性，导致保质期缩短。
蛋白质或多肽的片段化可能由产物不稳定性(cordobaa.等人，2005,j.chrom.b.[色谱法杂志b卷],818(2):115-21)或通过细胞中存在的宿主细胞蛋白(hcp)的蛋白水解活性(gao等人，2011,biotechnol.bioeng.[生物技术生物工程]108(4):977-982)引起，而聚集可以在制造工艺期间和之后的各个步骤(例如在细胞培养、收获、纯化、冻融、装瓶(vialing)和储存期间)发生。通常在工艺开发期间实施策略，以改善这两种产品质量属性。这些包括：优化生物反应器条件以防止细胞培养期间的片段化或聚集体形成；优化收获条件以使细胞裂解最少化(hutchinsonn.等人，2006,biotechnol.bioeng.[生物技术生物工程],95(3):483-491)；在纯化过程(例如离子交换、疏水相互作用和混合模式)中结合色谱抛光(polishing)步骤以从目的产物中分离杂质；和配制品开发过程中的赋形剂筛选，以使分子保质期期间的聚集和片段化最少化。
各种策略已经被用于减少制造工艺期间的抗体还原，这些策略包括冷却、提供氧化性存储环境、保持持续更短的时间段、和添加至少一种还原抑制剂。以前的报告将细胞培养蛋白质制造工艺中经历的还原仅归因于硫氧还蛋白系统。这些研究使用针对硫氧还蛋白系统的一定浓度的抑制剂，在这些浓度下这些抑制剂不再对硫氧还蛋白系统具有特异性(kao等人，2010,biotechnol.bioeng.[生物技术生物工程],107:622–632；kao等人，2013,美国专利号8,574,869)。通过使用针对硫氧还蛋白系统的一定浓度的抑制剂(在这些浓度下这些抑制剂不再对硫氧还蛋白系统具有特异性)，kao等人将细胞培养制造工艺中经历的还原仅归因于硫氧还蛋白系统，并评论了谷胱甘肽还原酶系统在抗体还原中缺乏作用。
因此，有必要避免含二硫键蛋白质的制造或储存期间的二硫键还原。避免制造期间含二硫键蛋白质的还原可以提高整个保质期内完整蛋白质的稳定性。因此，需要开发含二硫键蛋白质的制造工艺，该工艺可避免二硫键的还原并导致整个保质期内完整蛋白质的稳定性增加。
技术实现要素：
本发明涉及用于防止含二硫键蛋白质的二硫键还原以增加整个保质期内完整蛋白质的稳定性的方法。该方法通过减少含二硫键蛋白质的还原或通过减少制造工艺期间含二硫键蛋白质的还原电位来改善纯化的含二硫键蛋白质的稳定性。
在实施例中，本披露涉及用于提高细胞培养物或溶液中含完整二硫键的目的蛋白质产量的方法，该方法包括在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂、或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂两者的存在下制造含二硫键的目的蛋白质，由此，在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在下制造的细胞培养物或溶液中的含完整二硫键的蛋白质的量更高。
在某些实施例中，本披露涉及用于在制造工艺中提高含完整二硫键的目的蛋白质的产率的方法，该方法包括：检测包含含二硫键的目的蛋白质的培养物和/或溶液中谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的存在，并添加谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶抑制剂以减少含二硫键的目的蛋白质的还原。在某些实施例中，本披露涉及还包括测定所检测的谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的活性的方法。在另外的实施例中，测定谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的活性包括：向在制造工艺期间得到的样品中添加5,5'-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)；将硫氧还蛋白还原酶抑制剂和谷胱甘肽还原酶抑制剂中的至少一种添加到含有dtnb的样品的一部分中；和监测该样品中波长412nm处的dtnb的还原；其中，在没有硫氧还蛋白还原酶抑制剂和谷胱甘肽还原酶抑制剂中的至少一种的情况下，该样品中dtnb的较高还原指示硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶的活性。在某些实施例中，在监测还原之前将nadph、氧化型谷胱甘肽和缓冲液添加到样品中。
在实施例中，本披露涉及通过在过程期间将细胞外胱氨酸水平维持在0之上来提高细胞培养或发酵过程中含完整二硫键的目的蛋白质的产量或降低含二硫化物的目的蛋白质的还原电位的方法。在某些方面，将完整的目的蛋白质释放到细胞培养液(ccf)中。在某些方面，该过程包括将这些细胞维持在ccf中持续至少2天、至少8天、至少10天、至少12天、至少14天或至少16天。
在本披露的某些方面，该细胞培养过程是哺乳动物或昆虫细胞培养过程，并且该发酵过程是细菌、酵母或真菌发酵过程。在所披露方法的某些方面，将细胞培养或发酵过程中的胱氨酸水平维持在0之上，以防止二硫键还原。在某些方面，在所披露的方法中，相对于有效量的胱氨酸在ccf中未维持在0之上的过程，二硫键还原的电位降低。
在实施例中，本披露涉及用于改善纯化的含二硫键的目的蛋白质的稳定性的方法，该方法包括使用使含二硫键的目的蛋白质保持为具有最少游离巯基的形式的制造工艺，从而降低该制造工艺期间含二硫键的目的蛋白质的还原或还原电位。在本披露的一些实施例中，该制造工艺包括细胞培养阶段、收获阶段、至少一个保持阶段、纯化阶段或其任何组合。在本披露的一些实施例中，该保持阶段包括将该材料存储在该制造工艺期间的任何阶段中。在本披露的一些实施例中，该保持阶段包括在收获阶段之后且在纯化阶段之前将收获的细胞培养液(hccf)储存持续一段时间，多达一小时、多达一天、至少四天、至少一周、至少10天、至少两周、至少一个月、或至少三个月。在本披露的一些实施例中，使含二硫键的目的蛋白质中的游离巯基最少化包括在整个制造工艺中减少二硫键还原。在本披露的一些实施例中，在保持阶段期间在2℃-8℃将hccf存储在气密袋中。
附图说明
图1：示意图表示硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的酶和化学中间体。trx是硫氧还蛋白，gsh是还原型谷胱甘肽，gssg是氧化型谷胱甘肽，l是免疫球蛋白轻链，h是免疫球蛋白重链，以及nadph是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
图2a和图2b：细胞培养中的还原。图2a描绘了来自maba(菱形)、mabb(正方形)和mabc(三角形)的小规模生产反应器的上清液样品中完整(非还原)抗体百分比的时间历程，其使用毛细管电泳评价。图2b描绘了在来自相同小规模反应器的样品中测量的总还原酶活性的时间历程，其使用基于5,5'-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)还原的比色测定法测定。数据代表一式三份实验的平均值±sd。
图3a和图3b：特定还原酶抑制剂对还原酶活性的影响，如使用基于dtnb还原的比色测定法测定的。图3a：将硫氧还蛋白还原酶抑制剂金硫葡糖(atg)添加到重组trxr1/trx1(黑色条)、gr/gssg(灰色条)或具有gr/gssg的trxr1/trx1(散列条)的溶液中图3b：将谷胱甘肽还原酶抑制剂2-乙酰氨基-3-[4-(2-乙酰氨基-2-羧乙基硫烷基硫代羰基-氨基)苯基硫代氨基甲酰基硫烷基]丙酸(2-aapa)添加到重组trxr1/trx1(黑色条)、gr/gssg(灰色条)或具有gr/gssg的trxr1/trx1(散列条)的溶液中。数据代表一式三份实验的平均值±sd。
图4a和图4b：特异性还原酶抑制剂对抗体还原的影响。图4a：将渐增浓度的atg与trxr1/trx1(黑色条)或gr/gssg(灰色条)一起添加到纯化的mabb溶液中并在室温下孵育过夜后获得的完整(非还原)抗体的百分比。图4b：将增加浓度的cu2+添加到具有trxr1/trx1(黑色条)或gr/gssg(灰色条)的纯化的mabb溶液中并在室温下孵育过夜后的完整(非还原)抗体的百分比。数据代表重复实验的平均值±sd。
图5a和图5b：cho还原酶对鉴定的抑制剂的敏感性。图5a：使用无抑制剂(黑色条)；0.5μmatg(灰色条)；100μm2-aapa(散列条)；和0.5μmatg和100μm2-aapa(白色条)两者评价的收集的级分的trxr1和gr还原酶活性。图5b：用与活性trxr1和gr、0.4mmnadph、1mmgssg、3μmcu2+、trx1和100μmatg的合并级分的不同组合孵育过夜后的总完整mabb的百分比。数据代表重复实验的平均值±sd。
图6a和图6b：硫氧还蛋白和谷胱甘肽系统的细胞培养物活性。图6a：在0.5μmatg、100μm2-aapa、以及0.5μmatg和100μm2-aapa两者的存在下，来自maba(黑色条)、mabb(灰色条)、mabc(散列条)和mabd(白色条)的小规模生产反应器的第14天样品的还原酶活性。图6b：来自maba(黑色条)、mabb(灰色条)、mabc(散列条)和mabd(白色条)的小规模生产反应器的第14天样品的样品中trx或gr还原酶活性的百分比。数据代表一式三份实验的平均值±sd。
图7：来自掺有0.1mmatg、3μmcu2+或0.1mmatg和3μmcu2+两者的maba(黑色条)、mabb(灰色条)、mabc(散列条)和mabd(浅灰色条)的小规模生物反应器的第14天细胞培养物样品中剩余的完整(非还原)抗体的百分比。数据代表重复实验的平均值±sd。
图8：生产生物反应器运行br-a、br-b、br-c和br-d中半胱氨酸/胱氨酸浓度的时间历程，其使用超高效液相色谱(uplc)氨基酸分析测量。
图9：通过毛细管电泳测量来自未纯化的细胞培养物样品的完整mabb(lhhl)(图9a)和完整maba(lhhl)(图9b)的量。注意，完整抗体的量从未达到100％，因为这些是在未纯化的细胞培养物样品中测量的。高于阈值细胞培养物氧化还原电位(用黑色虚线表示)，链间二硫键还原最少。图9中的条件具有以下终浓度(收获时)：zn2+浓度范围为0.6-19.6ppm、mn2+浓度范围为0.007-5.5ppm、fe3+浓度范围为0.12-4.2ppm、se2+浓度范围为0.006-7.9ppm、cu2+浓度范围为0.3-6.4ppm、胱氨酸浓度范围为约0-3.5mm、溶解的氧浓度范围为20％-75％的空气饱和度、β巯基乙醇的浓度范围为83-206μm、以及谷胱甘肽的浓度范围为1-750μm。
图10：针对具有(br-j2)和不具有增加的营养补料(br-j1)的条件通过uplc-氨基酸分析测量的生物反应器胱氨酸浓度的时间历程。
图11：针对具有(br-k-2)和不具有增加的营养补料(br-k-1)的条件通过uplc-氨基酸分析br-k生物反应器测量的胱氨酸浓度的时间历程。
图12a至图12c：收获的细胞培养液(hccf)(图12a)；捕获产物(图12b)；和最终抛光产物(图11c)的非还原gx(nr-gx)电泳图。灰色迹线：参考标准；黑色迹线：样品。
图13：从不存在胱氨酸或者在发生还原的分子的位置中存在2mm胱氨酸和4mm胱氨酸的情况下保持2周的hccf的质谱法定量获得的游离巯基的百分比。
图14a和图14b：游离巯基和聚集率随ph变化的变化。图14a当hccf在ph3.2、ph3.4和ph3.6下孵育时游离巯基与igg浓度的比率随时间的变化。图14b：当hccf在ph3.2、ph3.4和ph3.6下孵育时，聚集体随时间的变化。
图15：通过在没有胱氨酸(0mm)存在和有4mm胱氨酸存在的情况下保持2周的hccf光谱法定量获得的链间游离巯基水平的百分比。
图16：通过dntb定量从hccf(其被立即纯化，或在没有胱氨酸(0mm)存在和有4mm胱氨酸存在的情况下保持了两周)产生的纯化过程中间体获得的游离巯基水平。
图17a至图17c：由hccf产生的配制的散装产品的聚集体水平百分比随时间的变化。图17a：由hccf(其在不存在胱氨酸(0mm)或存在4mm胱氨酸的情况下在2℃-8℃下保持了2周)产生的配制的散装产品。图17b：由hccf(其在不存在胱氨酸(0mm)或存在4mm胱氨酸的情况下在25℃下保持了2周)产生的配制的散装产品。图17c：由hccf(其在不存在胱氨酸(0mm)或存在4mm胱氨酸的情况下在40℃下保持了2周)产生的配制的散装产品。
图18a至图18c：从brx-l-1(图18a)、brx-l-2(图18b)、brx-l-3(图18c)纯化的蛋白质a捕获产物的非还原型gx(nr-gx)电泳图
图19：从14天补料分批过程产生的maba药物物质在2℃-8℃的聚集体百分比的时间历程。
图20：从14天或8天补料分批过程产生的maba药物物质在2℃-8℃的聚集体百分比的时间历程。
图21a至图21c：来自暴露于还原电位分析的细胞培养物样品运行结束时的非还原型(nr)gxii分析的电泳图。图21a：来自14天补料分批过程的细胞培养物样品。图21b：来自8天补料分批过程的细胞培养样品。图21c：来自14天补料分批过程的细胞培养物样品，其中含有另外的铜和胱氨酸。l＝轻链；h＝重链。
图22：来自培养物(在补料中含有和不含有另外的铜和胱氨酸)的maba药物物质在2℃-8℃的聚集体百分比的时间历程。
具体实施方式
定义
应注意，术语“一(个/种)”实体是指一个或多个(种)该实体；例如，“一个结合分子”应理解为表示一个或多个结合分子。因此，术语“一个/种(a或an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在此可互换地使用。
此外，在此使用的“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，术语“和/或”如在此在词组如“a和/或b”中使用时，旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)、以及“b”(单独)。同样，术语“和/或”如在词组如“a、b和/或c”中使用时是旨在涵盖以下方面中的每一者：a，b和c；a，b或c；a或者c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
除非另外定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本披露涉及的领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(systèmeinternationaldeunites)(si)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。本文提供的小标题不是本披露的不同方面或各方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
如在此使用，术语“多肽”和“蛋白质”旨在涵盖单数“多肽”或“蛋白质”和复数“多肽”或“蛋白质”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”和“蛋白质”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不是指产物的具体长度，并在此可互换使用。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语被包括在“多肽”或“蛋白质”的定义中，并且这些术语可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。术语“多肽”和“蛋白质”还旨在指多肽或蛋白质在表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸来进行的修饰。多肽或蛋白质可以衍生自生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从指定的核酸序列翻译而来。
如在此使用，术语“目的蛋白质”和“含二硫键的目的蛋白质”可互换使用，并且指的是含有至少一个二硫键的蛋白质。术语“目的蛋白质”是指蛋白质的活性形式，例如，可以实现商业和/或治疗目的的蛋白质的正确折叠的、正确组装的形式。“目的蛋白质”可以根据本文提供的方法制造。目的蛋白质可以是例如治疗性蛋白质，例如抗体或其抗原结合片段，或者诱饵受体蛋白质。“增加目的蛋白质的产量”意味着增加可以实现商业和/或治疗目的的完整的和正确折叠的蛋白质的量，例如通过保持较高比例的处于其完整且正确折叠的、正确组装的形式中的蛋白质。
术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指一种分离的核酸分子或构建体，例如，信使rna(mrna)、cdna或质粒dna(pdna)。多核苷酸可包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如在肽核酸(pna)中所发现)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如dna或rna片段。“核酸序列”是在所引用的核酸中发现的核苷酸序列。
“分离的”核酸或多核苷酸旨在是与其天然环境分离的核酸或多核苷酸的任何形式。例如，凝胶纯化的多核苷酸或编码载体中所含的多肽或蛋白质的重组多核苷酸将被认为是“分离的”。此外，已被工程化为具有克隆限制性位点的多核苷酸区段(例如pcr产物)被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的另外实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或非天然溶液如缓冲液或盐水中的纯化(部分地或基本上)多核苷酸。分离的rna分子包括多核苷酸的体内或体外rna转录物，其中转录物不是将在自然中存在的转录物。分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如在此使用，术语“非天然存在的多核苷酸”或其任何语法变体是明确排除但仅排除是或可能是由法官或行政或司法机构确定或解释为“天然存在”的核酸或多核苷酸的那些形式的条件定义。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”可在此互换使用。抗体(或如在此披露的其片段、变体或衍生物)包含至少重链的可变结构域(对于骆驼科动物物种)或至少重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构已得到相对充分地认识。除非另有说明，术语“抗体”涵盖范围从抗体的小抗原结合片段到全尺寸抗体、双特异性抗体、融合蛋白和抗体药物缀合物的任何物。全尺寸抗体可以是包含两个完整重(h)链和两个完整轻(l)链的igg抗体、包含四个完整重链和四个完整轻链且任选地包含j链和/或分泌组分的iga抗体、或包含十个或十二个完整重链和十个或十二个完整轻链且任选地包含j链的igm抗体。
如在此披露的术语“片段”包括任何抗体还原型物质。完整抗体具有两条重链和两条轻链(lhhl)；抗体片段可具有两条重链和一条轻链(lhh)；或两条重链(hh)；或一条轻链和一条重链(lh)；或一条重链(h)；或一条轻链(l)。
如下文更详细地讨论，术语“免疫球蛋白”包含可在生物化学上区分的广泛的不同类别的多肽或蛋白质。本领域技术人员将了解免疫球蛋白重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们之中有一些亚类(例如γ1-γ4或α1-α2)。此链的性质决定了抗体的“同种型”分别是igg、igm、igaigg或ige。免疫球蛋白亚类(亚型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2等被充分表征，并且已知可赋予功能特化。这些免疫球蛋白中每一种的修饰形式在考虑本披露的情况下对于本领域技术人员而言是可容易辨别的，并且因此处于本披露的范围内。
免疫球蛋白轻链分类为κ或λ。每个免疫球蛋白重链类别可以通过共价二硫键与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链通过二硫键彼此共价键合，并且当免疫球蛋白由例如杂交瘤、b细胞或遗传工程化的宿主细胞表达时，两个重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价键来彼此键合。在重链中，氨基酸序列从y构型的分叉端的n末端延伸至每条链底部的c末端。某些抗体(例如，igg抗体)的基本结构包含经由二硫键共价连接以形成“y”结构(在此也称为“h2l2”或“lhhl”结构或“结合单元”)的两个重链亚基和两个轻链亚基。
术语“化合价”、“二价”、“多价”及其语法等效物，是指在给定的结合分子或结合单元的结合结构域的数量。因此，关于给定的结合分子，例如igm抗体或其片段，术语“二价”、“四价”和“六价”表示分别存在两个结合结构域、四个结合结构域和六个结合结构域。二价或多价结合分子可以是单特异性的，即，所有结合结构域是相同的，或者可以是双特异性的或多特异性的，例如，当两个或更多个结合结构域不同时，例如，结合相同抗原上的不同表位，或与完全不同的抗原结合。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何分子决定簇。在某些方面，表位可以包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些方面，可以具有三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是由抗体结合的靶标的区域。
轻免疫球蛋白链和重免疫球蛋白链两者均划分到具有结构和功能同源性的区域之中。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。在此方面，应了解可变轻链(vl)与可变重链(vh)部分的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(cl)和重链(例如ch1、ch2或ch3)的恒定结构域赋予生物特性如分泌、经胎盘移动性(transplacentalmobility)、fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。n-末端部分是可变区并且在c-末端部分处是恒定区；ch3(或在igm的情况下ch4)结构域和cl结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基-末端。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如fab、fab'和f(ab')2、fd、fvs、单链fvs(scfv)、单链抗体、二硫化物连接的fvs(sdfv)、包括vl或vh域的片段、由fab表达文库产生的片段。
“特异性结合”一般是指抗体或其片段、变体或衍生物经由其抗原结合结构域来结合至表位，并且这种结合需要抗原结合结构域与表位之间有某种互补性。根据此定义，当与抗体或其抗原结合片段将结合至随机、不相关的表位相比，该抗体或其抗原结合片段更容易地经由其抗原结合结构域来结合至表位时，该抗体或其抗原结合片段被认为是“特异性地结合”至该表位。术语“特异性”在本文中用于对某种结合分子结合某种表位的相对亲和力进行定性。例如，与结合分子“b”相比，结合分子“a”可被视为针对给定的表位具有较高特异性，或与结合分子“a”针对相关表位“d”所具有的特异性相比，结合分子“a”可被认为以较高特异性结合至表位“c”。
包含单链抗体或其他结合结构域的抗体片段可以单独存在或与以下中的一种或多种组合存在：铰链区、ch1、ch2、ch3或ch4结构域、j链或分泌组分。还包括抗原结合片段，这些抗原结合片段可以包括可变区与以下中的一种或多种的任何组合：铰链区、ch1、ch2、ch3或ch4结构域、j链或分泌组分。结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。抗体可以是人类、鼠类、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一方面，可变区可以是软骨来源(例如来自鲨鱼)。如在此使用，“人”抗体包含具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包含从人类免疫球蛋白文库或从对于一种或多种人类免疫球蛋白为转基因的动物分离的抗体，并且可以在一些情况下表达内源性免疫球蛋白并且在一些情况下不表达。
如在此使用，术语“重链亚基”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列，例如包含重链亚基的抗体可以包括以下中的至少一种：vh结构域、ch1结构域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域、ch4结构域或其变体或片段。例如，结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物除了vh结构域之外还可包含(没有限制)ch1结构域；ch1结构域；铰链和ch2结构域；ch1结构域和ch3结构域；ch1结构域；铰链和ch3结构域；或ch1结构域；铰链结构域；ch2结构域和ch3结构域。在某些方面，结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物除了vh结构域之外还可包含ch3结构域和ch4结构域；或ch3结构域、ch4结构域和j链。此外，用于在本披露中使用的结合分子可以缺乏某些恒定区部分，例如ch2结构域的全部或一部分。本领域的普通技术人员应了解，这些结构域(例如，重链亚基)可被修饰成使得它们在氨基酸序列上不同于原始免疫球蛋白分子。
如在此使用，术语“轻链亚基”包含源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基至少包括vl，并且可还包括cl(例如，cκ或cλ)结构域。
如先前所指示，不同免疫球蛋白类别的恒定区的亚单位结构和三维构型是熟知的。如在此使用，术语“vh结构域”包含免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域并且术语“ch1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端的)恒定区结构域。ch1结构域与vh结构域相邻并且在典型igg重链分子的铰链区的氨基末端。
术语“制造工艺”包括用于在培养物中使细胞(例如，重组细胞)生长并得到由培养的细胞产生的呈合适的使用形式的目的蛋白质的技术。制造工艺可包括各种步骤，包括但不限于以下中的一个或多个：将目的基因插入宿主细胞中以产生工程化宿主细胞，培养宿主细胞以扩增细胞数量，诱导宿主细胞表达目的蛋白质，筛选表达目的蛋白质的宿主细胞，收获目的蛋白质(例如，通过从培养的细胞和细胞培养基中分离目的蛋白质)和/或纯化目的蛋白质。目的蛋白质可以是由天然细胞表达的内源蛋白质，或在插入细胞中(瞬时或稳定地)的表达载体中编码的重组异源蛋白质。
如在此使用，术语“工程化”包括通过合成手段(例如重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶合、或这些技术的某种组合)来操纵核酸或多肽分子。
如在此使用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质(例如，多肽或蛋白质)的过程。该过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除以及瞬时表达与稳定表达两者。它包括而不限于将基因转录成rna，例如信使rna(mrna)，和将这种mrna翻译成一种或多种多肽或蛋白质。若终产物是生物化学物质，则表达包括该生物化学物质和任何前体的形成。基因的表达产生“基因产物”。如在此使用，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录来产生的信使rna，或从转录物翻译的多肽或蛋白质。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如，聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、脂质添加、与其他蛋白质亚单位相关联、蛋白水解裂解等)的多肽或蛋白质。
如在此使用，术语“二硫键”或“二硫桥”或“s-s键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。第二巯基基团可以在相同的多肽或蛋白质(二硫键内)或在不同的多肽或蛋白质(二硫键间)上的残基的侧链中发现。此类键在蛋白质生物合成和/或硫氢基基团的氧化(该过程称为氧化性蛋白质折叠)期间产生。
术语“含二硫键蛋白质(disulfidebond-containingprotein)”和“含二硫键蛋白质(disulfidebond-containingprotein)”在本文中可互换使用，是指在其正确折叠状态下包含一个或多个二硫键的蛋白质。含二硫键蛋白质可具有分子间或分子内的二硫键。此类分子间或分子内二硫键存在于正确折叠的含二硫键蛋白质中。含二硫键蛋白质的活性可取决于二硫键的存在和还原状态。许多分子在伴随形成稳定的分子间和分子内二硫键(这有助于正确折叠)时发挥最佳作用，这些分子为例如免疫球蛋白和含有免疫球蛋白结构域的细胞表面受体、核糖核酸酶、乳白蛋白、胰岛素、角蛋白、血球凝集素、病毒膜蛋白、神经内分泌蛋白7b2、表皮生长因子(egf)、雄性腺体激素、硫化物脱氢酶和溶菌酶。许多治疗性蛋白质，例如抗体、egf和胰岛素，含有二硫键。在增加二硫键还原的条件下制造治疗性目的蛋白质可导致完整目的蛋白质的产量低下。如本文所述，术语“产量”是指所获得的完整的、活性的、正确折叠的并且具有正确的二硫键配对的蛋白质的量。过程可以产生高总量的目的蛋白质，但是如果在目的蛋白质中发生二硫键的显著减少，则完整蛋白质的产量可能会低。
术语“还原型蛋白质”是指暴露于足以还原蛋白质结构中可还原残基(如半胱氨酸)的还原条件的蛋白质。如果还原型蛋白质含有巯基基团或含硫残基，则还原型蛋白质中的巯基基团以其被还原的状态存在。例如，含有半胱氨酸残基的还原型蛋白质将以半胱氨酸残基的硫原子处于还原状态的状态存在，通常表示为“-sh”。还原型蛋白质可以是含二硫键蛋白质。通过暴露于导致含二硫键蛋白质中的一个或多个二硫键(二硫桥)断裂的还原条件，含二硫键蛋白质可以变成还原型蛋白质，这可能导致含二硫键蛋白质的不稳定和含二硫键蛋白质的活性或功能的潜在丧失。
术语“氧化型蛋白质”是指暴露于足以氧化蛋白质结构中可氧化部分的氧化条件的蛋白质。如果氧化型蛋白质含有巯基基团或含硫侧链，则氧化型蛋白质中的巯基基团以其被氧化的状态存在。氧化型蛋白质可以是含二硫键蛋白质。通过暴露于导致含二硫键蛋白质中一个或多个二硫键(二硫桥)形成的氧化条件，含二硫键蛋白质可以成为氧化型蛋白质。蛋白质制造期间的氧化条件可以有助于含二硫键的目的蛋白质的稳定、可以有助于正确折叠、可以有助于保持含二硫键蛋白质的活性或功能、并且可以从而提高制造工艺期间目的蛋白质的产量。
术语“正确折叠的”或“完整的蛋白质”指的是蛋白质或多肽的天然构象或天然状态，其具有为该蛋白质或多肽提供其预期最佳的野生型活性的三级结构。蛋白质生物化学物质或多肽在生物合成期间或之后折叠成其正确的三级结构。蛋白质错误折叠导致功能失调的或无功能的蛋白质或多肽。导致正确折叠的正确的三级结构受许多因素控制，包括分子间和分子内二硫键的形成(其有助于稳定该蛋白质或多肽的三级结构)。因此，正确折叠的蛋白质是具有通常在该蛋白质或多肽的天然形式中发现的二硫键的蛋白质。
术语“还原电位”指的是正确折叠的含二硫键的目的蛋白质在制造工艺期间或在表达、纯化、配制和/或包装后的蛋白质的储存期间或“保质期”期间的任何点经历还原的倾向。可以通过使在所期望时间点获得的蛋白质样品在真空下储存给定的一段时间(例如，一小时的一部分、一小时、一天的一部分(例如8小时、10小时或12小时)、一天、两天、36小时或更长时间)以在不存在氧气的情况下诱导含二硫化物的目的蛋白质的还原来测量在任何时间点的还原电位。然后使用例如生物分析仪分析样品的片段化，以在非还原条件下分离蛋白质片段。
“labchipgx测定”和“gx测定”在此可互换使用。这些术语涉及使用labchipgxii仪器和软件用于可视化抗体和抗体片段的测定。
术语“硫氧还蛋白系统”是指酶硫氧还蛋白还原酶-1(trxr1)和硫氧还蛋白-1(trx-1)，和辅因子nadph。这三种组分构成硫氧还蛋白系统，其支持真核细胞功能所需的几种过程，包括细胞增殖、抗氧化防御和氧化还原信号传导(lu等人，2014,freeradic.biol.med.[自由基生物学与医学],66:75–87)。
术语“谷胱甘肽系统”指的是组分谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶(gr)、谷氧还蛋白(grx)和辅因子nadph(lillig等人，2008,biochim.biophys.acta-gen.subj.[生物化学与生物物理学学报-遗传主题],1780:1304–1317)。
谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统被共同和可替代地在此称为“还原酶系统”。也就是说，术语“还原酶系统”包括谷胱甘肽系统和/或硫氧还蛋白系统两者。
特异性抑制剂是降低或完全消除靶标酶(如还原酶)(排除其他不相关的酶)的活性的试剂。例如，谷胱甘肽还原酶的特异性抑制剂是主要或专有地抑制谷胱甘肽还原酶的抑制剂。硫氧还蛋白还原酶的特异性抑制剂是主要或专有地抑制硫氧还蛋白还原酶的抑制剂。硫氧还蛋白还原酶特异性抑制剂对抑制谷胱甘肽还原酶无效。同样，谷胱甘肽还原酶特异性抑制剂对抑制硫氧还蛋白还原酶无效。非特异性抑制剂是降低或消除多种酶活性的试剂。也就是说，非特异性抑制剂是无区别的并且可以降低或消除多种不同酶(例如谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶两者)的活性。
间接抑制剂是通过作用于除靶标酶本身之外的其他组分来降低或消除靶标酶的活性的抑制剂。例如，间接抑制剂可作用于靶标酶的上游底物、产生靶标酶的底物的上游酶，或结合并隔离或从通道除去靶标酶的辅因子，从而降低或消除靶标酶活性。
制造工艺中含二硫键的目的蛋白质的还原
用于生产含二硫键的目的蛋白质的细胞培养制造工艺可导致蛋白质二硫键的还原，并由此降低完整的目的蛋白质的产量。蛋白质二硫键或二硫桥的还原可导致目的蛋白质的错误折叠和活性丧失。真核细胞含有还原酶系统，这些系统控制细胞内的还原和氧化。例如，还原型硫氧还蛋白1(trx1)被认为是负责抗体二硫键还原的酶(hutterer等人，2013,mabs,5:608–613；kao等人，2010,biotechnol.bioeng.[生物技术生物工程],107:622–632；koterba等人，2012,j.biotechnol.[生物技术杂志],157:261–267；和magnusson等人，1997,mol.immunol.[分子免疫学],34:709–717)。
真核细胞含有硫氧还蛋白系统与谷胱甘肽系统，这些系统支持真核细胞功能(包括细胞增殖、抗氧化防御、和氧化还原信号传导)所需的的几种过程。图1描绘了硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的酶和化学中间体的示意图。谷胱甘肽系统由谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶(gr)、谷氧还蛋白(grx)和nadph组成，它们与硫氧还蛋白系统共享许多相似之处和作用(lillig等人，2008,biochim.biophys.acta-gen.subj.[生物化学与生物物理学学报-遗传主题],1780:1304–1317)。如该图所示，通过还原型谷胱甘肽(gsh)的氧化，可以在谷胱甘肽系统中非酶促地还原grx，而使用nadph作为辅因子，可以通过gr酶促还原氧化型谷胱甘肽(gssg)。如该图所示，使用nadph作为电子供体，通过硫氧还蛋白还原酶-1(trxr1)还原硫氧还蛋白(trx1)。这三种分子trxr1、trx1和nadph构成硫氧还蛋白系统。
总之，硫氧还蛋白系统与谷胱甘肽系统保护真核细胞免受氧化应激的影响并维持细胞内氧化还原环境。细胞内氧化还原状态的不平衡导致氧化应激增加、蛋白质降解、dna损伤、并最终导致细胞死亡。在几乎所有活细胞中发现的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统控制细胞氧化还原环境。
出人意料地发现，与hutterer等人(上面引用的)提供的结论相反，在蛋白质制造期间，蛋白质中存在的二硫键对细胞培养物或溶液中存在的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的活性和数量都很敏感。在本发明实验中，确定了两种系统都存在于中国仓鼠卵巢(cho)细胞系中。本发明实验还表明，硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统都能够还原含二硫键的目的蛋白质中的二硫键。在本文所述的实验中，确定了2-aapa是浓度为50μm至200μm的谷胱甘肽系统活性的特异性抑制剂，并且atg是浓度为0.5μm至1μm的硫氧还蛋白系统活性的特异性抑制剂。因此，本文所述的实验显示可以选择性地抑制一种酶系统而不影响其他酶系统的活性。
控制还原酶活性以防止含二硫键的目的蛋白质的还原
本披露提供了用于增加制造工艺中含完整二硫键的目的蛋白质的产量的方法，其中该方法包括通过制造目的蛋白质来防止目的蛋白质的基于还原的降解，例如，在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂、或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂两者的存在下，培养宿主细胞(包括在宿主细胞中诱导目的蛋白质的表达)、从宿主细胞和/或细胞培养上清液中收获目的蛋白质、和/或纯化目的蛋白质。在某些方面，硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的抑制剂可以包含在含二硫键的目的蛋白质的制造给予的一个或多个步骤中，以降低硫氧还蛋白还原酶或谷胱甘肽还原酶对目的蛋白质的活性，从而增加目的蛋白质的产量。
硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶两者可以在通常用于蛋白质制造的宿主细胞系中保持不同水平的活性。此外，这些还原酶中每一种的相对量和活性可以在不同的宿主细胞系之间变化，或者在相同的宿主细胞系内变化，这取决于细胞培养条件。此外，每种还原酶与目的蛋白质“相关”(即可与作为底物的目的蛋白质相互作用并使用该蛋白质)的程度可随宿主细胞、目的蛋白质的性质和/或制造工艺中的时间点而变化。因此，在某些方面，如上所述在制造工艺中提高含二硫键的目的蛋白质的产量的方法还包括在制造工艺中的任何时间点(例如，生长阶段、生产阶段、预收获阶段、收获阶段、纯化阶段或任何组合阶段)检测目的蛋白质是否与特异性还原酶相关联。类似地，在制造工艺期间的任何点都可以发生特异性还原酶的减少。
提供了在细胞培养物或溶液中提高含完整二硫键的目的蛋白质的产量的方法，该方法包括制造含二硫键的目的蛋白质，例如，在一种或多种还原酶抑制剂(例如硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂)的存在下，培养宿主细胞(包括在宿主细胞中诱导目的蛋白质的表达)、从宿主细胞和/或细胞培养上清液中收获目的蛋白质、和/或纯化目的蛋白质。在某些方面，可以确定表达目的蛋白质的细胞系的活性硫氧还蛋白还原酶和/或活性谷胱甘肽还原酶的存在。在目的蛋白质的制造工艺期间，硫氧还蛋白还原酶抑制剂和/或谷胱甘肽还原酶抑制剂的量和特性可以根据细胞系中存在的还原酶活性进行优化。
例如，如果硫氧还蛋白系统在表达该蛋白质的细胞系中具有活性，那么可以在制造工艺期间添加硫氧还蛋白还原酶的一种或多种抑制剂以提高含完整二硫键的目的蛋白质的产量。同样，如果谷胱甘肽系统在表达该蛋白质的细胞系中具有活性，那么可以在制造工艺期间添加谷胱甘肽还原酶的一种或多种抑制剂以提高含完整二硫键的目的蛋白质的产量。类似地，如果硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统都在该细胞系中具有活性，那么可以在制造工艺期间添加两种还原酶的一种或多种抑制剂。下面的实例1提供了用于检测硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的组分的示例性测定，例如但不限于蛋白质印迹技术和其他免疫化学技术。
在某些方面，可以对与含二硫键的目的蛋白质相关联的硫氧还蛋白系统和/或谷胱甘肽系统的活性进行定量，并且在制造工艺的某些点，可以包括与在目的蛋白质附近检测到的还原酶活性水平成比例的一种或多种抑制剂。例如，如果确定了在给定的制造工艺中的一个或多个点处，与目的蛋白质相关的硫氧还蛋白系统的数量和/或活性高，那么可以在制造工艺中添加相应更高量的一种或多种硫氧还蛋白还原酶抑制剂以提高在制造工艺中表达的含二硫键的目的蛋白质的产量。同样地，如果确定了在给定的制造工艺中的一个或多个点处，与目的蛋白质相关的谷胱甘肽系统的数量和/或活性高，那么可以在制造工艺中添加相应更高量的一种或多种谷胱甘肽还原酶抑制剂以提高在制造工艺中表达的含二硫键的目的蛋白质的产量。类似地，如果确定了在给定的制造工艺中的一个或多个点处，与目的蛋白质相关的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统两者的数量和/或活性高，那么可以在制造工艺中添加相应更高量的一种或多种硫氧还蛋白还原酶抑制剂和一种或多种谷胱甘肽还原酶抑制剂以提高在制造工艺中表达的含二硫键的目的蛋白质的产量。在某些方面，在制造工艺期间添加的一种或多种还原酶抑制剂的量可以与在制造工艺期间的任何点处与目的蛋白质相关联的每种还原酶系统的量成比例。
如上所指出，每个硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的存在和活性可通过各种测定方法来确定。在一种这样的测定方法中，在制造工艺期间定量与含二硫键的目的蛋白质相关联的硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶的活性包括向在制造工艺期间获得的样品中添加5,5'-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，例如细胞培养基(清除细胞的细胞培养基)或含有下游纯化步骤中的目的蛋白质的溶液中的裂解细胞；监测412nm波长处样品中dtnb的还原；并在硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂的存在下重复这些步骤。在某些方面，可以在监测波长之前，将nadph、氧化型谷胱甘肽和缓冲液等组分添加到样品中。具有添加的抑制剂的样品中dtnb的还原与不具有添加的抑制剂的样品中dtnb的还原之间的差异分别指示硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶的活性。也就是说，硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统都可以在适当的测定条件下还原dtnb。412nm处吸光度的增加指示给定样品的还原酶活性。首先在不存在任何还原酶抑制剂的情况下测定样品的总还原酶活性。然后，可添加硫氧还蛋白系统特异性抑制剂，如atg，并测定还原酶活性的量。具有硫氧还蛋白系统特异性抑制剂的样品与没有任何硫氧还蛋白系统特异性抑制剂的样品之间的还原酶活性的差异表示样品中可归因于硫氧还蛋白系统的还原酶活性。类似地，可以在谷胱甘肽系统特异性抑制剂(例如2-aapa)的存在下并且在不存在还原酶抑制剂的情况下分析样品。用谷胱甘肽系统特异性抑制剂测定的样品和不含任何谷胱甘肽系统特异性抑制剂的样品之间的活性差异表示归因于谷胱甘肽系统的还原酶活性。用于检测还原酶系统组分和增加细胞培养物中含完整二硫键的蛋白质的产量的其他示例性方法披露于下文实例2至8中。
硫氧还蛋白还原酶的特异性抑制剂包括，但不限于，金硫葡糖(atg)、金硫苹果酸盐(atm)、金诺芬、及2-[(1-甲基丙基)二硫代]-1h-咪唑(px12)。在某些方面，硫氧还蛋白抑制剂的组合可包括在制造工艺中。在某些方面，在蛋白质制造期间添加的硫氧还蛋白抑制剂可以是atg。关于硫氧还蛋白还原酶抑制剂的综述参见，例如，cai等人，2012,freeradic.biol.med.[自由基生物学与医学],52:257–265。
谷胱甘肽还原酶的特异性抑制剂包括，但不限于，卡莫司汀、2-乙酰氨基-3-[4-(2-乙酰氨基-2-羧乙基硫烷基硫代羰基-氨基)苯基硫代氨基甲酰基硫烷基]丙酸(2-aapa)、ni2+盐、ca2+盐、和cu2+盐(浓度为约50μm或更低)。在某些方面，谷胱甘肽抑制剂的组合可在制造工艺期间添加。在某些方面，在蛋白质制造期间添加的谷胱甘肽抑制剂可以是2-aapa、cu2+盐、或2-aapa和cu2+盐两者。
谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统两者的非特异性抑制剂，或对谷胱甘肽系统或硫氧还蛋白系统不具有特异性的抑制剂包括但不限于胱氨酸和各种金属离子，例如cu2+(浓度为高于约50μm)、hg2+、zn2+、co2+、fe2+、cd2+、pb2+、和mn2+。谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统的间接抑制剂包括但不限于金属螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)或乙二醇四乙酸(egta)，以抑制己糖激酶、山梨糖-1-磷酸酯、多磷酸盐、6-脱氧-6-氟葡萄糖、2-c-羟基-甲基葡萄糖、木糖和来苏糖。间接抑制谷胱甘肽系统或硫氧还蛋白系统的方法包括但不限于空气或氧气喷射、冷却和在收获期间降低ph。如上所讨论，这种在制造工艺期间减少含二硫键的目的蛋白质还原的间接方法可以与在制造工艺期间包含特定抑制剂相结合。例如，在某些方面，特异性硫氧还蛋白系统和/或谷胱甘肽系统特异性抑制剂可以与负责细胞中nadph生物合成的酶抑制剂组合。例如，nadph生物合成酶抑制剂(间接抑制剂)可以在收获期间和/或收获后(例如，在收获和纯化之间的保持阶段期间)使用，以防止抑制剂在细胞生长期间引起的毒性。
在制造工艺期间包含的还原酶抑制剂的量可以是可有效抑制所检测的硫氧还蛋白系统和/或谷胱甘肽系统活性的任何量，且在某些方面是可有效抑制所检测的硫氧还蛋白系统和/或谷胱甘肽系统活性的最低量。可以使用本文提供的测定法(例如实例10-13中)，凭经验确定一种或多种还原酶抑制剂的有效量。在某些方面，可以在制造工艺期间以下面提供的量添加一种或多种还原酶特异性抑制剂。
在某些方面，具有检测的谷胱甘肽系统活性的包含在制造工艺中的2-aapa的量可为从约0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、0.17mm、0.18mm、或0.19mm至约0.2mm、0.21mm、0.22mm、0.23mm、0.24mm、0.25mm、0.26mm、0.27mm、0.28mm、0.29mm、0.3mm、0.4mm、或0.5mm终浓度。具有检测的谷胱甘肽系统活性的包含在制造工艺中的2-aapa的量可为从约0.05mm至约0.3mm终浓度、从约0.1mm至约0.25mm终浓度、或从约0.15mm至约0.22mm终浓度。具有检测的谷胱甘肽系统活性的包含在制造工艺中的2-aapa的量可为约0.2mm终浓度。
cu2+盐(铜离子)可以特异性地以浓度依赖性方式抑制谷胱甘肽系统或谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统两者。铜离子可以通过本领域已知的任何方式添加，例如通过添加氯化铜(cucl2)、硫酸铜(cuso4，五水合物或无水)、乙酸铜及其组合。为了抑制谷胱甘肽系统，具有检测的谷胱甘肽系统活性的包含在制造工艺中的cu2+盐(铜离子)的终浓度可以是约0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、或7.5μm至约8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、18μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、或50μm。具有检测的谷胱甘肽系统活性的包含在制造工艺中的铜离子的终浓度可以是从约0.5μm至小于约50μm终浓度。
在某些方面，可以通过在制造工艺期间添加铜离子来抑制硫氧还蛋白系统与谷胱甘肽系统二者。为了抑制硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统两者，制造工艺中包含的cu2+盐的终浓度可以是从约5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、或75μm至约100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、175μm、或200μm。在某些方面，包含在制造工艺中的铜离子的终浓度可以是从约5μm至约200μm、从约5μm至约200μm、从约10μm至约175μm、从约20μm至约150μm、从约40μm至约150μm、或从约5μm至约200μm。在某些方面，包含在制造工艺中的铜离子的终浓度可以为约50μm。
在某些方面，具有检测的硫氧还蛋白系统活性的包含在制造工艺中的atg的量可为从约0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、0.17mm、0.18mm、或0.19mm至约0.2mm、0.21mm、0.22mm、0.23mm、0.24mm、0.25mm、0.26mm、0.27mm、0.28mm、0.29mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、或5.0mm终浓度。在某些方面，具有检测的硫氧还蛋白系统活性的包含在制造工艺中的atg的量可为从约0.05mm至约5mm终浓度。在某些方面，具有检测的硫氧还蛋白系统活性的包含在制造工艺中的atg的量可为从约0.10mm至约1mm终浓度。在某些方面，具有检测的硫氧还蛋白系统活性的包含在制造工艺中的atg的量可为从约0.1mm至约0.5mm终浓度。在某些方面，具有检测的硫氧还蛋白系统活性的包含在制造工艺中的atg的量可为从约0.10mm至约0.20mm终浓度。在某些方面，具有检测的硫氧还蛋白系统活性的包含在制造工艺中的atg的量可为约0.1mm终浓度。
含二硫键的目的蛋白质的制造
本领域已知的任何细胞培养技术都可以用于使用本领域中已知的任何细胞系使表达含二硫键的目的蛋白质的宿主细胞生长。可获得用于培养细胞系的标准技术。
含二硫键的目的蛋白质的制造可包括培养宿主细胞，该宿主细胞适合于培养并生物合成含二硫键的目的蛋白质。细胞培养条件根据细胞类型而变化。细胞培养基可以包括但不限于缓冲液、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素以及必要的微量元素。术语“无血清”培养基适用于不含动物血清(例如胎牛血清)的细胞培养基。各种组织培养基，包括定义的培养基，是可商购的，并且可以用于制造含二硫键的目的蛋白质。真核细胞可以是粘附的或悬浮在培养物中，并且此类细胞可以在例如试管、烧瓶、滚瓶、板、袋、流化床反应器、中空纤维床反应器或搅拌槽生物反应器等容器中(一次性使用和标准的不锈钢和玻璃容器生物反应器)生长。细胞培养可以小规模或大规模进行，其中将细胞在从几毫升至数千升或更大的不同大小的容器中孵育生长。细胞培养系统是可商购的，其允许在最佳温度、ph、o2和co2条件下孵育。用于培养细胞的基本设备包括层流罩、培养箱、离心机、冰箱和冷冻机、细胞计数器、显微镜、高压灭菌器(消毒器)、真空或泵、ph计和流式细胞仪。细胞可以在以下中生长：分批培养物，其中营养物和培养基在细胞生长期间不被替换；补料分批培养物，其中在细胞生长期间添加营养物；或灌注培养物，其中将新鲜营养物和培养基连续添加到细胞培养物中并且连续除去用过的培养基。可以使用可商购的自动化系统使细胞培养物生长，该自动化系统被设计为在特定条件下使细胞生长最大化。
含二硫键的目的蛋白质的制造工艺可包括多个阶段。例如，在多阶段过程中，细胞在两个或更多个不同的阶段中培养。在多阶段生产过程中，在最大化细胞增殖和生存力的环境条件下，首先在一个或多个生长阶段培养细胞，然后在最大化蛋白质产生的条件下转移至生产阶段。在通过哺乳动物细胞产生目的蛋白质的商业方法中，通常存在多个，例如，至少约2、3、4、5、6、7、8、9或10个在最终生产培养之前在不同的培养容器中出现的生长阶段。生长阶段和生产阶段可以处在一个或多个过渡阶段之前或与它们分开。在多阶段方法中，本披露提供的方法可以至少在商业细胞培养物的最终生产阶段的生长和生产阶段期间使用，尽管它也可以用于前面的生长阶段。生产阶段可以大规模进行。大规模方法可以以至少约50、100、500、1000、2000、3000、5000、7000、8000、10,000、15,000、20,000、25,000升的体积进行。在优选的实施例中，生产在500l、1000l、2000l、12000l和/或20000l生物反应器中进行。
从细胞培养物制造目的蛋白质
可以在搅拌槽生物反应器系统中培养细胞，并且可以使用补料分批培养程序。例如，最初可以将哺乳动物宿主细胞和培养基提供到培养容器，并且可以在培养期间，连续地或以不连续递增方式将另外的培养营养物供给至培养物，在培养终止之前具有或不具有细胞和/或产物的定期收获。补料分批培养可包括，例如，半连续补料分批培养，其中除去部分或完整培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基替换。补料分批培养可以与简单的分批培养区分开，其中在补料分批培养中，在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应到培养容器。补料分批培养可以进一步区别于灌注培养，其中在该过程中不从培养容器中除去上清液(在灌注培养中，通过例如过滤、包封、锚定到微载体等将细胞限制在培养物中，并连续或间歇地引入培养基并从培养容器中除去)。
在某些方面，补料分批或连续细胞培养条件可用于增强细胞培养物生长阶段中哺乳动物细胞的生长。在生长阶段，使细胞在使生长最大化的条件下生长一段时间。培养条件，例如温度、ph、溶解氧(do2)等，是与特定宿主一起使用的那些，并且对于普通技术人员来说是清楚的。通常，使用酸(例如，co2)或碱(例如，na2co3或naoh)将ph调节至所期望水平。用于培养哺乳动物细胞(如cho细胞)的合适温度范围在约30℃至38℃之间；合适的ph值在约6.5至7.5之间；以及合适的do2为5％至90％之间的空气饱和度。
在特定的阶段，可以将细胞用于接种细胞培养物的生产阶段或步骤。可替代地，如上所述，生产阶段或步骤可以与接种或生长阶段或步骤相连。
细胞培养的生产阶段期间的细胞培养环境通常被控制。因此，如果产生糖蛋白，则可以操纵影响哺乳动物宿主细胞的细胞比生产率的因子，使得在所得糖蛋白中实现所期望的唾液酸含量。在某些方面，细胞培养过程的生产阶段之前是细胞培养的过渡阶段，其中涉及细胞培养的生产阶段的参数。
合适的宿主细胞包括，但不限于，细菌、植物细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞。来自许多不同动物的真核细胞适用于细胞培养并且是可商购的，这些真核细胞包括但不限于，成纤维细胞系，例如balb/3t3和bhk-21；上皮细胞系，例如人胚肾细胞系hek293(293)、hela细胞系、madin-darby犬肾(mdck)细胞、a549、hepg2、vero、caco-2、中国仓鼠卵巢(cho)、cos-1；淋巴细胞，例如daudi、jurkat和h9；成髓细胞，例如ns0、kg-1；内皮细胞系，例如huvec；视网膜细胞，例如per.c6细胞系；昆虫细胞系，例如sf9、bti-tn-5b1-4和d.mel-2；和酵母细胞系，例如毕赤酵母菌株smd1168和x-33；和酿酒酵母菌株s288c、w303、d273-10b、x2180、a364a、σ1278b、ab972、sk1和fl100，以及可从美国典型培养物保藏中心(atcc，马纳萨斯，弗吉尼亚州)或任何国际贮藏机构获得的任何细胞系。用于制造蛋白质的常见原核细胞是大肠杆菌、链霉菌属细菌、棒状杆菌和嗜盐菌等。
在创建工程化宿主细胞中，编码含二硫键的目的蛋白质的核酸被瞬时或稳定地插入到宿主细胞中，用于表达。在将核酸导入细胞并培养细胞以扩增其数量后，可以触发来自核酸的蛋白质的表达，例如通过在促进基因表达的条件下培养宿主细胞。在收获之前，制造工艺可以包括预收获步骤，例如像添加试剂以促进纯化和蛋白质稳定性。
在含二硫键的目的蛋白质表达后，可以将其收获，例如，与细胞培养物的其他组分分离，并在蛋白质纯化过程中纯化。目的蛋白质的收获可以通过许多不同的方式实现，这些方式实现目的蛋白质与其他细胞培养组分的分离。例如，通过将目的蛋白质工程化为在细胞外分泌到培养基中来实现重组蛋白质向培养基中的分泌。一种这样的工程技术包括设计表达载体以包括信号肽，该信号肽使重组蛋白在表达后分泌到宿主细胞外。包含蛋白质分泌信号序列的载体是可商购的。当目的蛋白质被细胞系表达并分泌到细胞培养基中时，可以从培养基中分离目的蛋白质。从细胞和细胞培养基中分离分泌的目的蛋白质可以通过已知技术(例如离心、超滤/渗滤和/或色谱法)完成。如果目的蛋白质不是由宿主细胞分泌的，则宿主细胞可以从细胞培养基中分离，例如通过离心或过滤，并且然后通过各种已知方式裂解，并且可以通过各种方法(例如离心、柱色谱和/或沉淀和透析技术)将蛋白质与细胞裂解物中的其他细胞组分分离。
进一步纯化技术可包括各种色谱方法，例如离子交换、尺寸排阻、羟基磷灰石和亲和色谱。这些可以在hplc、fplc和毛细管系统上小规模进行，或者使用本领域已知的大批量色谱技术大规模进行。例如，目的蛋白质可以应用于柱，并且在某些情况下可以与柱结合。在一些情况下，目的蛋白质将穿过柱，而其他细胞系组分留在柱后面。可以通过应用干扰目的蛋白质与柱介质结合的洗脱剂，从柱上洗脱结合的蛋白质。例如，可以通过将培养基中分泌的蛋白质(例如抗体)与蛋白质-a亲和柱结合来实现抗体的纯化。
在某些方面，含二硫键的目的蛋白质可以是内源性含二硫键蛋白质。在其他方面，含二硫键的目的蛋白质可以是在表达载体上编码并且瞬时转染到宿主细胞中或稳定地转染到宿主细胞中的重组异源性含二硫键蛋白质。在某些方面，含二硫键的目的蛋白质可以是抗体或其抗原结合片段。在某些方面，含二硫键的目的蛋白质可以是人、嵌合或人源化抗体或其片段。在某些方面，抗体可以是igg抗体或其片段。在某些方面，含二硫键的目的蛋白质可以是igg亚型igg1、igg2、igg3、或igg4的人、人源化、或嵌合抗体。在某些方面，免疫球蛋白或其片段可以是单价的或二价的。在某些方面，抗体可以是iga、igm、igd、或ige。在某些方面，抗体或其片段可以是fab、fab'、f(ab')2、或二硫键连接的fv(sdfv)。在某些方面，抗体或其片段可以是单克隆抗体或抗体的多克隆混合物的一部分。
收获后，可以立即纯化目的蛋白质，或者可替代地，可以将含有该目的蛋白质的收获的细胞培养液(hccf)在收获阶段之后且在纯化阶段之前保持或储存一段时间，例如，持续至少一小时、至少一天、至少四天、至少一周、至少10天或至少两周。对于许多易于还原的含二硫键蛋白质，直到收获步骤才发生二硫键的还原。当细胞与含有目的蛋白质的上清液分离时，发生制造工艺的收获步骤。将细胞与上清液分离的过程可以引起细胞裂解，其将还原酶途径组分释放到上清液中，在那里它们可以与蛋白质结合并催化含二硫键的目的蛋白质的蛋白质二硫键还原。收获步骤通常在制造工艺的约第14天发生，但可以根据例如所用细胞系的特性、细胞培养条件和/或目的蛋白质的特征而变化。还原酶抑制剂可以在收获步骤之前、收获步骤期间、收获之后且在纯化之前的保持期期间、和/或纯化过程期间添加。在某些方面，在收获之后(例如，刚刚收获之后，在收获之后的保持期期间或在纯化期间)，提供含有细胞培养基、一种或多种还原酶途径的一种或多种组分、含二硫键的目的蛋白质和一种或多种还原酶抑制剂的溶液。
用于含二硫键的目的蛋白质的制造工艺可同样表现出在接近细胞培养结束但在收获之前(例如，为期两周的培养的第8-14天)的生物反应器中的二硫键还原。在这种情况下，还原酶抑制剂可以在早于收获前调解，例如在典型细胞培养的第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天添加，或可以在整个细胞培养过程中存在。将抑制剂添加到培养物中的确切日期可以根据例如所用细胞系的特性和所制造的含二硫键的目的蛋白质的特征而变化。在任一情况下，还原酶抑制剂可在还原发生之前添加。在某些方面，在细胞培养期间，可以提供包含一种或多种还原酶抑制剂的溶液。
以上讨论的硫氧还蛋白和/或谷胱甘肽还原酶抑制剂可以在蛋白质制造工艺期间的任何点添加。在某些方面，可以在细胞收获之前添加一种或多种还原酶抑制剂。在某些方面，可以在细胞培养开始时添加一种或多种还原酶抑制剂。在某些方面，一种或多种还原酶抑制剂可以在整个制造工艺中存在，并且可以在该过程结束时例如通过某些蛋白质纯化步骤消除，。在某些方面，一种或多种还原酶抑制剂可以在细胞收获时添加并在第一个蛋白质纯化步骤中除去。在另一方面，不同的还原酶抑制剂可以在制造工艺中的不同时间处存在。
提高完整目的蛋白质产量的方法
可以筛选还原酶特异性抑制剂并在使用如下所示的纯化的重组哺乳动物还原酶的测定中来确定它们的最佳浓度。下文披露的还原酶筛选测定(参见实例2和3)可有助于检测单独由硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统引起的含二硫键的目的蛋白质的活性和还原量。使用对谷胱甘肽系统或硫氧还蛋白系统具有特异性的还原酶抑制剂，可以确定硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统在制造工艺期间各个点处对含二硫键的目的蛋白质的还原的单独贡献。在某些方面，可以用这些测定法测定由谷胱甘肽系统和/或硫氧还蛋白系统还原的含完整二硫键的目的蛋白质的数量或量。
在此所述的方法利用细胞培养物中还原酶酶活性和蛋白还原活性之间的相关性。在制造工艺期间与含二硫键的目的蛋白质相关的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统组分的量可以根据在此其他地方描述的原因而变化。例如，在下面的实例中，发现使用cho细胞系a(chocat-s)表达maba的制造工艺在该制造工艺期间表现出谷胱甘肽还原酶活性，并且因此在该过程中maba的还原对谷胱甘肽系统的特异性抑制敏感。在另一方面，使用cho细胞系c(cho-k1sv)表达mabc的制造工艺在该制造工艺期间显示出硫氧还蛋白还原酶活性，并且因此由该细胞系产生的mabc的还原对硫氧还蛋白系统的特异性抑制敏感。此外，使用cho细胞系b(cho-k1sv)表达mabb和使用cho细胞系d(chocat-s)表达mabd的制造工艺在该制造工艺期间表现出几乎相等的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统还原酶活性水平，并且因此，由这些细胞系产生的mabb和mabd的还原对两种系统的抑制都很敏感。另外，使用细胞系b表达mabb的制造工艺表现出最高的总还原酶活性，这与观察到的与测试的其他过程相比mabb表现出最高的总还原百分比相关。
因此，在某些方面，提供了一些方法，在这些方法中添加谷胱甘肽系统特异性抑制剂或硫氧还蛋白系统特异性抑制剂，或添加谷胱甘肽系统特异性抑制剂和硫氧还蛋白系统特异性抑制剂两者，这取决于确定在该制造工艺期间的任何点这些系统中的酶是否与目的蛋白质相关联，以及存在的每种系统的活性的量。因此，在某些方面，可以定制在该制造工艺期间添加的抑制剂混合物以适应与在该制造工艺期间的目的蛋白质相关的特异性还原酶系统。测试在目的蛋白质附近硫氧还蛋白系统或谷胱甘肽系统的存在，并且包括在该制造工艺期间对这些还原酶系统具有特异性的抑制剂，可以在这样的制造工艺中以可以测量的程度提高含二硫键的蛋白质的产量。
“提高完整蛋白质的产量”是指有活性的、正确折叠的、非还原的、含二硫键的目的蛋白质的增加。如图所示，例如，在图7中，含完整二硫键的目的蛋白质的产量增加百分比可以是从20％至100％，其取决于在该制造工艺期间使用的还原酶抑制剂的类型或还原酶抑制剂的组合以及在该制造工艺期间与含二硫键的目的蛋白质相关的硫氧还蛋白系统和/或谷胱甘肽系统活性的量。在某些方面，当添加抑制剂atg时，含二硫键的目的蛋白质的产率增加百分比可为从约30％至约90％、从约40％至约80％、从约50％至约70％；或高于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些方面，当将抑制剂cu2+添加到该制造工艺中时，含二硫键的目的蛋白质的产量增加百分比可为从约20％至约100％、从约30％至约90％、从约40％至约80％；或高于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在某些方面，将一种或多种谷胱甘肽系统抑制剂(除了一种或多种硫氧还蛋白系统抑制剂之外)包括到该制造工艺中，相比于仅在硫氧还蛋白系统抑制剂存在下进行的相同的制造工艺，可以提供更高产量的正确折叠的、含二硫键的目的蛋白质。例如，如图7所示，除了包括硫氧还蛋白系统特异性抑制剂(如atg)之外，包括铜离子以抑制谷胱甘肽还原酶，提供适当折叠的含二硫键的目的蛋白质的产量增加超过20％、30％、40％、50％、或甚至60％。因此，在含二硫键的目的蛋白质的制造工艺中包括谷胱甘肽系统特异性抑制剂，相比于仅在硫氧还蛋白系统特异性抑制剂存在下进行的相同的制造工艺，可以导致该目的蛋白质的产量显著增加。
因此，如以下所示，谷胱甘肽系统在制造工艺期间的抑制可以基本上或完全防止含二硫键的目的蛋白质的二硫键还原，从而增加该蛋白质的产量。如在此所示，可以使用酶测定法来确定每种还原系统的相对量，以及它们对蛋白质二硫键还原的估算影响。该信息可用于为目的蛋白质选择最佳的含二硫键蛋白质制造工艺还原缓解策略。
在此所述的方法平衡硫氧还蛋白系统与谷胱甘肽系统抑制剂的风险和益处，以使含二硫键的目的蛋白质的生产产量最大化。还原缓解策略通常具有独特的缺点。例如，过量添加铜离子可以减少细胞生长、降低滴度、降低含二硫键的目的蛋白质的活性、引发增加的环境处理问题、或者增加在下游加工目的蛋白质(蛋白质纯化)期间监测金属离子清除的负担。因此，在某些方面，可以检测在制造工艺期间与目的蛋白质相关的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的存在和数量，并且然后可以基于该信息设计缓解策略。根据在此提供的方法，在还原缓解策略不会增加含二硫键的目的蛋白质的产量的情况下，可以避免该缓解策略以及该策略的缺点，降低蛋白质制造成本并减少生产时间同时保持和/或增加含二硫键的目的蛋白质的总产量。根据在此提供的方法，通过将该制造工艺期间使用的抑制剂的浓度限制为增加含二硫键的目的蛋白质产量所需的最小值，可以避免过多的任何一种或多种谷胱甘肽系统抑制剂和一种或多种硫氧还蛋白系统抑制剂的有害副作用。
降低蛋白质制造工艺期间二硫键还原电位
本披露提供了用于提高含完整二硫键的目的蛋白质产量，和/或降低或减少制造工艺中含二硫键蛋白质的还原电位的方法。该方法提供了对制造工艺的改进，该制造工艺减少例如防止或降低该工艺期间的一个或多个时间点处二硫键还原电位。该制造工艺可包括表达在细胞培养液(ccf)中生长和维持的培养的真核宿主细胞中的目的蛋白质。如上所述，根据在此提供的方法的制造工艺可包括生长阶段、生产阶段、预收获阶段、收获阶段、保持阶段、纯化阶段或其任何组合。如上所述，在某些方面，该生产阶段可包括将这些细胞维持在ccf中持续任何一段时间，至少一天、至少8天、至少10天、至少12天、至少14天或至少16天。
根据在此提供的方法，该制造工艺包括在生产生物反应器或其任何部分期间，例如生产阶段后期，将有效量的胱氨酸维持在ccf中，从而降低二硫键还原电位。“降低二硫键还原电位”是指相对于对照制造工艺(其中在生产阶段的任何给定点，ccf中未维持有效量的胱氨酸)降低的还原电位。在某些方面，完全防止了含二硫键的目的蛋白质的还原。在某些方面，二硫键还原的量小于在对照ccf中观察到的量，例如，比在对照ccf中观察到的约少5％、约少10％、约少20％、约少30％、约少40％、约少50％、约少60％、约少70％、约少80％、约少90％、或约少99％。还原电位可通过在此其他地方描述的真空/生物分析仪测定法来测量。例如，还原电位可以通过如下方法测量，该方法包括：将在制造工艺期间在选定时间点获得的ccf样品储存在真空室中，并测量相对于对照样品的目的蛋白质的片段化水平。在某些方面，可以将在生产阶段期间在不同时间点从ccf回收的样品离心以除去细胞，并且可以立即冷冻上清液，例如在-80℃。一旦收集所有样品，可以将它们解冻并同时进行真空处理。在某些方面，在非还原条件下在生物分析仪上测量片段化水平。
因为蛋白质片段化或错误折叠(由于二硫键还原)导致目的蛋白质的完整且稳定的活性形式的量减少，所以在此提供的方法可以增加含有完整二硫化物的目的蛋白质的产量，和/或可以在储存期间降低含二硫键蛋白质的还原电位。产量可以增加(相对于对照制造工艺的产量高出)例如约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约99％。
在某些方面，根据在此提供的方法的改良的制造工艺还包括在收获阶段或其任何部分期间、在纯化阶段或其任何部分期间(例如，在通过在此其他地方所述的一个或多个纯化步骤将蛋白质与ccf分离之前)、或其组合，将有效量的胱氨酸维持在ccf中。在从ccf中分离目的蛋白质后，还可以在一个或多个纯化和/或配制步骤中将有效量的胱氨酸维持在目的蛋白质的溶液中。某些收获方法可以增加目的蛋白质中二硫键还原电位，例如，促进细胞裂解的离心或超滤技术可以将还原酶酶释放到ccf中。因此，在某些方面，改良该制造工艺的收获阶段以使细胞裂解最少化。
待在生产阶段或其部分期间维持的有效量的胱氨酸可以由本领域普通技术人员使用在此提供的方法容易地确定，例如，在制造工艺期间在任何点或者一个或多个点测量ccf中的胱氨酸浓度、确定在相同点或多个点处含二硫键的目的蛋白质的还原电位、以及确定降低或消除目的蛋白质在该时间点进行还原的倾向所需的胱氨酸浓度。在某些方面，胱氨酸的有效量可以为从约0.5mm至约1mm；从约0.9mm至约3mm；从约2.5mm至约4.5mm。在某些方面，胱氨酸的有效量可以为至少约0.5mm、至少约1mm、至少约2.0mm、至少约2.5mm、至少约3.0mm、至少约3.5mm、至少约4.0mm、至少约4.5mm、至少约5.0mm、或至少约5.5mm。ccf中胱氨酸的浓度可以例如通过在制造工艺期间在任何一个或多个时间点或者在制造工艺期间每隔一定时间(例如在生产阶段期间每隔一定时间)使用uplc进行氨基酸分析来确定。
在某些方面，用于降低二硫键还原电位的方法包括：通过添加氧化还原调节剂(包括金属离子(包括zn2+、mn2+、fe3+、cu2+、se2+)、胱氨酸、溶解的氧、β巯基乙醇、谷胱甘肽或其组合)在制造工艺的任何步骤期间改变溶液的氧化还原电位。
在某些方面，用于降低二硫键还原电位的方法是通过在线细胞培养氧化还原电位来控制。该控制系统(其基于细胞培养氧化还原电位)用于响应于细胞培养氧化还原电位的降低来增加zn2+、mn2+、fe3+、cu2+、se2+、胱氨酸、溶解的氧、β巯基乙醇、或谷胱甘肽的浓度。使用基于细胞培养氧化还原电位的控制系统可防止化学缓解剂的不必要的过量添加(或do设定点的增加)。这是有利的，因为必须通过下游纯化工艺清除防止还原所需的化学品，并且升高的do可降低最终的工艺滴度。
在某些方面，根据在此提供的方法的生产阶段可以是“补料分批”过程，其中在生产阶段期间，将包含胱氨酸的营养补料溶液添加到ccf中。含有胱氨酸的营养补料溶液可以包括一种或多种另外的营养物，以促进处于功能形式的目的蛋白质的表达。营养补料溶液可含有例如至少一种氨基酸。在某些方面，营养补料溶液本身包含l-胱氨酸或包含一种或多种另外的组分。。在某些方面，在生产阶段期间每隔一定时间，例如，大约每天、大约每两天、大约每三天、大约每四天或大约每五天，将包含胱氨酸的营养补料溶液添加到ccf中。因此，在整个生产阶段，可以添加含有胱氨酸的营养补料溶液一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次或八次。在某些方面，可以在生产阶段期间添加两种或更多种不同的营养补料溶液。另外的营养补料溶液可以包括至少一种另外的营养物，以促进处于功能形式的目的蛋白质(例如氨基酸、葡萄糖、维生素、蛋白质水解产物或其任何组合)的表达。可以根据相同方案(其中添加包含胱氨酸的营养补料溶液)添加一种或多种营养补料溶液。可以使用与用于第一营养补料溶液的方案不同的方案添加该第二营养补料溶液。
在某些方面，约每两天将包含胱氨酸的营养补料溶液添加到ccf中，并在生产阶段期间添加营养补料溶液五次或六次。在某些方面，在整个生产阶段和/或该制造工艺的其他阶段期间，可以将有效量的胱氨酸维持在ccf中。然而，在某些方面，有效量的胱氨酸仅需要在生产阶段的后期部分(例如，刚好在预收获和/或收获阶段之前发生的生产阶段那部分)期间保持在ccf中。例如，在某些方面，有效量的胱氨酸可以在生产阶段的最后14天、生产阶段的最后12天、生产阶段的最后10天、生产阶段的最后8天、生产阶段的最后6天、生产阶段的最后4天、生产阶段的最后2天、或生产阶段的最后一天维持在ccf中。例如，在如在此其他地方所述的分批补料生产阶段中，另外的胱氨酸可以包括在营养补料溶液(nf)的最后和/或倒数第二次添加(例如，第五次nf添加)中，其中该过程包括五批次补料，或者第五次和/或第六次nf添加。相对于标准对照制造工艺，后期补料中胱氨酸的量可以多至少约10％、多至少约20％、多至少约30％、多至少约40％、多至少约50％、多至少约60％、多至少约70％、多至少约80％、多至少约90％、或多至少约100％。例如，在生产阶段的某个时间点，对照ccf中胱氨酸的浓度可以是约2.0mm，其中在同一时间点，根据在此提供的方法的ccf中胱氨酸的浓度可以是3.5mm、4.0mm或4.5mm。在一些方面，使用与早期补料中使用的相同的营养补料溶液，但是在后期补料中添加增加的体积以增加添加到ccf中的胱氨酸的量。在其他方面，改良的营养补料溶液可用于后期补料中，其中溶液中的剩余成分保持在相同的浓度但胱氨酸的浓度增加。根据该方面，添加的nf溶液的体积可以保持恒定。
实施例
实施例1a：一种用于提高细胞培养物或溶液中含完整二硫键的目的蛋白质产量的方法，该方法包括在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂、或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂两者的存在下制造含二硫键的目的蛋白质，由此，与不是在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂、或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在下制造的细胞培养物或溶液中的含完整二硫键的蛋白质的量相比，在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在下制造的细胞培养物或溶液中的含完整二硫键的蛋白质的量更高。
实施例2a：一种用于提高制造工艺中培养物或溶液中含完整二硫键的目的蛋白质产量的方法，该方法包括检测包含目的蛋白质的培养物或溶液中谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的存在，并向该制造工艺中添加谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶抑制剂以降低含二硫键的目的蛋白质的还原。
实施例3a：如实施例2a所述的方法，该方法还包括测定该培养物或溶液中谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的活性。
实施例4a：如实施例3a所述的方法，其中测定谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的活性包括：向在制造工艺期间得到的样品中添加5,5'-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)；将硫氧还蛋白还原酶抑制剂和谷胱甘肽还原酶抑制剂中的至少一种添加到含有dtnb的样品的一部分中；和监测该样品中波长412nm处的dtnb的还原；其中，在没有硫氧还蛋白还原酶抑制剂和谷胱甘肽还原酶抑制剂中的至少一种的情况下，该样品中dtnb的较高还原指示硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶的活性。
实施例5a：如实施例4a所述的方法，其中在监测dtnb还原(或还原酶活性)之前将nadph、氧化型谷胱甘肽和缓冲液添加到样品中。
实施例6a：如实施例3a至5a中任一项所述的方法，其中添加至该细胞培养物中的硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶抑制剂的量与检测到的硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶活性的量成比例。
实施例7a：如实施例1a至6a中任一项所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质在谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂存在下制造，并且其中，与在不存在谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的情况下制造含二硫键蛋白质相比，谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在使含完整二硫键的蛋白质的产量增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％或至少40％。
实施例8a：如实施例1a至6a中任一项所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质在存在硫氧还蛋白还原酶抑制剂且不存在谷胱甘肽还原酶抑制剂的情况下制造，并且其中，与在不存在硫氧还蛋白还原酶抑制剂的情况下制造含二硫键蛋白质相比，硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在使含完整二硫键的蛋白质的产量增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％或至少40％。
实施例9a：如实施例1a至6a中任一项所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质在存在谷胱甘肽还原酶抑制剂且不存在硫氧还蛋白还原酶抑制剂的情况下制造，并且其中，与在不存在谷胱甘肽还原酶抑制剂的情况下制造含二硫键蛋白质相比，谷胱甘肽还原酶抑制剂的存在使含完整二硫键的蛋白质的产量增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％或至少40％。
实施例10a：如实施例1a至8a中任一项所述的方法，其中硫氧还蛋白还原酶抑制剂是金硫葡糖(atg)、金硫苹果酸盐(atm)、金诺芬、2-[(1-甲基丙基)二硫代]-1h-咪唑(px12)或其任何组合中的至少一种。
实施例11a：如实施例10a所述的方法，其中硫氧还蛋白还原酶抑制剂包括atg、atm或atg和atm的组合。
实施例12a：如实施例11a所述的方法，其中硫氧还蛋白还原酶抑制剂包含atg和atg，并且其中细胞培养物中atg的终浓度为约0.1至约0.5mm，并且atm的终浓度为约0.1至约0.5mm；或者atm的终浓度为约0.1至约0.5mm，并且atg的浓度为约0.1至约0.5mm。
实施例13a：如实施例1a至9a中任一项所述的方法，其中谷胱甘肽还原酶抑制剂是卡莫司汀、2-乙酰氨基-3-[4-(2-乙酰氨基-2-羧乙基硫烷基硫代羰基-氨基)苯基硫代氨基甲酰基硫烷基]丙酸(2-aapa)、cu2+盐、ni2+盐、ca2+盐或其任何组合中的至少一种。
实施例14a：如实施例13a所述的方法，其中谷胱甘肽还原酶抑制剂包括2-aapa、cu2+盐、或2-aapa和cu2+盐的组合。
实施例15a：如实施例14a所述的方法，其中谷胱甘肽还原酶抑制剂包含2-aapa和cu2+盐，并且其中2-aapa的终浓度为约0.1mm至约0.25mm，cu2+盐的终浓度为约0.5μm至小于约50μm，或2-aapa的终浓度为约0.1mm至约0.25mm并且cu2+盐的终浓度为约1μm至小于约50μm。
实施例16a：如实施例1a至15a中任一项所述的方法，还包括在胱氨酸、hg2+、zn2+、co2+、fe2+、cd2+、pb2+、mn2+、大于约50μmcu2+、或其任何组合的存在下制造含二硫键的目的蛋白质。
实施例17a：如实施例1a至16a中任一项所述的方法，还包括在乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇四乙酸(egta)、山梨糖-1-磷酸酯、多磷酸盐、6-脱氧-6-氟葡萄糖、2-c-羟基-甲基葡萄糖、木糖、来苏糖或其任何组合的存在下制造含二硫键的目的蛋白质。
实施例18a：如实施例1a至17a中任一项所述的方法，还包括在空气或氧气喷射、冷却、收获期间降低的ph、或其任何组合的条件下制造含二硫键的目的蛋白质。
实施例19a：如实施例1a至18a中任一项所述的方法，还包括纯化含二硫键的目的蛋白质。
实施例20a：如实施例1a至19a中任一项所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质是在宿主细胞中制造的重组蛋白。
实施例21a：如实施例20a所述的方法，其中宿主细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞或ns0细胞。
实施例22a：如实施例1a至21a中任一项所述的方法，其中在收获步骤期间添加硫氧还蛋白还原酶抑制剂和/或谷胱甘肽还原酶抑制剂。
实施例23a：如实施例1a至21a中任一项所述的方法，其中在至少一个纯化步骤期间添加硫氧还蛋白还原酶抑制剂和/或谷胱甘肽还原酶抑制剂。
实施例24a：如实施例22a或23a中任一项所述的方法，其中在收获步骤期间和至少一个纯化步骤期间添加硫氧还蛋白还原酶抑制剂和/或谷胱甘肽还原酶抑制剂。
实施例25a：如实施例1a至24a中任一项所述的方法，其中硫氧还蛋白还原酶抑制剂和/或谷胱甘肽还原酶抑制剂存在于整个制造工艺中。
实施例26a：如实施例1a至25a中任一项所述的方法，其中该制造工艺包括收获步骤和/或至少一个纯化步骤。
实施例27a，如实施例26a所述的方法，其中硫氧还蛋白还原酶抑制剂是atg，其中在收获步骤期间添加atg，并且其中与不存在atg情况下相同制造工艺中含完整二硫键的目的蛋白质的产量相比，含完整二硫键的目的蛋白质的产量增加了约20％至至少约100％。
实施例28a，如实施例26a或27a所述的方法，其中硫氧还蛋白还原酶抑制剂是atg，其中在收获步骤期间添加atg，并且其中与不存在atg情况下相同制造工艺中含完整二硫键的目的蛋白质的产量相比，含完整二硫键的目的蛋白质的产量增加了约20％至至少约100％。
实施例29a：如实施例26a所述的方法，其中谷胱甘肽还原酶抑制剂是cu2+盐，其中在收获步骤期间添加cu2+盐，并且其中与不存在cu2+盐情况下由相同制造工艺制造的含完整二硫键的目的蛋白质的产量相比，含完整二硫键的目的蛋白质的产量增加了约20％至约至少100％。
实施例30a.如实施例26a或27a所述的方法，其中谷胱甘肽还原酶抑制剂是cu2+盐，其中在至少一个纯化步骤期间添加cu2+盐，并且其中与不存在cu2+盐情况下由相同制造工艺制造的含完整二硫键的目的蛋白质的产量相比，含完整二硫键的目的蛋白质的产量增加了约20％至约至少100％。
实施例31a：如实施例1a至30a中任一项所述的方法，其中该含二硫键的目的蛋白质是抗体或其抗原结合片段。
实施例32a：如实施例31a所述的方法，其中该抗体或其片段是单克隆抗体、双特异性抗体、融合蛋白或抗体药物缀合物或其片段。
实施例33a：如实施例32a所述的方法，其中该抗体或其片段是单克隆抗体或其片段。
实施例34a：如实施例33a所述的方法，其中该单克隆抗体或其片段是igg1、igg2、或igg4抗体或其片段。
实施例35a：如实施例1a至17a中任一项所述的方法，其中通过测量细胞培养氧化还原电位的氧化还原探针控制用于降低二硫键还原电位的方法，其中控制环响应于细胞培养氧化还原电位的降低来调节还原缓解策略。
实施例1b：一种用于通过在生产阶段期间添加胱氨酸以在细胞培养物或发酵过程中将细胞外胱氨酸水平维持在0之上来增加该细胞培养物或发酵过程中含完整二硫键的目的蛋白质的产量或降低含二硫键的目的蛋白质的还原电位的方法(与在该生产阶段期间细胞外胱氨酸水平未维持在0之上的细胞培养物或发酵过程中含完整二硫键的蛋白质的产量或含二硫键蛋白质的还原电位相比)。
实施例2b：如实施例1b所述的方法，其中将含完整二硫键的目的蛋白质释放到细胞培养液(ccf)中。
实施例3b：如实施例2b所述的方法，其中该生产阶段包括将这些细胞维持在ccf中持续至少2天、至少8天、至少10天、至少12天、至少14天或至少16天。
实施例4b：如实施例1b至3b所述的方法，其中该细胞培养过程是哺乳动物或昆虫细胞培养过程，并且该发酵是细菌、酵母或真菌过程。
实施例5b：如实施例1b至4b中任一项所述的方法，其中将胱氨酸添加至培养物或发酵中以维持胱氨酸水平高于0。
实施例6b：如实施例5b所述的方法，其中在生产阶段期间将胱氨酸水平维持在0之上以防止二硫键还原。
实施例7b：如实施例6b所述的方法，其中相对于胱氨酸水平在ccf中未保持在0之上的过程，二硫键还原的电位降低。
实施例8b：如实施例1b至7b中任一项所述的方法，其中胱氨酸水平维持在约0.2mm、至少2.0mm、至少约2.5mm、至少约3.0mm、至少约3.5mm、或至少约4.0mm。
实施例9b：如实施例1b至8b中任一项所述的方法，其中在该生产阶段的最后14天、最后12天、最后10天、最后8天、最后6天、最后4天、最后2天、或最后一天期间将ccf中的胱氨酸水平维持在0之上。
实施例10b：如实施例1b至9b中任一项所述的方法，其中ccf中胱氨酸的量通过在生产阶段期间每隔一定时间采集的ccf样品的超高效液相色谱氨基酸分析来确定。
实施例11b：如实施例1b至10b中任一项所述的方法，其中该生产阶段包括向ccf中添加营养补料溶液，其中该营养补料溶液包含胱氨酸。
实施例12b：如实施例11b所述的方法，其中在生产阶段期间每隔一定时间将营养补料溶液添加到ccf中。
实施例13b：如实施例12b所述的方法，其中大约每天、大约每两天、大约每三天、大约每四天或大约每五天，将营养补料溶液添加到ccf中，并且其中在生产阶段期间可以添加营养补料溶液一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次或八次。
实施例14b：如实施例13b所述的方法，其中大约每两天将营养补料溶液添加到ccf中，并且其中在生产阶段期间添加营养补料溶液五次或六次。
实施例15b：如实施例10b至14b中任一项所述的方法，其中在第二次或后期补料中添加的营养补料溶液包含增加的胱氨酸水平(相对于在早期补料中添加的营养补料溶液)。
实施例16b：如实施例10b至15b中任一项所述的方法，其中通过增加起始培养基或一种或多种营养补料中的胱氨酸浓度来维持胱氨酸水平。
实施例17b：如实施例16b所述的方法，其中营养补料溶液的组成在整个生产阶段是相同的，并且其中在整个添加过程中添加另外体积的营养补料溶液，导致该培养物或发酵过程中胱氨酸的量增加。
实施例18b：如实施例16b所述的方法，其中营养补料溶液的组成在整个生产阶段是相同的，并且其中在第五次添加、第六次添加或第五次和第六次添加中添加另外体积的营养补料溶液，导致该培养物或发酵过程中胱氨酸的量增加。
实施例19b：如实施例16b或17b所述的方法，其中在第五或第六次添加中的至少一次中添加的营养补料溶液比在第一至第四次或第一至第五次添加中添加的营养补料溶液多包含至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％的胱氨酸。
实施例20b：如实施例10b至19b中任一项所述的方法，其中营养补料溶液还包含至少一种另外的营养物。
实施例21b：如实施例20b所述的方法，其中该至少一种另外的营养物包含氨基酸、葡萄糖、维生素、蛋白质水解产物或其任何组合。
实施例22b：如实施例20b或21b所述的方法，其中添加该至少一种另外的营养物以促进处于功能形式的目的蛋白质的表达。
实施例23b：如实施例10b至22b中任一项所述的方法，其中该生产阶段还包括向ccf中添加另外的营养补料溶液，其中该另外的营养补料溶液包含至少一种另外的营养物。
实施例24b：如实施例23b所述的方法，其中该至少一种另外的营养物包含氨基酸、葡萄糖、维生素、蛋白质水解产物或其任何组合。
实施例25b：如实施例23b或24b中任一项所述的方法，其中添加该至少一种另外的营养物以促进处于功能形式的目的蛋白质的表达。
实施例26b：如实施例5b至25b中任一项所述的方法，其中相对于在有效量的胱氨酸在ccf中未保持在0之上的过程中制造的含二硫键的目的蛋白质的产量，含二硫键的目的蛋白质的产量提高了约20％至100％。
实施例27b：如实施例5b至26b中任一项所述的方法，其中二硫键还原电位通过如下方法测量，该方法包括：将在制造工艺期间在选定时间点获得的ccf样品储存在真空室中，并测量相对于对照样品的目的蛋白质的片段化水平。
实施例28b：如实施例27b所述的方法，其中在非还原条件下使用生物分析仪上测量片段化水平。
实施例29b：如实施例28b所述的方法，其中该生物分析仪包含gxlabchip。
实施例30b：如实施例1b至29b中任一项所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质是重组蛋白。
如实施例30b所述的方法，其中通过用编码含二硫键的目的蛋白质的表达质粒转染宿主细胞来获得重组蛋白。
实施例31b：如实施例30b所述的方法，其中目的蛋白质是从宿主细胞分泌的。
实施例32b：如实施例30b或31b所述的方法，其中宿主细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞或ns0细胞。
实施例33b：如实施例1b至30b中任一项所述的方法，其中该含二硫键的目的蛋白质是抗体或其抗原结合片段。
实施例34b：如实施例33b所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其片段。
实施例35b：如实施例34b所述的方法，其中该单克隆抗体或其片段是igg抗体或其片段。
实施例36b：如实施例35b所述的方法，其中igg是igg1、igg2、igg3或igg4。
实施例37b：如实施例33b所述的方法，其中该抗体或其抗原结合片段是fab、fab'、f(ab')2或二硫键连接的fv(sdfv)。
实施例38b：如实施例33b至37b中任一项所述的方法，其中该抗体或其片段是嵌合的、人的或人源化的。
实施例39b：如实施例1b至38b中任一项所述的方法，其中目的蛋白质中的二硫键是分子间的或分子内的。
实施例40b：如实施例1b至39b中任一项所述的方法，其中培养过程是分批过程、补料分批过程、重复补料分批过程、灌注过程、连续过程或其组合。
实施例41b：如实施例1b至40b中任一项所述的方法，其中通过直接添加胱氨酸溶液、营养补料、营养液、含有单体半胱氨酸的溶液、或含有胱氨酸的溶液中的至少一种来维持培养物或发酵中的胱氨酸水平。
实施例42b：如实施例41b所述的方法，其中单体半胱氨酸在氧化条件下转化为胱氨酸。
实施例43b：如实施例1b所述的方法，其中将胱氨酸添加至细胞培养过程以维持胱氨酸水平高于0和/或将cu添加至细胞培养过程以维持水平高于0，和/或将edta在收获前添加到细胞培养过程中以增加细胞培养或发酵过程中含完整二硫键的目的蛋白质的产量或降低含二硫键的目的蛋白质的还原或还原电位。
实施例44b：如实施例1b所述的方法，其中在收获前将edta以>9.5mm、>19mm或>38mm添加到细胞培养过程中以增加细胞培养或发酵过程中含完整二硫键的目的蛋白质的产量或降低含二硫键的目的蛋白质的还原或还原电位。
实施例45b：如实施例1b所述的方法，其中在收获前将胱氨酸以>4mm或>8mm添加到细胞培养过程中以增加细胞培养或发酵过程中含完整二硫键的目的蛋白质的产量或降低含二硫键的目的蛋白质的还原或还原电位。
实施例1c：一种用于改善纯化的含二硫键的目的蛋白质的稳定性的方法，该方法包括使用使该含二硫键的目的蛋白质保持为具有最少游离巯基的形式的制造工艺，从而降低该制造工艺期间含二硫键的目的蛋白质的还原或还原电位。
实施例2c：如实施例1c所述的方法，其中该制造工艺包括细胞培养阶段、收获阶段、至少一个保持阶段、纯化阶段或其任何组合。
实施例3c：如实施例2c所述的方法，其中该保持阶段包括将该材料存储在该制造工艺期间的任何阶段中。
实施例4c：如实施例3c所述的方法，其中该保持阶段包括在收获阶段之后且在纯化阶段之前将收获的细胞培养液(hccf)储存持续一段时间，多达一天、至少四天、至少一周、至少10天、至少两周、至少一个月、或至少三个月。
实施例5c：如实施例4c所述的方法，其中使含二硫键的目的蛋白质中的游离巯基最少化包括在整个制造工艺中减少二硫键还原。
实施例6c：如实施例4c或5c中任一项所述的方法，其中在保持阶段期间在2℃-8℃将hccf存储在气密袋中。
实施例7c：如实施例2c至6c中任一项所述的方法，其中将含二硫键的目的蛋白质中的游离巯基在整个保持阶段维持在小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％。
实施例8c：如实施例7c所述的方法，其中在药物物质阶段通过质谱法测量含二硫键的目的蛋白质中的游离巯基。
实施例9c：如前述实施例中任一项所述的方法，其中该含二硫键的目的蛋白质是抗体或其抗原结合片段。
实施例10c：如实施例9c所述的方法，其中测量抗体中在轻链、重链、铰链区或其组合中的游离巯基。
实施例11c：如实施例4c至10c中任一项所述的方法，其中减少二硫键还原包括在保持阶段或其任何部分期间在hccf中维持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例12c：如实施例11c所述的方法，其中有效量的胱氨酸包含至少约2.0mm、至少约2.5mm、至少约3.0mm、至少约3.5mm、或至少约4.0mm。
实施例13c：如实施例11c或12c所述的方法，其中有效量的cu++包含至少约2.0ppm、至少约3.0ppm、至少约4.0ppm、至少约4.5ppm、至少约5.0ppm、或至少约5.5ppm。
实施例14c：如实施例1c至13c中任一项所述的方法，其中使含二硫键的目的蛋白质中的游离巯基最少化还包括在生产阶段或其任何部分期间、在预收获阶段或其任何部分期间、在收获阶段或其任何部分期间、或其任何组合期间减少收获的细胞培养液(hccf)中的二硫键还原。
实施例15c：如实施例14c所述的方法，其中减少二硫键还原包括在制造工艺或其任何部分期间在ccf中维持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例16c：如实施例15c所述的方法，其中该制造工艺包括细胞培养阶段、收获阶段、至少一个保持阶段、纯化阶段或其任何组合。
实施例17c：如实施例15c或16c中任一项所述的方法，其中有效量的胱氨酸包含至少约2.0mm、至少约2.5mm、至少约3.0mm、至少约3.5mm、或至少约4.0mm。
实施例18c：如实施例15c至17c中任一项所述的方法，其中调节胱氨酸的量以有效地减少二硫键还原，同时使含二硫键的目的蛋白质上的cys加合物的形成最少化。
实施例19c：如实施例15c至18c中任一项所述的方法，其中有效量的cu++包含至少约2.0ppm、至少约3.0ppm、至少约4.0ppm、至少约4.5ppm、至少约5.0ppm、或至少约5.5ppm。
实施例20c：如实施例15c至19c中任一项所述的方法，其中在该制造工艺的最后14天、最后12天、最后10天、最后8天、最后6天、最后4天、最后2天、或最后一天期间在ccf中维持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例21c：如实施例15c至20c中任一项所述的方法，其中在整个制造工艺期间保持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例22c：如实施例15c至21c中任一项所述的方法，其中通过在该制造工艺期间每隔一定时间添加胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++补充剂在ccf中维持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例23c：如实施例1c至22c中任一项所述的方法，其中该制造工艺包括将这些细胞维持在ccf中持续至少8天、至少10天、至少12天、至少14天或至少16天。
实施例24c：如实施例23c所述的方法，其中在该制造工艺期间至少约每天、至少约每两天、至少约每三天、至少约每四天、或至少约每五天添加一次补充剂。
实施例25c：如实施例23c或24c所述的方法，其中该补充剂添加包括添加营养补料溶液，其中该营养补料溶液包含足量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++以在ccf中维持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例26c：如实施例25c所述的方法，其中营养补料溶液还包含至少一种另外的营养物。
实施例27c：如实施例26c所述的方法，其中该至少一种另外的营养物包含氨基酸、葡萄糖、维生素、蛋白质水解产物或其任何组合。
实施例28c：如实施例14c至27c中任一项所述的方法，其中在预收获阶段期间在hccf中维持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例29c：如实施例14c至28c中任一项所述的方法，其中在收获阶段或其部分期间在hccf中维持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例30c：如实施例29c所述的方法，其中在整个收获阶段中在ccf中维持有效量的胱氨酸、cu++或胱氨酸和cu++。
实施例31c：如实施例30c所述的方法，其中进行收获阶段以使细胞裂解最少化。
实施例32c：如实施例5c至31c中任一项所述的方法，其中使用labchip测量二硫键还原的减少。
实施例33c：如实施例32c所述的方法，其中labchip是非还原性labchip。
实施例34c：如实施例1c至33c中任一项所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质在用编码含二硫键的目的蛋白质的表达质粒转染的宿主细胞中表达。
实施例35c：如实施例1c至34c中任一项所述的方法，其中使纯化的含二硫键的目的蛋白质上的游离巯基最少化导致蛋白质聚集最少化。
实施例36c：如实施例35c所述的方法，其中通过使蛋白质聚集程度、聚集速率或其组合最小化来使蛋白质聚集最少化。
实施例37c：如实施例34c或35c所述的方法，其中使用尺寸排阻色谱法、质谱法或其组合测量随时间的纯化的目的蛋白质的聚集。
实施例38c：如实施例24c至37c中任一项所述的方法，其中将纯化的含二硫键的目的蛋白质在纯化后散装储存，并且在目的蛋白质的批准保质期内测量聚集。
实施例39c：如实施例38c所述的方法，其中将纯化的含二硫键的目的蛋白质在5℃储存，并且其中聚集速率低于约0.4％/月、低于约0.3％/月、低于约0.2％/月、低于约0.1％/月、或低于约0.05％/月。
实施例40c：如实施例38c所述的方法，其中将纯化的含二硫键的目的蛋白质在40℃储存，并且其中聚集速率低于约2％/月、低于约1.5％/月、低于约1％/月、低于约0.8％/月、或低于约0.5％/月。
实施例41c：如实施例1c至40c中任一项所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质是重组蛋白。
实施例42c：如实施例41c所述的方法，其中将重组蛋白在宿主细胞中表达。
实施例43c：如实施例42c所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质是从宿主细胞分泌的。
实施例44c：如实施例42c或43c所述的方法，其中宿主细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞或ns0细胞。
实施例45c：如实施例34c至44c中任一项所述的方法，其中该含二硫键的目的蛋白质是抗体或其抗原结合片段。
实施例46c：如实施例45c所述的方法，其中该抗体或其片段是单克隆抗体或其片段。
实施例47c：如实施例46c所述的方法，其中该抗体或其片段是igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体或igg4抗体，或其片段。
实施例48c：如实施例45c至47c中任一项所述的方法，其中该抗体或其片段是fab、fab'、f(ab')2或二硫键连接的fv(sdfv)。
实施例49c：如实施例45c至48c中任一项所述的方法，其中该抗体或其片段是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、或其片段。
实施例50c：如实施例1c至49c中任一项所述的方法，其中该含二硫键的目的蛋白质中的二硫键是分子间的或分子内的。
实施例51c：如实施例1c至50c中任一项所述的方法，其中含二硫键的目的蛋白质包含至少两个二硫键(当正确折叠时)。
实施例52c：如实施例1c至34c中任一项所述的方法，其中该制造工艺中抗体二硫键还原的最少化使纯化的含二硫键的目的蛋白质上的游离巯基水平降低并导致蛋白质聚集最少化。
实施例xx：权利要求中任一项的方法，其中通过在该制造工艺的任何步骤(包括生物反应器和收获)期间增加cu、胱氨酸、edta或氧化还原电位(通过添加氧化还原调节剂，包括金属离子(包括zn2+、mn2+、fe3+、cu2+、se2+)、胱氨酸、溶解氧、β巯基乙醇、谷胱甘肽或其组合)来实现二硫键还原和/或二硫键还原电位和/或游离巯基的最少化。
***
除非另外指示，否则本披露采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna以及免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技能范围内。此类技术在文献中得到充分解释。
抗体工程、蛋白质工程、抗体和抗体-半抗原结合以及免疫学标准方法的一般原理是本领域熟知的。在此所引用的所有公开文献、专利、和专利申请均通过引用以其全文结合在此。
通过说明而不是通过限制的方式，提供以下实例。
实例
试剂
还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水合物(nadp+)、氧化型谷胱甘肽(gssg)、硫酸铜(cuso4)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)、金硫葡糖(atg)、以及2-乙酰氨基-3-[4-(2-乙酰氨基-2-羧乙基硫烷基硫代羰基氨基)苯基硫代-氨基甲酰基硫烷基]丙酸水合物(2-aapa)可从商业来源获得(例如西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich)，圣路易斯，密苏里州)。大鼠重组硫氧还蛋白还原酶1(trxr1)是可商购的(例如，凯曼化学品公司(caymanchemical)，安娜堡，密歇根州)。亲和树脂2'5'腺嘌呤二核苷酸磷酸(adp)琼脂糖4b可以从宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗集团(gehealthcare,pittsburgh,pa)获得。抗硫氧还蛋白抗体、抗谷胱甘肽还原酶抗体、抗谷氧还蛋白抗体、人重组硫氧还蛋白(trx1)和人重组谷胱甘肽还原酶(gr)可从马萨诸塞州剑桥的艾碧康公司(abcam,cambridge,ma)获得。抗硫氧还蛋白还原酶抗体可从德克萨斯州达拉斯的圣克鲁兹生物技术公司(santacruzbiotechnology,dallas,tx)获得。试剂按原样使用并无需进一步纯化。
设备的准备
将3l能经受住高压灭菌器作用的(autoclaveable)生物反应器容器(applikonbiotechnology公司；代尔夫特，荷兰)与所有外围设备(包括探针、补料瓶等设备)连接，其中所有端口密封以形成关闭但通风的系统。将容器在高于121℃的温度下高压灭菌超过30分钟。当循环完成时，将无菌容器冷却至室温。然后向容器中填充1l无菌批次的生长培养基。将监察控制及数据采集(scada)控制器用于监控和控制工艺参数。将每个具有1个桨叶叶轮的3l生物反应器以280-300rpm搅动。将空气以94ml/min的流速喷射到3l反应器中，并以6ml/min将co2喷射到反应器中。将反应器加热至温度设定点。当温度、ph和co2达到稳定状态时，将溶解氧探针校准至94％空气饱和度，并使用血气分析仪(bga)将ph调节至离线测量值。将applikon公司或博朗公司(braun)50l(就地蒸汽(steam-in-place))生物反应器用于较大规模的运行。50l生物反应器使用来自艾伦布拉德利公司(allenbradley)的可编程逻辑控制器(plc)和人机界面(hmi)进行过程控制。将具有两个桨叶叶轮的50l生物反应器以70rpm(博朗公司)或110rpm(applikon公司)搅动。
小瓶解冻和接种物扩增
将研究性igg2单克隆抗体-a(mab-a)的开发工作细胞库(developmentworkingcellbank，dwcb)的1ml小瓶从液氮储存解冻到在250ml的nalgene通气帽的摇瓶中的30ml的接种物扩增培养基中。将摇瓶置于振荡器平台(搅动速率为120rpm)上的37℃、6％co2培养箱中。当培养物达到>2.5^6/ml的活细胞密度(vcd)时，将培养物分流成0.5-1.0^6/ml。使用依次更大的摇瓶(包括500ml和1lnalgene通气帽的摇瓶和nalgene2l带挡板的通气帽的摇瓶)扩大培养物体积，以产生用于这些生物反应器的接种物。为了扩增到50l生物反应器，使用10lsartoriuscultibag在摇杆平台上进行另外的扩增步骤，其中6％co2喷射速率为0.25l/min。将cultibag的温度控制在37℃，摇杆角度为8°，并且摇摆速率为25rpm。
生产生物反应器操作(mab-a)
生物反应器中的培养基是与用于接种物扩增相同的生长培养基。初始工作体积为1.5l(50l生物反应器中为45l)。细胞进入生产生物反应器的体积分流比为1:5(1份细胞和4份培养基)，因此在接种时将300ml细胞和另外200ml生长培养基添加到3l容器中，在这些容器中温度、ph和do受到控制。使用vicellxr细胞计数器，使用周期性活细胞计数分析培养物的生长。使用bgarapidpoint400定期收集离线测量值以测量ph和pco2；使用novabioprofile400生物分析仪测量葡萄糖、乳酸和氨；使用高级仪器模型(advancedinstrumentsmodel)2020冰点渗透压计测量重量摩尔渗透压浓度；使用带有protein-a柱的agilent1100hplc测量滴度；并使用沃特斯超高效液相色谱(uplc)氨基酸分析系统和accq标签测定来测量氨基酸。使培养物在分批阶段生长，直至活细胞密度达到2.5^6/ml，这是开始补充性营养补料方案的标准。补料分批过程持续时间约为14天。
补料方案
第一营养补料(nf)在第一天施用，使得该生产生物反应器满足2.5^6活细胞/ml的vcd标准。在初始营养补料添加后，每隔一天进行后续营养补料添加。向生物反应器中添加总共5或6次营养补料，每次由部分a和部分b组成。营养补料部分a由大部分营养补料组分(包括氨基酸、维生素和其他细胞培养营养物)组成。营养补料部分b含有l-胱氨酸和其他组分的碱性溶液。每次营养补料添加由不同量的营养补料部分a和部分b组成，如下表1中所示。
表1：原始(对照)营养补料策略。
抗体还原电位测定(bioa/真空)
每日获取生物反应器样品(1ml)，并以3000-4000rpm离心，并将上清液在-80℃立即冷冻。在测定前一天，将样品从-80℃储存中取出，解冻，并置于室温下的真空室中过夜，以在不受氧气干扰的情况下诱导单克隆抗体的还原。在真空保持后，使用bioanalyzer系统(安捷伦技术公司(agilenttechnologies))或
片段化和还原型物质分析
如果要将样品进行真空分析，则将它们解冻并涡旋。将约400μl的等分试样转移到玻璃管中。将这些管置于通过螺帽mininerttm阀(其可提供开/关控制)(vicivalcoinstruments公司，休斯顿，德克萨斯州)密封的小真空室中。通过硅管将真空施加到真空室中，并密封该室。然后通过硅管将氩气施加到该室中，直到建立氩气压力并再次密封该室。按照上述步骤重复该过程三个真空/氩气循环，并且然后在室内用氩气密封该室。然后将该室在室温下孵育过夜。
将样品冷冻储存直至分析。解冻后，将400-600μl的每种样品转移到培养管中并在含有n-乙基马来酰亚胺(nem)的非还原性样品缓冲液中混合。在变性并且游离巯基被nem封端后，使用perkinelmer
抗体聚集分析
使用标准尺寸排阻色谱(hp-sec)法测定抗体聚集体的百分比。将agilent1200系列系统与东曹生物科学公司(tosohbioscience)tskgelg3000swxl柱(东曹生物科学公司，普鲁士王，宾夕法尼亚州)(7.8mmx300mm，流速为1ml/min)(其使用0.1m磷酸钠、0.1m硫酸钠的流动相缓冲液，ph6.8)一起使用。使用280nm处的吸光度色谱法来量化结果。
收获的细胞培养液(hccf)中的游离巯基定量
收获的细胞培养液中的游离巯基的量是通过将预测的二硫键连接的肽质量与来自非还原性lys-c肽图谱的观察质量相匹配来确定。简言之，将样品变性并稀释，然后用丝氨酸蛋白酶进行消化。蛋白酶消化后，通过添加dtt使每种反应混合物中的一半还原。使用c18柱通过rp-hplc分离消化物并使用uv-检测器和在线质谱仪进行分析。二硫键连接的肽仅存在于非还原运行中并且在还原条件下将消失。
游离巯基定量测定
游离巯基测定通过测量未配对的半胱氨酸残基上的游离巯基基团的水平来评价蛋白质中二硫化物连接的完整性。将样品在天然和变性条件下与化合物(5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)或dtnb)一起孵育，该化合物结合游离巯基并释放有色硫醇盐离子。用uv可见分光光度计检测有色的硫醇盐离子。从标准曲线将游离巯基的浓度插值，并报告游离巯基与抗体的摩尔比。
在代表大规模制造工艺的条件下(初始体积为1.5l)，将中国仓鼠卵巢(cho)细胞在3l玻璃搅拌槽生物反应器中培养。在线控制和监测培养条件(温度、ph、do和搅动)。用
将在实例中使用的cho细胞系稳定地用编码免疫球蛋白的多核苷酸转染。
抗体还原测定
为了评价硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统对抗体还原的作用，用和不用一种或多种酶特异性抑制剂确定抗体还原。将来自3l生物反应器的第14天培养物样品(细胞+培养基)冷冻储存，直到所有样品都准备好进行分析。解冻后，将样品离心，通过0.2μm过滤器过滤，添加指定浓度的还原酶抑制剂，并将样品在室温下在无氧环境中储存过夜。
简言之，将培养物样品在冰上解冻；然后离心样品以除去细胞沉淀(即，以12,000rpm离心3分钟)，通过0.2μm过滤器过滤，并将上清液样品储存在冰上。向上清液样品中添加0.1mmatg、3μmcu2+或0.1mmatg和3μmcu2+两者后，将样品转移至培养管中并涡旋管以确保样品和抑制剂混合均匀。通过将真空室连接至n2气体和真空管线，将细胞培养管置于真空室中以从这些样品中清除氧气，从该室中抽出真空，然后等待一分钟。关闭真空管线并短暂打开n2管线，并且然后重复真空步骤和添加n2两次。然后将真空室在室温下储存过夜。然后将真空室在室温下储存过夜。使用2100生物分析仪使用标准的非还原方法分析样品。
通过使用2100生物分析仪系统(安捷伦科技公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)上的标准程序通过毛细管电泳检测还原型物质的存在来测量细胞培养物上清液样品中的抗体还原。根据滴度将样品稀释1-6倍，并在2100生物分析仪标准方案后在非还原条件下分析。将来自3l生物反应器的上清液样品冷冻储存，直至获得所有样品并准备好进行分析。将样品在冰上解冻并立即分析以评价在运行的每一天中反应器中还原型抗体的量。
还原酶活性测定
该测定允许确定培养物样品中的总还原酶活性，以及确定由硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶各自对样品总还原酶活性作出的贡献。在该测定中，将来自3l生物反应器的培养物样品(细胞+培养基)冷冻储存直至运行结束，之后将样品离心以除去细胞沉淀，然后将所得上清液稀释20倍至含有0.4mmnadph、0.15mm氧化型谷胱甘肽和3mmdtnb的100mmtris缓冲液(ph7.4)中，该缓冲液具有指定浓度的特异性还原酶抑制剂。向样品中添加酶特异性抑制剂允许确定总还原酶活性以及硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的个体活性。通过光谱测量412nm波长处吸光度的增加来监测还原酶活性。dtnb还原是由dtnb与硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的相互作用引起的。检测到的该波长处吸光度的增加是由dtnb还原引起的(arnér,esj,biochim.biophys.acta-gen.subj.[生物化学与生物物理学学报-遗传主题],1790:495–526,2009)。
在不存在任何抑制剂的情况下测定总还原酶活性。硫氧还蛋白还原酶抑制剂atg完全抑制硫氧还蛋白系统的还原酶活性。因此，具有atg的样品和不含任何抑制剂的样品之间的活性差异表明还原酶活性的量有助于硫氧还蛋白系统。类似地，谷胱甘肽还原酶抑制剂2-aapa完全抑制谷胱甘肽系统的还原酶活性。因此，具有2-aapa的样品和不含任何抑制剂的样品之间的还原酶活性的差异指示谷胱甘肽系统贡献的还原酶活性的量。尽管提供atg和2-aapa作为示例性特异性抑制剂，但是在该测定中可以使用上文讨论的其他特异性抑制剂来代替atg和2-aapa。
简言之，将培养物样品在冰上解冻。将解冻的样品离心以除去细胞沉淀(例如，以12,000rpm离心3分钟)，并将上清液样品储存在冰上。向96孔透明底板的孔中添加以下试剂：100mmtris缓冲液(ph7.4)(160μl–x–y–z)，其中x是样品的体积，对于背景孔为10μl或0μl，y是atg的体积，其为4.1μl或0μl。添加4.1μl产生终浓度为0.5μmatg，z为2-aapa的体积，其为5.2μl或0μl。添加5.2μl产生终浓度为100μm2-aapa，10μlnadph，终浓度为0.2mm，atg和/或2-aapa(为指定浓度，或任何还原酶特异性抑制剂)，以及10μl来自步骤的细胞培养上清液。然后使样品孵育5分钟。然后添加以下试剂：10μl氧化型谷胱甘肽，至终浓度为0.15mm，和10μldtnb，至终浓度为3mm。将每个孔快速与多通道移液管混合。每个孔中的总体积约为200μl。每30秒测定波长412nm处的吸光度，持续20分钟。
分析
还原酶活性计算如下。测定每个孔每分钟吸光度的变化(δ412)。通常，由于实验开始时的滞后时间和测定快结束时孔中检测器的饱和/试剂的耗尽，排除了前1-3分钟和最后5-10分钟。接着，将背景从每个细胞培养物样品孔中减去(δ412,样品-δ412,背景)以得到δ412,校正的校正值。然后通过以下方程计算活性：
其中，εtnb＝6.22mm-1cm-1。
蛋白质印迹测定
在下面所提到的各种实例中进行蛋白质印迹法以检测还原酶。在蛋白质印迹程序中，将来自3l生物反应器的细胞沉淀物冷冻储存直至运行结束，之后使用标准方法进行如前所述的蛋白质印迹法(handlogten等人，chem.biol.[化学生物学],21:1445–1451,2014)。以指定浓度使用一抗：抗trxr1为1/333，抗trx1为1/1000，抗grx为1/333，以及抗gr为1/2000。
酶纯化
将还原酶从细胞样品中纯化，以验证还原酶抑制剂的特异性。通过离心沉淀mabb(cho细胞系bcho-k1sv产生的igg抗体)的第14天培养物，用pbs洗涤一次并重悬于50mmtris缓冲液(ph7.5)中。将溶液均质化并在0.2μm过滤，然后加载到2'5'-adp琼脂糖4b树脂柱上。在相同的tris缓冲液中使用0至0.3mmnadp+的线性递增梯度洗脱还原酶(yadav等人，parasitol.int.[国际寄生虫学],62:193–198,2013)。使用实例3中描述的测定法测定收集的级分的还原酶活性。另外，使用蛋白质印迹分析检测收集的级分中的trxr1和gr。
收获的细胞培养液纯化
使用蛋白质a树脂(mabselectsure，通用电气医疗集团)进行纯化作为捕获步骤以从收获的细胞培养液(hccf)回收mab，接着进行低ph值处理用于病毒灭活。中间和最终抛光色谱步骤分别包括阴离子交换(superq650-m，东曹生物科学公司)和阳离子交换(poros50hs树脂，赛默飞科技公司(thermofisherscientific))色谱法。随后使用超滤/渗滤将产物配制成药物物质。
实例1：制造期间的抗体还原
为了确定制造工艺中的细胞培养阶段期间含二硫键蛋白质经历的还原的量，在三种不同的细胞系中制造三种不同的单克隆抗体，并测量这些分子的还原程度。在该实验中，分别在细胞系a(chocat-s)、b(cho-k1sv)和c(cho-k1sv)中产生三种单克隆抗体maba、mabb和mabc。单克隆抗体maba是igg1分子，mabb是igg2分子，以及mabc是igg4分子。所有三种方法都具有相似的细胞生长、细胞活力和滴度产生。另外，所有三种表达系统在制造工艺期间均产生还原酶活性。从培养的第6天开始测定每种细胞培养上清液中还原型抗体的量。按照上述方法通过毛细管电泳测定mab分子的还原程度。如图2a所示，在所有三种表达系统中，完整抗体的百分比随着时间从第8天开始降低，其中细胞系b产生最高程度的抗体还原，并且细胞系c在第14天产生最高量的完整抗体。
为了确定每个表达系统在检测到的抗体还原量和还原酶活性之间是否存在相关性，使用上文实例3中描述的比色还原酶测定方案评价每种细胞培养物样品中的总还原酶活性。如图2b所示，所有三种表达系统在14天细胞培养中均产生增加的还原酶活性。对于细胞系a和c观察到相似量的第14天细胞培养物还原酶活性，而细胞系b表现出与细胞系a和c相比几乎两倍的还原酶活性水平。与maba和mabc(其中每一种都是通过产生细胞系b的约一半还原酶活性的表达系统产生的)相比，与细胞系b相关的更高还原酶活性产生更高百分比的还原型mabb。
实例2：硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的检测
为了证实所分析的三种细胞系表达trxr1、trx1、gr、和grx，对来自单个细胞培养物的第6天和第10天的细胞沉淀进行蛋白质印迹分析，以检测谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统的酶的表达。所有三种细胞系都表达trxr1、trx1、gr和grx，这些是活性硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统所需的分子。先前的工作证明，谷胱甘肽以超过10mm的浓度存在于cho细胞中(lin等人，1992,ann.n.y.acad.sci.[纽约科学院年鉴],665:117–126)。
实例3：谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统对抗体还原的影响
通过测定这些还原酶系统引起抗体还原的条件来评价各酶系统在抗体还原中的作用。使用纯化的重组哺乳动物还原酶，通过将纯化的mabb掺入含有以下的五种溶液中来评价硫氧还蛋白系统：1)无酶，2)1μmtrxr1，3)0.1μmtrxr1，4)2.5μmtrx1和5)0.1μmtrxr1+2.5μmtrx1。所有样品均含有0.4mmnadph并在室温下储存过夜。从基于微芯片的毛细管电泳分析获得数字凝胶样图像。与上述结果一致，mabb仅在trxr1和trx1两者的存在下被还原，从而证明硫氧还蛋白系统中两种酶(trxr1和trx1)对于发生还原的必要性。
使用具有重组哺乳动物酶的相同方法，通过将mabb掺入含有以下的五种溶液中来评价谷胱甘肽系统：1)无酶，2)1mmgssg(氧化型谷胱甘肽)，3)0.2μmgr(谷胱甘肽还原酶)，4)0.2μmgr和1mmgssg，以及5)0.02μmgr和1mmgssg。如前所述，所有样品均在含有0.4mmnadph的tris缓冲液(ph7.4)中制备，并在室温下储存过夜。结果表明单独含有gssg的溶液中mabb还原最少化。这是gssg中杂质导致的结果。氧化型谷胱甘肽(不会引起还原)含有约2％的还原型谷胱甘肽(会导致还原)。在含有gr和gssg的溶液中还原maba。这些结果与涉及通过gr还原gssg以产生gsh(还原型谷胱甘肽)(其随后还原mabb的二硫键)的机制一致。
当在任一maba或mabc的存在下进行这些测定时获得类似的结果。在两种情况下，硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统显现在蛋白质制造工艺期间对抗体还原起作用。
实例4：特异性还原酶抑制剂的评价
为了确定细胞培养物样品中的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的还原酶活性的水平，评价各种抑制剂对于这些酶系统中的每一个的特异性。trxr1是还原trx1的主要酶，并且因此是硫氧还蛋白系统的中心组分和抑制靶标。gr是谷胱甘肽系统的类似中心组分。因此，trxr1活性的抑制引起整个硫氧还蛋白系统的抑制，并且gr活性的抑制引起整个谷胱甘肽系统的抑制。存在几种可商购的trxr1和gr抑制剂，并且这些抑制剂的特异性可以凭经验确定，以允许定量每个酶系统的还原酶活性。筛选了几种抑制剂，并选择atg作为trxr1的抑制剂，以及最初选择2-aapa作为gr的抑制剂。
使用来自人类和大鼠的纯化重组还原酶对atg和2-aapa的特异性进行评价。制备纯化的重组酶溶液，使得溶液的还原酶活性类似于图2b中所示的培养物样品中观察到的活性。伴随渐增浓度的atg(浓度范围为从0.05μm至5μm))，制备含有重组trxr1/trx1、gr/gssg或两种酶系统的溶液。所有样品均在含有0.4mmnadph的tris缓冲液(ph7.4)中制备。如上所解释的，通过监测dtnb还原来确定还原酶活性。如图3a所示，含有trxr1/trx1的溶液的还原酶活性随着atg浓度的渐增而降低。在atg浓度高于0.1μm时，trxr1/trx1还原酶活性可忽略不计。含有gr/gssg的溶液的还原酶活性不受atg浓度(低于5μm)影响。含有硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统两者的溶液的还原酶活性大约等于所有atg浓度下含有trxr1/trx1的样品和含有gr/gssg的样品的组合活性。该结果支持如下结论：可以选择性地抑制一种酶系统而不影响其他酶系统的活性。
以类似的方式，评价gr抑制剂2-乙酰氨基-3-[4-(2-乙酰氨基-2-羧乙基硫烷基硫代羰基-氨基)苯基硫代氨基甲酰基硫烷基]丙酸(2-aapa，seefeldt等人，2009.,j.biol.chem.[生物化学杂志],284:2729–2737)。在渐增浓度的2-aapa(浓度范围为从无抑制剂(0μm)、或10μm至200μm)的存在下，制备含有trxr1/trx1、gr/gssg或两种酶系统的溶液，并根据上述方案测定还原酶活性。如图3b所示，在该浓度范围内，2-aapa对trxr1/trx1溶液的还原酶活性具有最小影响，同时在100μm和更高浓度下完全抑制gr/gssg活性。与之前的结果类似，含有两种酶系统的溶液的活性大约等于来自trxr1/trx1和gr/gssg溶液活性的加和，为如下结论提供了进一步的证据：可以选择性地抑制一种酶系统而不影响其他还原酶系统的活性。概括起来，2-aapa是浓度为从50μm至200μm的谷胱甘肽系统活性的特异性抑制剂，并且atg是浓度为从0.5μm至1μm的硫氧还蛋白系统活性的特异性抑制剂。此外，没有抑制剂和具有atg或2-aapa的情况下还原酶活性的差异分别是来自硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的活性。
实例5：特异性还原酶对蛋白质还原的影响
为了证实来自特定还原酶系统的活性可转化为还原型抗体，开发了第二方法来确定每个还原酶系统对抗体还原的影响。还原测定的原理类似于上述还原酶活性测定。将不具有抑制剂的蛋白质还原百分比与存在gr或trxr1特异性抑制剂时蛋白质还原的百分比进行比较。在该测定中，将纯化的mabb掺入含有重组哺乳动物trxr1/trx1或重组哺乳动物gr/gssg的溶液中，并在无氧环境中储存过夜。如上所述，使用毛细管电泳评价还原型mabb抗体的百分比。
评价浓度范围为从0至1mm的trxr1抑制剂atg。如图4a所示，在0.1mm时，atg特异性地抑制了来自硫氧还蛋白系统的还原，如含有trxr1/trx1的样品(黑色条)中抗体还原的完全抑制和含有gr/gssg的样品(灰色条)中抗体的完全还原所示。在较高浓度下，atg不再对硫氧还蛋白系统具有特异性，如用0.5mm和1mmatg处理的gr/gssg样品中完整抗体的渐增的量所示。因此，为了评价由硫氧还蛋白系统引起的还原抗体的量，将atg以0.1mm(在该浓度下atg特异性地防止由trxr1/trx1引起的还原)包含在细胞培养物样品中。
gr抑制剂2-aapa，通过在gr的活性位点与半胱氨酸残基形成共价键来发挥作用。2-aapa最初使用与上述针对atg相同的方法进行评价，但2-aapa直接导致抗体还原，使其不适合该测定。因此，使用gr抑制剂硫酸铜(ii)(cuso4)来代替(rafter,g.w.,1982,biochem.med.[生化医学],27:381–391)。研究了范围为从0至100μm的cu2+浓度。图4b中显示的结果表明，浓度为3μm-100μm的cu2+防止了含有gr/gssg的样品(灰色条)中的抗体还原。然而，来自硫氧还蛋白系统的抗体还原仅在相同浓度范围内被部分抑制(黑色条)。由两种还原酶系统引起的抗体还原量的最大差异发生在3μmcu2+时，其中由gr/gssg引起的抗体还原几乎完全被抑制，而由trxr1/trx1引起的抗体还原被部分抑制，如通过trxr1/trx1样品中剩余的20％完整抗体所示。这些结果表明，虽然3μmcu2+不是gr的完全特异性抑制剂，但与硫氧还蛋白系统相比，这种浓度的cu2+对由谷胱甘肽系统引起的还原具有更大的抑制作用，并且因此适合于评价谷胱甘肽系统对抗体还原的作用。
实例6：细胞还原酶敏感性与还原酶特异性抑制剂的相关性
在上文使用来自大鼠和人的纯化重组哺乳动物酶对还原酶特异性抑制剂进行评价。为了确保细胞培养物产生的还原酶类似地受到相同抑制剂浓度的影响，使用2'5'-adp亲和柱从细胞系b的第14天培养物中纯化gr和trxr1酶。该柱保留了使用nadph作为辅因子的酶。用线性渐增梯度的nadp+洗脱还原酶。蛋白质印迹分析显示gr和trxr1在柱级分b1-c2中共洗脱。如图5a所示，使用特异性还原酶抑制剂0.5μmatg和100μm2-aapa确定60％-75％的还原酶活性来自trxr1，以及25％-40％来自谷胱甘肽还原酶，这些取决于级分。来自两个系统的加和活性大约等于在每个级分的抑制剂不存在的情况下检测到的总活性。这进一步证明了抑制剂的特异性。也就是说，如果还原酶抑制剂非特异性地抑制两种酶系统，则加和的还原酶活性将大于在没有添加任何抑制剂的情况下检测到的还原酶活性。进一步证实，当将两种抑制剂atg和2-aapa添加到样品中时，还原酶活性被完全抑制。该结果进一步证明了还原酶抑制剂的有效性和特异性。合并具有还原酶活性的级分，并在抗体还原测定中测定的抑制剂浓度下进一步评价。
将纯化的mabb掺入含有合并级分(pf)、重组trx1、gssg、nadph、atg和cu2+的不同组合的几种溶液中。将溶液在室温下温育过夜，并根据上述方案通过毛细管电泳测定剩余的完整抗体的量。在第一组样品中，将纯化的mabb掺入含有和不含nadph的合并的级分中。如图5b所示，这些样品均未显示出抗体还原活性，证明即使在nadph的存在下，单独的gr和trxr1也不能还原抗体。
在第二组样品中，将纯化的mabb掺入含有如下的溶液中：合并酶，nadph，gssg，以及无抑制剂、3μmcu2+或100μmatg。如图5b所示，含有合并酶、nadph和gssg的溶液显示出可测量的抗体还原。该溶液含有谷胱甘肽系统所需的gr、gssg和nadph。此外，cu2+完全抑制所有抗体还原，而atg不抑制抗体还原，表明3μmcu2+足以完全防止谷胱甘肽系统还原抗体，而100μmatg对从cho细胞培养物中分离的gr导致的抗体还原没有影响。
在第三组溶液含有合并酶，nadph，trx1，以及无抑制剂、3μmcu2+或100μmatg。如图5b所示，含有合并酶、nadph和trx1的溶液显示完全抗体还原，而cu2+少量地防止抗体还原，以及atg完全防止还原。该结果再次证实了atg对trxr1的特异性。在作为对照的最终样品中，将mabb掺入含有nadph、trx1和gssg的溶液中。如图5b所示，在该样品中，未检测到抗体还原，证明从cho细胞培养物中纯化的gr或trxr1是抗体还原所需的。
总之，本实例的结果表明，从细胞培养物中分离的还原酶具有对如用重组大鼠和人还原酶观察到的抑制剂浓度相似的敏感性。这些结果表明，atg和cu2+可以是分别由硫氧还蛋白和谷胱甘肽系统引起的蛋白质还原的还原酶特异性抑制剂。此外，在含有添加了nadph和gssg的合并酶的样品中，在测定结束时样品中仍然存在约30％的完整mab，而在含有trx1的类似样品中抗体完全被还原。这可能反映了合并级分中trxr1(60％-75％)对gr(25％-40％)的较高相对活性。
实例7：抑制培养物样品中的还原酶活性
使用先前评价的分别为100μm和0.5μm的特异性抑制剂2-aapa和atg，在相同的cho细胞系a、b、c、和d的第14天培养物样品中评价硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的还原酶活性。将图6a中的数据归一化为活细胞密度。细胞系a、b和c描述于上文实例6中。细胞系d是细胞系chocat-s，并且被稳定转染以产生igg1mab(mabd)。
图6a中所示的结果表明，在不存在还原酶抑制剂的情况下，细胞系b表现出细胞系a和c还原酶活性的约两倍的还原酶活性，以及细胞系d表现出细胞系a和c的还原酶活性的约一半的还原酶活性。对于所有四种细胞系，当添加2-aapa和atg两者时，还原酶活性可忽略不计。这表明2-aapa和atg的组合足以完全抑制还原酶活性。
将具有atg或2-aapa的还原酶活性与不具有抑制剂的活性进行比较，以确定来自硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的活性量，并且数据如图6b所示。通过使用trxr1特异性抑制剂atg，确定分别为35％、60％、87％和60％的细胞系a、b、c和d的总还原酶活性来自硫氧还蛋白系统。同样，gr特异性抑制剂2-aapa的结果表明，70％、45％、5％和45％的总还原酶活性分别由细胞系a、b、c和d中的谷胱甘肽系统引起。数据显示，每种还原酶系统的还原酶活性的贡献因细胞系而异。
这些结果证明在跨越不同的细胞系/过程的硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统活性的高可变性。细胞系a具有高百分比的还原酶活性(归因于谷胱甘肽系统)，细胞系b和d具有相对等效水平的还原酶活性(归因于硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统中的每种)，而相比之下，在细胞系c中观察到的大多数还原酶活性可归因于硫氧还蛋白系统。
实例8：细胞培养物样品显示的抗体还原
使用来自如实例2中所述细胞系a、b、c、和d的第14天培养物样品(细胞+培养基)测定硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统对抗体还原的影响。在有和没有抑制剂的情况下制备样品，并在无氧环境中孵育过夜，并使用毛细管电泳测定还原型抗体的百分比，并且结果如图7所示。在不存在还原酶抑制剂的情况下，将来自四种细胞系的所有四种mab还原。在100μmatg的存在下，maba被完全还原，而分别约67.5％、约87％和约35％的mabb、mabc和mabd保持完整。在3μmcu2+的存在下，maba保持完整，而mabb和mabc各自还原约50％并且约20％的mabd保持完整。在存在atg和cu2+的情况下，对于所有三种抗体，可检测的抗体还原被阻断。
trxr1抑制剂未能防止maba还原，但gr抑制剂防止了maba还原。类似地，两种抑制剂的组合防止了还原。这些结果表明maba还原主要是由谷胱甘肽系统引起的，而硫氧还蛋白系统参与很少。trxr1和gr抑制剂各自部分地防止了mabb还原，而两种抑制剂的组合完全防止了还原。这些结果证明了两种酶系统参与了mabb还原。
类似地，在trxr1抑制剂的存在下，mabd经历显著还原(大约35％完整)，并在gr抑制剂的存在下，mabd也经历显著还原(大约20％完整)。然而，当包括两种抑制剂时，完整mabd的百分比升高至约80％，证明两种酶系统均参与了mabd还原。
在trxr1抑制剂的存在下，mabc经历小幅还原(约87％完整)，并在gr抑制剂的存在下，mabc经历显著还原(约46％完整)。如上所确定，cu2+部分抑制硫氧还蛋白系统。结合这些结果证明mabc主要通过硫氧还蛋白系统被还原。
实例9：蛋白质制造期间的还原电位
在产生igg2单克隆抗体(mab-b)的50l生物反应器运行的下游处理期间观察到二硫键还原电位。使用上述真空/gx测定法对还原电位进行的研究表明在补料分批生物反应器过程期间单克隆抗体链间二硫键的还原电位(至少对于该mab)。在生物反应器运行a(br-a)的第8-14天获得的样品中观察到不同水平的还原电位。如下表2所示，在不同规模的几个生物反应器运行中，在第11-13天期间观察到还原电位。
表2：通过真空/gx测定得到的生物反应器样品中的完整mab-a的纯度。
#n/a表示未进行任何测试。
在整个运行br-a到br-d中采集的生物反应器样品中，根据制造商的说明书，通过uplc氨基酸分析来测定所有氨基酸浓度。这些结果表明，半胱氨酸/胱氨酸浓度降低与还原电位升高有关。将图8中的结果与表2中显示的片段化结果进行比较表明，还原电位与细胞培养基中的胱氨酸水平相关。由于胱氨酸在第11至13天耗尽或几乎耗尽，因此观察到还原电位的升高。在第14天，由于在第13天添加了营养补料(nf)，因此胱氨酸水平升高，并且观察到还原电位降低。
实例10：通过细胞培养氧化还原电位防止抗体还原
将细胞培养氧化还原电位用于监测生物反应器中发生的抗体链间二硫键还原的可能性。
细胞培养氧化还原电位通过氧化还原探针(梅特勒-托利多公司(metlertoledo))在线测量。细胞培养氧化还原电位的升高表明氧化环境更多，而较低的细胞培养氧化还原电位表明还原环境更多。培养氧化还原电位维持在-55mv之上或-70mv之上的过程分别具有最小量的针对maba和mabb的还原抗体。细胞培养氧化还原电位低于-55mv或低于-70mv的过程分别具有可变和高水平的还原型maba和mabb(图9a和图9b)。该分析包括来自3l规模的>20个不同过程的数据，其中通过添加不同浓度的zn2+、mn2+、fe3+、cu2+、se2+、胱氨酸、溶解氧、β巯基乙醇和谷胱甘肽来控制还原或该还原不受其控制。结果表明，不管使用的还原缓解策略如何，只要细胞培养氧化还原电位维持在阈值-55mv(针对maba)或-70mv(针对mabb)之上，则使还原的抗体的量最小化。如果需要，可以基于治疗性蛋白质、细胞系、基础培养基或氧化还原探针校准的特征进一步校准防止还原所需的阈值。
可以通过在线氧化还原测量将所披露的方法用于评价还原缓解策略的有效性。随着将氧化还原电位维持高于所鉴定的阈值，实现了还原缓解策略。另外，氧化还原探针可以与控制系统组合，该控制系统自动调节还原缓解策略以将细胞培养氧化还原电位保持在不太可能发生还原的阈值之上。该控制系统可用于响应于细胞培养氧化还原电位的降低来增加zn2+、mn2+、fe3+、cu2+、se2+、胱氨酸、溶解的氧、β巯基乙醇、或谷胱甘肽的浓度。使用基于细胞培养氧化还原电位的控制系统可防止化学缓解剂的不必要的过量添加(或do设定点的增加)。这是有利的，因为必须通过下游纯化工艺清除防止还原所需的化学品，并且升高的do可降低最终的工艺滴度。
实例11：生物反应器蛋白质制造运行br-e
在该实例中，使用mab-b(br-e)进行四部分小规模(3l)生物反应器研究(补料分批过程)，其中营养补料(包括如上所述的部分a和部分b)的量，在如下表3所示的五次nf添加中的第5次(在第11天)得到增加。在第10、12、14和16天获得生物反应器样品，并使用真空/gx测定分析还原电位。完整抗体和抗体片段的图像(其使用对补充有不同量的营养补料5(nf5)的来自br-e3l生物反应器研究的mab-b的样品进行的labchipgx测定进行可视化，并在生产生物反应器运行的不同时间点进行分析)表明，随着nf5的量渐增，片段化程度降低。如在第12、14和16天获得的生物反应器样品中更少和更轻的片段条带和渐增的完整抗体纯度所示。该数据总结在下表3中。
表3-通过生物反应器研究(在nf5处具有增加的营养补料)的gx/真空测定测量的完整mab-a的纯度
实例12：生物反应器蛋白质制造运行br-f
在该实例中，在补料分批过程中操作具有mab-b的六个3l规模生物反应器，其中对营养补料方案做如下修改：如下表4中所示，将nf3、nf4和nf5添加中nf部分b的量增加到对照体积的125％、200％和200％，其中在nf部分anf5添加增加到对照量的200％以及没有此增加。对于一些运行，将细胞培养物样品在第10天保留并冷冻，并且对于生物反应器的所有样品，在第12天和第14天保留并冷冻。随后使用上述真空/gx分析测定法分析样品。使用labchipgx测定法将在真空下储存、并在第10、12和14天取样的mab-bbr-f可视化。真空测定结果总结于下表4中。在接受nf部分b的控制量的生物反应器中，完整mab的纯度显著降低。然而，如通过非还原型gx测定法所测量的，具有增加量的nf部分b的条件显示在真空处理后来自第12天或第14天的样品中无抗体还原或完整抗体的纯度降低。
表4-通过真空/gx测定法测量的生物反应器样品(具有增加量的nf部分a和b或仅具有增加量的nf部分b)中的完整mab-a的纯度(％)。
实例13：生物反应器蛋白质制造运行br-g、br-h和br-i
在该实例中，使用补料分批(2部分补料)过程操作具有mab-b的两个3l(br-g和br-h)和50l(br-i)生物反应器。将生物反应器在与对照过程相似的条件下操作，但nf部分b的总体增加，如下表5所示。除了nf5(其增加至对照量的225％)之外，nf部分b的每次营养补料添加的量都增加至对照的150％。nf5处的nf部分a的量也增加至对照过程量的150％。当将营养补料添加次数从6减少到5时，该过程中nf部分b的总量增加了38％。这相当于l-胱氨酸增加约2mm。
表5-原始和新营养补料策略的比较
在第12天和第14天从运行中保留细胞培养物样品，并如上所述分析还原电位。使用真空下储存的第12和14天的mab-abr-g3升生物反应器运行、br-h3升生物反应器运行、和br-i50升生物反应器运行的labchipgx测定可视化完整抗体和抗体片段。这些图像表明，在第12天样品中，具有增加的nf部分b的过程显示出抗体还原显著减少以及完整抗体纯度增加。结果总结在表6中，并且显示与原始过程(br-a，实例2)相比，具有nf部分b(br-g；br-h；和br-i)增加的过程显示第12天样品中抗体还原显著减少以及完整抗体的纯度增加。
表6-通过gx/真空测定得到的原始和新过程中完整mab-b的纯度
实例14：生物反应器蛋白质制造运行br-j
在该实例中，使用表达研究性igg2单克隆抗体-a(mab-a)的cho细胞，在补料分批过程中操作两个3l规模的生物反应器(br-j-1和br-j-2)。在基础培养基配制、接种和补料标准、补料量和生物反应器设定点(例如温度和ph)方面，mab-a的制造工艺不同于mab-b的制造工艺。该过程包括相对于mab-b过程中使用的五种营养补料的六种营养补料。该过程也以相对于mab-b过程(1.5l)较低的初始工作体积(1.2l)开始。与实例1中描述的mab-b过程类似，该过程包括约14天的补料分批无动物蛋白细胞培养。与mab-b表达类似，将mab-a分泌到细胞培养基中。相对于补料方案中描述的mab-b过程来改良mab-a细胞培养过程的营养补料方案，该改良包括将六种营养补料(nf1-6)中每一种中nf部分b的量增加至对照体积的200％，如表7所示，相对于对照，每次nf添加增加0.60mm。保留细胞培养物样品并在生物反应器过程的第5、8、10、12和14天冷冻。随后解冻样品并使用真空/bioa测定法分析还原电位。对从具有和不具有包括胱氨酸的另外营养补料的mab-a生物反应器br-j样品的bioa/真空mab还原测定获得的完整抗体和抗体片段的图像分析表明，在第12天后，完整抗体的百分比随着另外量的nf部分b(包括胱氨酸)而增加。结果总结在表7中，其显示在第12天后完整mab％随着另外量的nf部分b(包括胱氨酸)而增加。还使用uplc分析生物反应器样品br-j-1和br-j-2以验证生物反应器中的胱氨酸浓度。图10中描绘的结果显示br-j-2样品中胱氨酸的增加。表7-通过真空/bioa测定法测量的生物反应器样品(具有增加量的nf部分b)中的完整mab-b的纯度(％)。
实例15：生物反应器蛋白质制造运行br-k
在该实例中，使用表达研究性igg4单克隆抗体-c(mab-c)的cho细胞，在补料分批过程中操作两个3l规模的生物反应器(br-k-1和br-k-2)。在基础培养基配制(其含有不同量的细胞培养基组分和补料)、补料量和生物反应器设定点(例如温度和ph)方面，mab-c的制造工艺不同于mab-a的制造工艺。该过程包括相对于mab-b过程中使用的五种营养补料的六种营养补料。与实例1中描述的mab-a过程类似，该过程包括约14天的补料分批无动物蛋白细胞培养。与mab-c表达类似，将mab-a分泌到细胞培养基中。mab-c过程包括对营养补料方案的修改，其包括添加另外的nf部分b和营养补料(nf1-6)中的每种。如下表8中所示，与对照生物反应器相比，另外的nf部分b增加了胱氨酸水平。保留细胞培养物样品并在生物反应器过程的第1、4、5、6、8、10、12和14天冷冻。
随后解冻样品并使用真空/bioa测定法分析还原电位。通过以下方式使用冻融循环裂解细胞：将1ml培养物冷冻在-80℃冰箱中的eppendorf管中，并且在至少12小时后，将培养物样品在37℃水浴中解冻。为了使用毛细管剪切法裂解细胞，使用
表8-通过真空/bioa测定法测量的生物反应器样品(具有增加量的nf部分b)中的完整mab-c的百分比。
实例16：样品的片段化和还原
如果要将样品进行真空分析，则将它们解冻并涡旋。将约400μl的等分试样转移到玻璃管中。将这些管置于通过螺帽mininerttm阀(其可提供开/关控制)(vicivalcoinstruments公司，休斯顿，德克萨斯州)密封的小真空室中。通过硅管将真空施加到真空室中，并密封该室。然后通过硅管将氩气施加到该室中，直到建立氩气压力并再次密封该室。按照上述步骤重复该过程三个真空/氩气循环，并且然后在室内用氩气密封该室。然后将该室在室温下孵育过夜。
将样品冷冻储存直至分析。解冻后，将400-600μl的每种样品转移到培养管中并在含有n-乙基马来酰亚胺(nem)的非还原性样品缓冲液中混合。在变性并且游离巯基被nem封端后，使用perkinelmer
抗体聚集分析
使用标准尺寸排阻色谱(hp-sec)法测定抗体聚集的百分比。将agilent1200系列系统与东曹生物科学公司(tosohbioscience)tskgelg3000swxl柱(东曹生物科学公司，普鲁士王，宾夕法尼亚州)(7.8mmx300mm，流速为1ml/min)(其使用0.1m磷酸钠、0.1m硫酸钠的流动相缓冲液，ph6.8)一起使用。使用280nm处的吸光度色谱法来量化结果。
收获的细胞培养液(hccf)中的游离巯基定量
收获的细胞培养液中的游离巯基的量通过将预测的二硫键连接的肽质量与来自非还原性lys-c肽图谱的观察质量相匹配来确定。简言之，将样品变性并稀释，然后用丝氨酸蛋白酶进行消化。蛋白酶消化后，通过添加dtt使每种反应混合物中的一半还原。使用c18柱通过rp-hplc分离消化物并使用uv-检测器和在线质谱仪进行分析。二硫键连接的肽仅存在于非还原运行中并且在还原条件下将消失。
游离巯基定量测定
游离巯基测定通过测量未配对的半胱氨酸残基上的游离巯基基团的水平来评价蛋白质中二硫化物连接的完整性。将样品在天然和变性条件下与化合物(5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)或dtnb)一起孵育，该化合物结合游离巯基并释放有色硫醇盐离子。用uv可见分光光度计检测有色的硫醇盐离子。从标准曲线将游离巯基的浓度插值，并报告游离巯基与抗体的摩尔比。
实例17：抗体二硫键还原对收获的细胞培养液中聚集形成的影响
用mabe(igg1单克隆抗体)进行小规模(3l)生物反应器补料分批研究并在第14天收集条件培养基。使用实例15中描述的毛细管使一部分收获的材料经受剪切应力，以使用连续离心机模拟大规模收获的效果。将剪切的材料分成40ml等分试样后，将等分试样掺入edta、cuso4-5h2o、胱氨酸、cuso4-5h2o和胱氨酸的组合，或不掺入任何物质。将未剪切的材料和剪切的等分试样在50ml离心管中离心，并从每种条件中倾析出上清液。然后将来自这些条件中的每一种的上清液立即在-80℃下冷冻或在2℃-8℃下储存8天然后在-80℃下冷冻。随后通过将样品保持在真空下12小时来测试冷冻样品的还原电位，并在非还原型gxii测定中测试以测量轻链和重链片段的还原物质。还使用高效尺寸排阻色谱(hpsec)测试样品的mab聚集水平。如表xx所示，剪切对照细胞培养材料导致样品具有还原电位，如通过真空处理后完整mab％降低至0所示。相反，添加有浓度为9.5mm、19mm和38mm的edta或添加有浓度为4mm和8mm的胱氨酸的剪切材料在收获时显示没有还原电位。表9还显示了在2℃-8℃下8天后对材料聚集具有类似影响。剪切细胞培养材料显示出相对于未剪切材料而言聚集显著增加。然而，添加浓度为9.5mm、19mm和38mm的edta或浓度为4mm和8mm的胱氨酸限制了mab聚集的程度。
实例18：抗体二硫键还原对mabb纯化过程中聚集体形成的影响
在纯化igg2单克隆抗体(mabb)期间，观察到增加的片段水平，如下表10所示。首先在捕获产物中检测高水平的杂质，并在该过程中的所有后续步骤中进行该检测。如图12a和图12b所示，使用非还原型(nr)-gx装置对捕获产物和最终抛光中间体的分析显示存在分子量对应于完整抗体的还原物质(l、h、l-l、h-l、h-h、h-h-l)的片段带。如图12c所示，当通过nr-gx分析hccf时，也检测到类似的还原物质带，表明在收获步骤中发生了mab还原现象。已经使用离心收获澄清细胞培养基，并且trexler-schmidt及其同事先前已经报道(2010,biotechnol.bioengeineer.[生物技术生物工程]106:452-461):苛刻的离心条件已经显示出通过增加的细胞破裂影响产品质量，该细胞破裂导致细胞内宿主细胞蛋白如硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的释放，这可以通过酶促反应导致抗体还原。
表10：比较过程优化前后的纯化过程中的聚集体和片段水平。
基于以下假设：产品质量的损失主要由释放破坏mab分子中的二硫键的细胞内还原酶驱动，通过冷却hccf并通过增加储存容器中的顶部空间来提供氧化环境来实施控制以减缓还原反应。此外，在收获后立即纯化hccf，以使还原酶暴露于mab的持续时间最短。使用纯化过程中间体的nr-gx的分析显示在整个纯化过程中不存在还原物质。
虽然有可能通过该组合方法控制还原，必须立即处理hccf对制造灵活性施加了严格限制。此外，当制造工厂中的柱尺寸限制可能需要执行捕获步骤的多个循环时，立即纯化hccf变得具有挑战性。提供氧化环境以减缓还原速率的方法涉及将hccf储存在顶部空间等于或大于hccf的实际体积的容器中。对于试验台和中试规模运行而言，这可能是一个可行的选择，但可能会对制造运行造成问题。氧气喷射和提供空气覆盖物等替代方案可能是可行的，但可能并非在所有设施上都可用。
为了允许延长的hccf保持，而不会影响产品质量，对掺入预收获的细胞培养液的赋形剂进行评价。据报道，l-胱氨酸是还原酶的潜在竞争性抑制剂，或者作为该酶的替代底物以代替mab产物(trexler-schmidt,m.等人，上文引用)。
胱氨酸添加对还原控制的影响
作为胱氨酸水平对还原控制的初始评估的一部分，通过在收获后立即将l-胱氨酸和细胞裂解物掺入到hccf中来将收获的hccf中的l-胱氨酸水平调节至0mm、2mm和4mm。为了将氧化环境与温度和胱氨酸水平对防止还原的影响分开，将hccf的等分试样密封在没有顶部空间的药物储存袋中，并在分析之前在2℃-8℃下保持2周。
在评估胱氨酸添加对纯化过程性能的影响的同时，在具有顶部空间的容器中在2℃-8℃下保持四天后，纯化含有2mm胱氨酸的hccf。如上表10所示，在纯化含有2mm胱氨酸的hccf期间，在低ph病毒灭活步骤后观察到增加的聚集体水平，其在最终抛光步骤中最终被清除。
在hccf等分试样的2周保持研究开始时，使用hccf等分试样的nr-gx分析，在2周保持研究开始时未观察到还原的迹象。然而，在保持结束时，对于含有0(无胱氨酸)和2mm胱氨酸的样品，还原已经开始(通过h-l和h-h-l片段的存在证明)，而含有4mm胱氨酸的样品仍未显示出还原的迹象。这表明单独使用低温不足以防止还原发生，并且需要胱氨酸来防止抗体还原。此外，胱氨酸水平必须足够高才能完全减少还原。
使用二硫键映射质谱(ms)，获得进一步分析证据，该证据支持低水平的胱氨酸不足以控制还原的假设。图13中显示的结果表明在保持结束时在0和2mm胱氨酸样品中相应的链间游离巯基水平更高，但在4mm胱氨酸样品或起始材料(hccf+0mmcys，t＝0)中并不是如此。franey等人(2010,proteinsci.[蛋白质科学]；19(9):1601-1615)先前曾报道，游离巯基水平的增加导致单克隆抗体聚集体形成的相应增加，并且这种现象对于igg2分子更严重，因为与其他igg形式相比，其链间二硫键的量更高。此外，hari和同事(2010,biochemistry[生物化学]；49(43):9328-9338)已经证实在低ph和高盐条件下igg1和igg2分子的聚集体形成增加。对于mabb，之前的低ph稳定性研究显示，随着缓冲液的ph从3.6降至3.2，游离巯基水平增加的速度更快且更显著。当hccf在ph3.2、ph3.4和ph3.6下孵育时随时间游离巯基与igg浓度的比率如图14a所示。当hccf在ph3.2、ph3.4和ph3.6下孵育时，聚集体随时间的变化示于图14b中。这些结果显示聚集体水平随游离巯基含量的相应增加。
4mm胱氨酸和hccf保持条件对产品质量的影响
产生新hccf并分为两个单独的批次，对其进行评价，以评估还原减少对纯化过程性能和配制的产品稳定性的影响。简言之，从细胞培养物收获(hccf)获得两个不同的批次，对一个批次，混合物中不掺入l-胱氨酸(0mm胱氨酸)；对另一个批次，向混合物中掺入4mm胱氨酸。每批混合物的一半被立即纯化和配制，而另一半在2℃-8℃保持两周后再进行纯化和配制。为了复制先前用2mm含胱氨酸的hccf观察到的聚集的条件，使用具有顶部空间的容器来储存保持两周的hccf批次。配制后，监测所有四个批次的聚集稳定性，在2℃-8℃下长达17个月，以及在25℃和40℃下长达1个月。
如图15所示，当通过二硫键映射ms分析所有四个hccf等分试样中的链间游离巯基水平时，类似于图13中所示的趋势是清楚的。在没有胱氨酸的情况下保持两周的hccf表现出游离巯基的增加，而在4mm胱氨酸的存在下保持两周的hccf具有相似水平的游离巯基(当与立即进行纯化和配制的hccf批次相比)。除了使用ms技术监测hccf中的游离巯基水平之外，还对纯化过程中间体进行了比色测定。类似于hccf等分试样，如图16所示，在从hccf(其在不存在胱氨酸的情况下保持两周)纯化的捕获产物中检测到高游离巯基水平。四个批次的游离巯基水平的趋势在整个纯化过程中也保持不变，表明该纯化过程不能降低游离巯基水平，并且在细胞培养和收获的细胞培养液(hccf)中需要防止还原和聚集，以提供充分的缓解。
将来自上文纯化的四种产物的配制的散装产品保持在5℃、25℃和40℃长达一个月，并使用hp-sec每周测量聚集体水平。如图17a至图17c所示，从在4mm胱氨酸的存在下保持两周的hccf产生的物质显示出与由立即纯化的hccf产生的散装物质相似的起始和最终纯度水平。相比之下，尽管经历了相同的纯化和配制过程，但由在没有胱氨酸的情况下保持两周的hccf产生的散装材料具有更高的起始和最终聚集体水平。此外，与其他样品相比，聚集体形成的速率也显著更高。因此，收获后较高的游离巯基含量不仅增加了纯化过程的负担，而且还限制了分子的稳定性和保质期。由于最终确定游离巯基增加的原因是mab还原的结果，因此应始终在该过程中实施适当的缓解以预防和监测在开发和生产期间抗体还原的发生。
当收获后保持收获的细胞培养液时，连续离心收获操作的引入可能是抗体还原的促成因素。这导致在整个纯化过程中观察到的片段水平升高。通过采用各种方法(低温、氧化环境、缩短保持持续时间、抑制剂添加)使还原酶活性降到最低，成功地防止了收获期间的还原。然而，在储存期间抗体还原的再次发生可以表明在收获时的还原减少有时可能是不充分的，并且保持稳定性研究应该始终作为成功缓解策略的一部分进行。
除了使用电泳技术监测片段水平之外，可以在hccf保持持续期间监测游离巯基水平的变化，作为抗体还原发生的另外测量。然而，由于这种ms技术相当耗费人力并且不能用于高通量分析，如果还原缓解策略充分，它可以用作次要的验证手段。
适当减少抗体还原的另一个好处是可以降低下游纯化过程的总负担。由于还原是可逆反应，一旦物质暴露于更多氧化环境，还原物质就会被再氧化。这可导致形成单体物质，其具有增加的聚集倾向或直接形成聚集物质。尽管该分子的聚集体形成的主要途径尚不清楚，但我们的研究清楚地表明，还原的发生导致该分子的游离巯基含量和聚集的相应增加。此外，由于据报道，与其他单克隆抗体形式相比，igg2分子更易受聚集体形成影响，伴随游离巯基水平增加，所以仅仅提供氧化环境以使还原型物质再氧化是不够的，相反，必须首先防止还原发生，以防止游离巯基水平的增加，游离巯基水平的增加是增加聚集体形成的前提。
通过具有稳健的还原缓解策略，不仅是有可能减少下游过程的杂质负担，而且该分子的稳定性也得到提高，从而导致更长的分子保质期。此外，将hccf存储更长一段时间变得可行，从而在该过程按比例放大时允许制造进度具有更大的灵活性。
实例19：抗体二硫键还原对mabf纯化过程中聚集形成的影响
在细胞培养(表11，brx-l-1)和收获后，通过蛋白质a色谱纯化mabf，并随后在ph3.6下进行低ph保持，然后中和至ph7.4。低ph处理后，聚集体水平增加了0.1％(从4.8％增加至4.9％)。在第二次细胞培养运行(brx-l-2)后进行纯化时，低ph处理后聚集体水平增加了8.7％(从2.4％增加至11.1％)。与brx-l-1(98.4％)相比，从两次运行产生的蛋白质a产物的nr-gx分析显示brx-l-2的完整mab水平较低(38.5％)。此外，电泳图(图18a和图18b)还检测到对应于重(h)和轻(l)链片段的组合的另外峰，其指示抗体二硫键还原的发生。捕获产物的游离巯基分析还显示，与brx-l-1(0.2mol/mol)相比，由brx-l-2(0.3mol/mol)产生的mab的游离巯基含量更高。随后的生物反应器(brx-l-3)进行三次缓解以防止mab还原。向营养补料部分a中添加另外的0.346mmcuso4-5h2o，使生物反应器cu增加约3ppm。在每次补料期间添加的营养补料f(含有胱氨酸)的量增加了50％，使生物反应器胱氨酸增加约1mm。最后，在收获当天，在收获前将浓度为19.2mm的edta添加到生物反应器容器中。捕获产物的nr-gx纯度(92.3％)更接近于未观察到抗体二硫键还原的brx-l-1捕获产物中观察到的水平。如所预期的，电泳图(图18c)未检测到对于brx-l-2所观察到的重链和轻链片段。当捕获产物经受低ph处理时，聚集体水平增加(0.6％)低于使用brx-l-2的运行中所观察到的。捕获产物中重链和轻链片段的水平与低ph处理中的聚集体增加之间的直接相关性表明抗体二硫键还原是低ph处理期间聚集体形成增加的原因。
表11：将细胞培养过程期间抗体二硫键还原最少化对mabf纯化期间聚集体形成的影响
实例20：igg1mab的聚集和还原电位
该实例表明在配制品缓冲液中的纯化的igg1单克隆抗体(maba)的产物不稳定性可通过在生产容器中的细胞培养期间消除还原电位而被显著降低。
细胞培养需要在37℃下在无动物蛋白的培养基中生长和扩增基于gs-cho的cat-s悬浮细胞，每3天或4天定期传代一次。在具有受控温度、ph和溶解氧水平的生物反应器中以补料分批模式进行生产。在补料分批过程中，将营养物和葡萄糖补料添加到细胞培养物中。使用vicellxr细胞计数器(贝克曼库尔特公司，加利福尼亚州)通过台盼蓝排除法测量活细胞计数和细胞活力。使用血气分析仪(rapidpoint400；西门子医学方案诊断公司(siemensmedicalsolutionsdiagnostics)；柏油村，纽约州)测量ph和溶解氧并根据需要校准生物反应器探针。使用生化分析仪测量细胞培养物样品中的葡萄糖水平(bioprofile400；novabiomedical；沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。使用分析性蛋白质ahplc测量细胞培养物的生产率。在补料分批过程结束时，使用深度过滤收获细胞培养物。然后纯化无细胞收获物质并进行配制以产生最终的药物物质。
还原电位，即该分子在厌氧条件下被还原的电位是通过如下方式来测量：如上所述对样品进行真空分析，然后添加非还原性样品缓冲液。然后使用珀金埃尔默公司
使用典型的14天哺乳动物补料分批细胞培养物(经收获、纯化并配制)产生igg1单克隆抗体的经配制的药物物质。第一个月通过hp-sec每周测量配制的药物物质中的聚集体水平，并且然后在3个月和9个月再次测量。优化的液体配制品，例如此处使用的配制品，在2℃-8℃下储存1个月后，通常应显示聚集体水平没有变化。然而，如图19所示，在这种情况下配制的药物物质在预期的储存温度(2-8℃)下在第一个月显示出非常高的聚集体增加(通过hp-sec测量，增加0.35％)。尽管在第一个月之后聚集速率减慢，但这种聚集程度对于液体药物产品是不可接受的，并且对于通常需要的更高蛋白质浓度(100-150mg/ml)将显著增加。
当如方法部分中所述测量时，观察到补料分批细胞培养物料最后的还原电位。进一步研究后，注意到在细胞培养补料分批的较早时间(第8天)没有这种还原电位。
为了鉴定在细胞培养物还原电位和配制药物物质的稳定性之间的可能关系，在来自8天和标准14天细胞培养补料分批过程的配制药物之间并行进行稳定性研究。如图20所示，来自8天补料分批的细胞培养物样品缺乏还原电位，在t＝0时起始聚集体水平较低，在升高条件(40℃)下聚集率降低3倍，并导致在预期的储存条件下(2℃-8℃)，长达9个月聚集体未增加。然而，较短的细胞培养补料分批过程也显著降低了细胞培养生产率，这从制造角度来看是不希望的。另外，由于运行结束时较高的活力，不清楚观察到的改善是否与细胞培养物中还原电位缺乏或运行结束时的高细胞活力有关。
如上所示，另一种除去细胞培养物中还原电位的方法通过在补料中添加另外的铜和胱氨酸来实现。将该方法与对照细胞培养过程并行测试。使用该策略，可以显著降低还原电位，同时实现相似的细胞培养生产力和运行结束时的细胞活力。来自暴露于还原电位分析的补料分批细胞培养物样品终点的非还原型(nr)gxii分析的电泳图如图21所示。来自运行结束时的细胞培养物样品的电泳图来自标准14天补料分批过程，并显示在图21a中；来自较短的8天补料分批过程的电泳图如图21b所示；图21c显示了来自用铜和胱氨酸增强补料的标准持续时间补料分批过程的电泳图。这些图显示，根据标准14天补料分批过程，仅约5％完整产物(igg)保留在药物物质中。如果运行结束时的细胞培养物样品来自较早(第8天)收获，则该数量显著上升(>70％)。当补料分批过程期间的进料富含铜和半胱氨酸同时保持补料分批过程的原始长度(14天)时，也实现了相同的效果。
通过暴露于还原电位分析的在运行结束时的细胞培养物样品的nr-gx分析可视化的降解片段的图像表明，大多数来自标准过程的在运行结束时的细胞培养物样品中的完整igg被降解。在另一方面，即使在将运行结束时的细胞培养物样品暴露于还原电位分析之后，用铜和胱氨酸富集补料也有助于保留完整igg。如图22所示，稳定性研究表明，消除还原电位会降低t＝0时的起始聚集体水平，使升高温度(40℃)下的聚集减少超过3倍，并导致在预期的储存条件下(2℃-8℃)，长达9个月聚集体未增加。来自这3个条件的数据总结在下表12中。
通过这些实例，我们已经证明，通过改良细胞培养过程以显著降低或消除还原电位，改善了配制的药物物质的稳定性。这会降低t0时的聚集体水平，并且导致在预期的储存条件下9个月内几乎无另外的聚集。使治疗性蛋白质的聚集最少化是成功开发具有可接受的生产和分配保质期的液体产品的关键因素。
表12：补料分批持续时间和补料富集对滴度、还原电位和药物物质聚集的影响
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