肺水肿兔动物模型的建立方法与流程

本发明属于生物模型构建领域，具体是肺水肿兔动物模型的建立方法。
背景技术：
：目前，国内复制实验性肺水肿/evlw增多动物模型的方法有很多，其中最常用的为油酸注射法、肾上腺素滴注法和氯仿注入法，也有通过小脑延髓池注入纤维蛋白原及凝血酶等建立神经源性肺水肿家兔模型的研究。通过这些方法建立的肺水肿模型中，除出现肺水肿的病理改变外多合并有肺淤血、肺出血等病理改变，而此种病理改变在肺脏超声下表现为不同的超声征象，将影响采用肺脏超声对肺水含量的判断。除此之外，肾上腺素注入后将影响心功能，引起心率加快、心肌耗氧量增加等，不利于单纯肺水肿对心功能影响的观察。而油酸系脂肪酸，油酸注入法在诱导肺水肿之外也可引起肺泡表面活性物质减少。氯仿是一种全身麻醉药，注入后可使心率加快。且临床中新生儿湿肺的发生机制即由于新生儿出生后肺液吸收延迟或不完全而引起的一系列呼吸系统症状体征。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种便于规避心率或其他外部循环影响，以克服并发呼吸系统症状的诱变模型。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：将待实验动物外接间断注入改变肺水含量增多的药剂，以增加肺间质、肺泡和细胞内的液体含量从而诱导模型产生肺水肿病变。采用上述方案后实现了以下有益效果：相对于油酸注射法、肾上腺素滴注法和氯仿注入法的现有技术，本技术方案中利用药剂直接灌注肺内以改变肺水浓度，从而实现诱变，此处规避了心率或其他外部循环影响，以克服并发呼吸系统症状的诱变模型，同时也最大程度保留了肺部表面的活性物质(直接内部灌入)，减小了并发症对实验数据的影响。进一步，所述实验动物的间断注入包括以下步骤：1)将待试验动物分为若干实验组；2)实验组中的变量包括动物的体位以及药剂注入方式；3)在注入过程中利用定量复苏，每次复苏囊通气后进行肺部超声检查。有益效果：相对于减少并发症的现有技术，本技术方案中采用间断式灌注方式，确保肺部的承载能力，同时构建肺部内循环，定时观察灌注一定数量后肺部的变化，找出并确定诱变时间段。进一步，所述步骤3)中，超声检测的方法如下：i)将每侧肺依次分为第一区域、第二区域和第三区域；ii)每个区域分为上下两个部分，随后通过标记区分左侧、右侧、上侧和下侧；iii)超声扫描过程中超声探头与肋骨垂直，扫描第一区域时采用仰卧位，扫描第二区域时采用侧卧位，扫描第三区域时采用俯卧位。有益效果：1、相对于探寻准确诱变时间点的现有技术，本技术方案中通过身位变化以确定肺部在肺水含量增多的基础上发生了实变的超声影像学征象，考虑到水在重力作用下的流动性，我们尝试了左侧卧位与右侧卧位交替情况下向肺内注入生理盐水的方法，体位的变换使注入肺内的生理盐水在肺内较为均匀的分布。2、考虑到由于重力的作用，肺内注水后位置较低部位可能病变程度重，为了获得肺内病变均匀一致的动物模型，故设置了多种不同注水体位进行观察。进一步，所述步骤i)中区域划分方法为胸骨旁线至腋前线之间的区域为第一区域，腋前线至腋后线之间的区域为第二区域，腋后线至椎骨旁线的区域为第三区域。有益效果：通过划分区域以确定病变位置以及影响力。进一步，所述诱导病变后还包括肺组织取材，肺组织取材包括以下步骤：s1，对每组待试验动物，在注入药剂量累计达60ml～80ml后，采用空气栓塞法处死；s2，剖胸取出双肺，在双侧肺门根部进行结扎，在结扎线上离断气管；s3，将肉眼可见病变部位的肺组织楔形取材后立即置于3％～4％含量的多聚甲醛溶液中；s4，将取材组织放置于冰箱2～4摄氏度保存24小时固定后取出；s5，将组织石蜡包埋后连续切片，切片厚度为3～5um。进一步，将石蜡切片进行苏木精-伊红染色法染色。进一步，将染色后的切片进行病理分析，分析过程如下：a)烤片：将切片置于60℃恒温干燥箱内2h；b)常规脱蜡水化：将切片置于二甲苯5min*2次脱蜡后，分别置于100％、100％、95％、95％、90％乙醇中各5min，除去二甲苯；c)蒸馏水冲洗5min*3次，洗去乙醇；d)苏木精染色15min，流动水冲洗15s；e)1％盐酸酒精脱色3s，流动水冲洗15min；f)伊红染色2min，流动水冲洗15s去除浮色；g)脱水：将切片分别置于90％、95％、95％、100％、100％乙醇中各5min，二甲苯5min*2，使标本透明；h)从二甲苯中取出已透明的载玻片，滴加适量中性树胶，盖上盖玻片封固标本，在光学显微镜下观察肺组织病理变化。进一步，所述步骤s2中，对肺部进行肺干重称量，所述肺干重称量方法如下用吸水纸吸净肺表面水分后进行称重，即为肺湿重，然后将肺组织放入干燥箱72小时后称重。进一步，对照正常肺组织湿干比，确定发生肺水肿病变的实验动物。进一步，所述药剂为生理盐水。附图说明图1为本发明实施例中a组(仰卧位注入生理盐水70ml)的肺水分布情况；图2为b组(仰卧位及俯卧位交替注入生理盐水70ml)的肺水分布情况；图3为c组(左侧卧位及右侧卧位交替注入生理盐水70ml)的肺水分布情况；图4为经气管插管肺内注水后肺脏解剖大体观图；图5为a组肺内注入70ml生理盐水后肺组织病理变化；图6为b组肺内注入70ml生理盐水后肺组织病理变化；图7为c组肺内注入70ml生理盐水后肺组织病理变化。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细说明：肺水肿兔动物模型的建立方法，主要是将待实验动物外接间断注入改变肺水含量增多的药剂，以增加肺间质、肺泡和细胞内的液体含量从而诱导模型产生肺水肿病变。详细构建步骤如下：1材料与方法1.1实验动物雄性新西兰兔6只，购于北京科宇动物养殖中心，动物质量许可证号：scxk(京)2017-0002。体重2.8～3.1kg，平均2.9±0.1kg。1.2主要实验试剂与仪器戊巴比妥钠、0.9％氯化钠溶液、肝素钠注射液，兔台、动物脱毛器、血管钳、解剖刀、解剖剪、有齿镊、无齿镊、医用缝合线、3.0号新生儿气管插管、复苏囊，1ml、5ml、20ml注射器，头皮针，edan便携式全数字彩色超声诊断仪(acclarixax8)，线阵探头(型号：l10-4q)，频率9-12mhz。1.3动物伦理申请该实验通过解放军总医院第五医学中心实验动物福利伦理委员会审核。1.4实验方法1.4.1动物分组将动物分成3组，每组2只。a组动物处于仰卧位经气管插管内注入0.9％氯化钠；b组动物采用仰卧位、俯卧位交替法进行气管插管内梯度注入0.9％氯化钠；c组动物采用左侧卧位与右侧卧位交替法进行气管插管内梯度注入0.9％氯化钠。1.4.2动物准备及麻醉动物禁食12h，称重后置于头部固定箱内，耳缘静脉处拔毛，碘伏消毒，5ml注射器经耳缘静脉注入20％戊巴比妥钠，20-40mg/kg。1.4.3脱毛麻醉成功后将兔取出固定箱，用动物脱毛机将兔前胸、背部、双上肢根部及颈部脱毛。1.4.4气管插管将兔仰卧位固定于锚定台，固定四肢及头部，碘伏消毒，铺巾，在颈部正中做一长约2-3cm切口，切开皮肤后，用镊子钝性分离皮下组织、肌肉及筋膜，找出气管，于环状软骨下第3软骨环横向切开气管前壁，再向上做一长约0.5cm纵向切口，使整个切口呈“t”形，清理局部渗出，在气管下方置一根4号手术线，将一新生儿用带气囊的3.0号气管插管经切口置于气管内，插入深度2cm，用手术线将气管插管固定在21气管上，接复苏囊正压通气后观察两侧胸廓起伏，如胸廓起伏良好、两侧呼吸音对称，摘下复苏囊后可见自主呼吸，说明插管成功。1.4.5模型的制备a组动物处于仰卧位经气管插管内注入10ml生理盐水，复苏囊正压通气3～5min后进行肺部超声检查，后继续注入生理盐水10ml，复苏囊正压通气3～5min后进行肺部超声检查，直至注水量累计达70ml，并记录从第1次注水至最后1次注水后完成超声检查的时间。b组采用仰卧位和俯卧位交替法进行气管插管内注入生理盐水，即每次注水时仰卧位注入5ml，复苏囊正压通气1～2min，改俯卧位，再次注入生理盐水5ml，复苏囊正压通气1～2min，然后进行肺部超声检查，直至注水量累计达70ml。c组采用左侧卧位及右侧卧位交替法进行气管插管内注入生理盐水，即每次注水时左侧卧位注入5ml，复苏囊正压通气1～2min，改右侧卧位，再次注入生理盐水5ml，复苏囊正压通气1～2min，然后进行肺部超声检查，直至注水量累计达70ml。1.4.6肺超声检查每侧肺分为3个区域，胸骨旁线至腋前线之间的区域为第一区域(左肺标记为l第一区域，右肺标记为r第一区域)，腋前线至腋后线之间的区域为第二区域(左肺标记为l第二区域，右肺标记为r第二区域)，腋后线至椎骨旁线的区域为第三区域，两侧肺共6个区域(左肺标记为l3区，右肺标记为r第三区域)。每个区域分为上下两个部分，l第一区域上记为l1/1，l第一区域下记为l1/2，以此类推。分别对双侧肺的每一个区域进行超声扫描，超声探头与肋骨垂直，扫描第一区域时采用仰卧位，扫描第二区域时采用侧卧位，扫描第三区域时采用俯卧位。1.4.7经气管插管内肺内注入生理盐水后肺组织病理分析1.4.7.1肺组织取材对每组兔，在注入生理盐水量累计达70ml后，采用空气栓塞法处死动物，快速开胸取出双肺，在双侧肺门根部进行结扎，防止肺水溢出，在结扎线上离断气管后，肉眼可见病变部位的肺组织楔形取材后(3mm*3mm)立即置于4％多聚甲醛中冰箱4摄氏度保存24小时固定后取出，石蜡包埋后连续切片，片厚度为5um。1.4.7.2he染色苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，he染色法)作为石蜡切片技术中常用的染色方法之一，是形态学观察最为常用的染色方法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内染色质和胞质内的核糖体着色为紫蓝色；伊红为酸性染液，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。1.4.7.3病理分析步骤a)烤片：将切片置于60℃恒温干燥箱内2h；b)常规脱蜡水化：将切片置于二甲苯5min*2次脱蜡后，分别置于100％、100％、95％、95％、90％乙醇中各5min，除去二甲苯；c)蒸馏水冲洗5min*3次，洗去乙醇；d)苏木精染色15min，流动水冲洗15s；e)1％盐酸酒精脱色3s，流动水冲洗15min；f)伊红染色2min，流动水冲洗15s去除浮色；g)脱水：将切片分别置于90％、95％、95％、100％、100％乙醇中各5min，二甲苯5min*2，使标本透明；h)从二甲苯中取出已透明的载玻片，滴加适量中性树胶，盖上盖玻片封固标本。在光学显微镜下观察肺组织病理变化。1.4.8兔肺湿、干重测量实验结束后采用空气栓塞方法处死动物，立即开胸将肺从心脏和大血管中解剖出来，在隆突处分离气管，用血管钳夹闭气管后取出双肺，分别在两侧肺门处进行结扎，结扎后在近心端将主支气管离断，防肺内液体流出，如图2所示。吸水纸吸净肺表面水分，取肉眼可见病变部位楔形取材后(3mm╳3mm)立即置于4％多聚甲醛中冰箱4摄氏度保存，余下肺组织进行称重，记为肺湿重。然后将肺组织放入干燥箱(80度)72小时后称重，即为肺干重。2结果2.1实验时间a组实验平均时间为66min，b组实验平均时间为151min，c组实验平均时间为58min。2.2肺部超声扫描结果请参考图1，随着注水量的增多，肺部各个分区a线消失，胸膜线模糊、中断、消失，b线的数量逐渐增多，由b线逐渐发展为融合b线及致密b线，伴有胸膜下肺实变发生。a组采用仰卧位注水，肺水分布不均匀，注水量累计达最大量70ml时，双肺第一区域仍未见明显b线，2区及第三区域胸膜线模糊、消失，出现大量b线，可见胸膜下肺实变。请参考图2，上一，左肺第一区域胸膜线光滑、规则、连续，部分a线消失，可见b线；上二，左肺第二区域胸膜线模糊、a线消失，可见b线及肺实变；上三，左肺第三区域胸膜线模糊、消失，a线消失，可见肺实变；下一，右肺第一区域未见明显病变；下二，右肺第二区域胸膜线模糊、不连续，可见大量b线及小范围肺实变；下三，右肺第三区域胸膜线消失、a线消失，可见肺实变。b组采用仰卧位及俯卧位交替注水，注水量累计达70ml时，双肺第一区域可见b线，但2区及第三区域可见胸膜线中断、不连续，甚至消失，可见胸膜下肺实变。如图4所示，上一，左肺第一区域，胸膜线尚清晰，a线消失，可见b线；上二，左肺第二区域，局部胸膜线消失，a线消失，可见大量b线及局部肺实变；上三，左肺第三区域，胸膜线消失，a线消失，可见大量b线；下一，右肺第一区域，胸膜线光滑、清晰、规则，a线消失，可见b线；下二，右肺第二区域，胸膜线模糊、不连续，a线消失，可见b线及肺实变；下三，右肺第三区域，胸膜线消失，a线消失，可见b线及肺实变。c组采用左侧卧位及右侧卧位交替注水，注水量达70ml时，双肺第一区域、第二区域及第三区域均可见到病变较为一致的肺水增多征象。如图3所示，由上往下依次为，左肺第一区域、2区、3区，右肺1区、2区、3区，各区病变性质基本一致，胸膜线增粗，a线消失，可见大量b线。2.3肺内注水后肺脏解剖大体观累计注入70ml水后，解剖双肺大体观可见双肺外观膨大，包膜紧张，可见正常肺组织与异常肺组织呈红白相间改变，如图4所示。2.4经气管插管肺内注水后肺组织病理改变组织内可见极薄的扁平上皮细胞组成的肺泡结构，局部可见数个肺泡融合成的肺泡囊；肺泡间由薄的高度血管化的胶原纤维和弹性纤维层隔开，该层与两肺泡表层的扁平上皮组成肺泡隔；其中b组肺组织中部分肺泡腔内可见中性粒细胞弥散性浸润，部分肺泡上皮细胞增生，肺泡壁增厚，如图6所示。图5中左侧a组肺内注入70ml生理盐水后肺组织病理变化，组织内可见极薄的扁平上皮细胞组成的肺泡结构，局部可见数个肺泡融合成的肺泡囊；肺泡间由薄的高度血管化的胶原纤维和弹性纤维层隔开，该层与两肺泡表层的扁平上皮组成肺泡隔。图6中b组肺内注入70ml生理盐水后肺组织病理变化，组织内可见极薄的扁平上皮细胞组成的肺泡结构，局部可见数个肺泡融合成的肺泡囊(最右侧箭头)；部分肺泡腔内可见中性粒细胞弥散性浸润(中间处箭头)，部分肺泡上皮细胞增生，肺泡壁增厚(最左侧箭头)。请参考图7，c组肺内注入70ml生理盐水后肺组织病理变化，组织内可见极薄的扁平上皮细胞组成的肺泡结构，局部可见数个肺泡融合成的肺泡囊；肺泡间由薄的高度血管化的胶原纤维和弹性纤维层隔开，该层与两肺泡表层的扁平上皮组成肺泡隔。2.5肺湿干比实验结束后采用空气栓塞法处死动物，快速开胸取出双肺，在双侧肺门根部进行结扎，防止肺水溢出，在结扎线上离断气管，用吸水纸吸净肺表面水分后进行称重，即为肺湿重。然后将肺组织放入干燥箱(80度)72小时后称重，即为肺干重，并计算肺湿干比，结果如表1所示。表1兔体重及肺湿干比分组兔体重(kg)湿肺重(g)干肺重(g)肺湿干比a12.932.352.5812.54a22.831.602.3113.68b13.142.602.7415.55b22.937.802.4515.43c13.036.002.6213.74c22.935.152.3415.023结论由于我们想得到肺含水量的增多的动物模型，故未将注水肺内的生理盐水吸出。文献表明，正常肺组织湿干比小于5，≥5认为存在肺水肿。本实验肺干湿重结果表明，注水后肺湿干比值明显上升，说明肺水含量明显增多。另外，为了在整个肺部获得均匀程度的损伤，一些研究人员将动物从仰卧位移到俯卧位。我们也借鉴了相同的实验方法，为了得到肺内病变程度较一致的动物模型，向肺内注水过程中对兔进行了体位的改变。但在经气管插管肺内注入生理盐水建立evlw增多兔模型可行性探讨中，仰卧位和俯卧位交替注入生理盐水的方法并未获得肺内病变较为均匀的兔evlw增多模型，且由于变换体位导致的实验时间明显延长，肺部在肺水含量增多的基础上发生了实变的超声影像学征象，并未获得理想的单纯evlw增多兔模型。考虑到水在重力作用下的流动性，我们尝试了左侧卧位与右侧卧位交替情况下向肺内注入生理盐水的方法，体位的变换使注入肺内的生理盐水在肺内较为均匀的分布，经肺脏超声证实，此种方法获得了肺内病变较为均匀的肺水增多兔模型。3组兔采用不同的体位经气管插管向肺内注入生理盐水后，肺脏超声扫描均获得a线减少甚至消失，b线增多的肺超声征象，而b线增多是evlw增多肺脏超声的特征性表现。经气管插管肺内注入生理盐水后肺脏明显肿大，另经肺湿干比值测定，注水后肺组织的湿干比值均明显增大，此为评估evlw含量增多的金标准。这两种情况均说明经气管插管肺内注入生理盐水的方法可以建立evlw增多的动物模型。考虑到由于重力的作用，肺内注水后位置较低部位可能病变程度重，为了获得肺内病变均匀一致的动物模型，故设置了三种不同注水体位进行观察。a组为全程仰卧位注水，肺脏超声结果表明，不同区域肺脏病变程度不同，第三区域病变明显重于第一区域及2区，且第三区域除肺水增多外出现了明显的肺实变征象，考虑为第三区域肺组织肺泡内充水时间较长，导致肺泡内肺表面活性物质失活引起了类似继发性呼吸窘迫综合征的肺脏超声改变。b组采用仰卧位及俯卧位交替体位进行注水，1、2、3区均出现了明显的病变，但由于变换体位导致实验时间明显延长，肺部超声扫描也出现了明显的肺实变征象，未获得理想的单纯肺水含量增多的兔模型。c组动物采用左侧卧位与右侧卧位交替的方法进行肺内生理盐水注入，肺脏超声扫描发现，1区、2区、3区a线均消失，出现大量的b线，且三个区域病变程度较为均一，未见明显肺实变征象，实验时间与a组时间无明显延长，获得了肺内病变较为均匀的肺水含量增多兔模型。综合以上分析，可以采用经气管插管肺内直接注入生理盐水的方法建立肺水含量增多的兔模型，比较三种注水体位下获得的肺脏超声结果发现，采用左侧卧位与右侧卧位交替的方法进行肺内生理盐水注入可以获得肺内病变较为均匀一致的肺水含量增多的兔模型。需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属
技术领域：
所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。当前第1页12