人工骨材及其制备方法

1.本技术属于组织工程技术领域，尤其涉及一种人工骨材及其制备方法。


背景技术：

2.脊柱作为人体承重主体，不仅承受人体的垂直载荷，还要随时缓冲人体运动所产生的水平荷载。基于脊柱节段性骨缺损修复过程中特殊的力学需求，人工骨(artificail bone)得到了研究和发展。人工骨材是指可以替代人体骨或者修复骨组织缺损的人工生物材料。
3.采用高密度、低孔隙率设计或者使用的金属材质制造支架材料可增加材料的力学强度，却使材料失去了良好的可降解性及多孔的特性，而材料良好的可降解性和多孔结构是高效骨再生的前提。mitchell hallman等认为材料的内部结构对于材料的力学性能和成骨能力具有重要的影响，他以羟基磷灰石(ha)和脱钙骨基质为原材料，使用3d打印技术设计出不同的内部构架结构的骨修复材料，证实不同的空间架构的支架材料的力学性质不同，对于骨修复的效果不同。而且申请人前期工作也发现材料的不同的内部空间构架对于骨再生具有重要的作用，另外也有文献报道在骨支架材料中增加“钙化层”的设计，以提高支架材料的力学性能(j bioscibioeng，2018)。
4.但是以往的“钙化层”设计均是单一层面，尚无法满足脊柱修复过程中三维立体的力学支撑需求。


技术实现要素：

5.本技术的目的在于提供一种人工骨材及其制备方法，旨在解决如何提供具有三维立体力学支撑作用、且同时具有很好的促骨生长作用的人工骨材的技术问题。
6.为实现上述申请目的，本技术采用的技术方案如下：
7.第一方面，本技术提供一种人工骨材的制备方法，包括如下步骤：
8.建立具有框架剪力墙结构的可降解支架材料；
9.配制外泌体微球混悬液；
10.将所述可降解支架材料置于所述外泌体微球混悬液中，然后依次进行除泡处理和冷冻干燥处理，得到所述人工骨材。
11.在一实施例中，所述可降解支架材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和磷酸三钙。
12.在一实施例中，所述可降解支架材料通过数学建模后，利用3d打印技术制备得到。
13.在一实施例中，所述框架剪力墙结构呈圆柱体，所述框架剪力墙结构从下到上由多层平面单元连接组成，每一层平面单元包括第一梁柱、第二梁柱和第三梁柱；所述第一梁柱包括多个相互垂直的第一横柱和第一纵柱，所述第二梁柱包括多个相互垂直的第二横柱和第二纵柱，所述第三梁柱包括多个相互垂直的第三横柱和第三纵柱，所述第一横柱、所述第二横柱和所述第三横柱相互平行，所述第一纵柱、所述第二纵柱和所述第三纵柱相互平行，所述第一梁柱的直径＜所述第二梁柱的直径＜所述第三梁柱的直径，且所述第一梁柱、
所述第二梁柱和所述第三梁柱的直径均在100μm～2000μm范围内。
14.在一实施例中，所述第一梁柱的直径为100μm～500μm，所述第二梁柱的直径为600μm～800μm，所述第三梁柱的直径为1000μm～2000μm。
15.在一实施例中，相邻的所述第一横柱和所述第一纵柱围成的孔的尺寸为100-500um，相邻的所述第二横柱和所述第二纵柱围成的孔的尺寸为3000-5000um，相邻的所述第三横柱和所述第三纵柱围成的孔的尺寸为6000-10000um。
16.在一实施例中，所述除泡处理的步骤包括：将放置有所述支架材料的所述外泌体微球混悬液震荡50～6分钟。
17.在一实施例中，所述冷冻干燥处理的步骤中，冷冻温度为-25℃至-20℃，时间为40～48小时。
18.在一实施例中，所述外泌体微球混悬液是外泌体和壳聚糖微球混合的缓释微球混悬液。
19.第二方面，本技术提供一种人工骨材，所述人工骨材由本技术所述的制备方法制备得到。
20.本技术第一方面提供的人工骨材的制备方法，将具有框架剪力墙结构的可降解支架材料置于外泌体微球混悬液中依次进行除泡处理和冷冻干燥处理得到，该可降解支架材料基于“框架剪力墙结构”的特点，使得人工骨材具有很好的横向和纵向载荷能力，可以更好地满足力学支撑需要，同时将该特有结构的可降解支架材料置于外泌体微球混悬液中进行除泡和冷冻干燥，可以使外泌体微球更好地填充在可降解支架材料的空隙内，使用时可以更好地释放外泌体；因此，这样的制备方法得到的人工骨材用于替代人体骨或进行骨修复时，不仅满足三维立体的力学支撑需求，同时可以很好地促骨生长，因此在骨修复领域中具有很好的应用前景。
21.本技术第二方面提供的人工骨材由本技术特有的制备方法制备得到，基于该制备方法的特点，该人工骨材是一种三维立体性能好、可稳定释放外泌体的人工修复材料，可作为人体骨替代材料或者修复骨组织材料。
附图说明
22.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1是本技术实施例提供的人工骨材的制备方法的流程示意图；
24.图2是本技术实施例提供的可降解支架材料中框架剪力墙结构每一个平面单元示意图；
25.图3是本技术实施例提供的人工骨材进行组织相容性实验时的位置照片。
具体实施方式
26.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释
本技术，并不用于限定本技术。
27.本技术中“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。应理解，在本技术的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本技术实施例的实施过程构成任何限定。
28.在本技术实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
29.本技术实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本技术实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本技术实施例说明书公开的范围之内。具体地，本技术实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
30.术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本技术实施例范围的情况下，第一xx也可以被称为第二xx，类似地，第二xx也可以被称为第一xx。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
31.本技术实施例第一方面提供一种人工骨材的制备方法，如图1所示，该制备方法包括如下步骤：
32.s01：建立具有框架剪力墙结构的可降解支架材料；
33.s02：配制外泌体微球混悬液；
34.s01：将可降解支架材料置于外泌体微球混悬液中，然后依次进行除泡处理和冷冻干燥处理，得到人工骨材。
35.本实施例提供的人工骨材的制备方法，将具有框架剪力墙结构的可降解支架材料置于外泌体微球混悬液中依次进行除泡处理和冷冻干燥处理得到，该可降解支架材料基于“框架剪力墙结构”的特点，使得人工骨材具有很好的横向和纵向载荷能力，可以更好地满足力学支撑需要，同时将该特有结构的可降解支架材料置于外泌体微球混悬液中进行除泡和冷冻干燥，可以使外泌体微球更好地填充在可降解支架材料的空隙内，使用时可以更好地释放外泌体；因此，这样的制备方法得到的人工骨材用于替代人体骨或进行骨修复时，不仅满足三维立体的力学支撑需求，同时可以很好地促骨生长，因此在骨修复领域中具有很好的应用前景。
36.在一实施例中，其中的可降解支架材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和磷酸三钙(tcp)。具体地，可以将plga和tcp材料混合进行打印得到具有框架剪力墙结构的可降解支架材料，plga和tcp材料可以很好地应用于骨组织修复中。
37.在一实施例中，该可降解支架材料通过数学建模后，利用3d打印技术制备得到。具体地，根据“框架剪力墙结构”的结构特征设计建立可降解支架材料的数学模型(计算机模型设计)，然后将上述可降解材料plga和tcp混合，加入到3d生物打印机喷头上，使用3d技术精确控制微观空间结构的各个参数变量相互搭配，打印成型后，得到基于“框架剪力墙结构”的plga/tcp可降解支架材料。
38.本技术实施例将建筑学中“框架剪力墙结构”的设计理念引入到生物材料的研发中，结合3d打印技术升级改良支架材料的内部结构，以实现材料内部“框架结构”的构建，提升材料垂直方向的荷载能力，在材料中央设计“剪力墙结构”以提升材料水平方向的荷载能力，以“框架剪力墙”特殊的结构特性解决脊柱节段性骨缺损修复过程中的生物力学难题。
39.在一实施例中，可降解支架材料中的框架剪力墙结构呈圆柱体，框架剪力墙结构从下到上由多层平面单元连接组成，如图2所示，每一个平面单元包括第一梁柱、第二梁柱和第三梁柱；第一梁柱包括多个相互垂直的第一横柱和第一纵柱，第二梁柱包括多个相互垂直的第二横柱和第二纵柱，第三梁柱包括多个相互垂直的第三横柱和第三纵柱，第一横柱、第二横柱和第三横柱相互平行，第一纵柱、第二纵柱和第三纵柱相互平行，第一梁柱的直径＜第二梁柱的直径＜第三梁柱的直径，且第一梁柱的直径、第二梁柱的直径和第三梁柱的直径均在100μm～2000μm范围内。这样基于该“框架剪力墙结构”的特点，该可降解支架材料具有很好的横向和纵向载荷能力。
40.进一步地，第一梁柱(包括第第一横柱和第第一纵柱)的直径为100μm～500μm，第二梁柱(包括第二横柱和第二纵柱)的直径为600μm～800μm，第三梁柱(包括第三横柱和第三纵柱)的直径为1000μm～2000μm。而相邻的第一横柱和第一纵柱围成的孔的尺寸为300μm～500μm，相邻的第二横柱和第二纵柱围成的孔的尺寸为3000μm～5000μm，相邻的第三横柱和第三纵柱围成的孔的尺寸为6000μm～10000μm。这样尺寸的框架剪力墙结构，可以使得该可降解支架材料抗压力在0.15～0.3mpa，而正常骨关节一般0.13mpa左右，因此可以很好地满足脊柱修复过程中三维立体的力学支撑需求。
41.上述设置多个相互垂直的第一横柱和第一纵柱形成的第一梁柱区域的对称中心与呈圆柱体的平面单元中心重叠，同样地，多个相互垂直的第二横柱和第二纵柱形成的第二梁柱区域的对称中心，以及多个相互垂直的第三横柱和第三纵柱形成的第三梁柱区域的对称中心均与呈圆柱体的平面单元中心重叠。
42.在一实施例中，每一个平面单元围绕整个框架剪力墙结构的轴线有四个正方形单元，该四个正方形单元共同组成一个中心正方形，支架结构的内部设置有一个长方体通道，长方体通道的内部沿其长度方向为空心，长方体通道的截面为正方形，长方体通道和框架剪力墙结构同轴线，贯穿每一个中心正方形的内部，长方形通道的侧壁和每一个中心正方形的边部内侧相接触。
43.在一实施例中，外泌体微球混悬液是外泌体和壳聚糖微球混合的缓释微球混悬液。具体地，可以将壳聚糖加入水中充分分散溶解，配制成壳聚糖混悬液。壳聚糖可以是微球结构，将外泌体和多糖混悬液混合后得到混合溶液装入低压恒温喷头(温度为4～6℃)中，用喷头进行喷射，使其在低温环境下(-20℃至-15℃)喷射出雾状颗粒，因环境温度低，喷雾从喷头喷出后即凝结为颗粒状微球，经冷冻干燥后，获得外泌体和壳聚糖混合的颗粒微球，其直径在5～200μm不等。最后依次经过2000目筛和5000目筛，得到粒径为2～6μm的颗粒微球。将喷雾处理得到的颗粒微球分散在胶原基质溶液中得到外泌体微球混悬液。这样的外泌体微球混悬液可以稳定释放外泌体。上述胶原基质溶液中的胶原基质可以是选用健康成年大鼠鼠尾的软骨基质，外泌体来自骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。
44.在一实施例中，除泡处理的步骤包括：将放置有可降解支架材料的外泌体微球混悬液震荡50～60分钟。这样可以很好地去除泡沫。
45.在一实施例中，冷冻干燥处理的步骤中，冷冻温度为-25℃至-20℃，时间为40～48小时。这样可以更好地将外泌体微球填充固定在可降解支架材料的空隙内。
46.本技术实施例还提供提供一种人工骨材，该人工骨材由本技术实施例的制备方法制备得到。
47.本技术实施例提供的人工骨材由本技术特有的制备方法制备得到，基于该制备方法的特点，该人工骨材包括具有框架剪力墙结构的可降解支架材料和填充在可降解支架材料中的外泌体微球，这样的人工骨材是一种三维立体性能好、可稳定释放外泌体的人工修复材料，可作为人体骨替代材料或者修复骨组织材料。
48.下面结合具体实施例进行说明。
49.实施例1
50.具体“框架剪力墙结构”的可降解支架材料设计和制造
51.根据“框架剪力墙结构”的结构特征(如图2，第一梁柱直径为500μm，第二梁柱直径为800μm，第三梁柱直径为2000μm；而相邻的第一横柱和第一纵柱围成的孔的尺寸为500μm，相邻的第二横柱和第二纵柱围成的孔的尺寸为3000μm，相邻的第三横柱和第三纵柱围成的孔的尺寸为6000μmμm。)，利用计算机设计建立支架材料的数学模型，将plga和tcp混合加入到3d生物打印机喷头上，用3d技术精确控制微观空间结构的各个参数变量相互搭配，建构基于“框架剪力墙结构”的可降解支架材料。
52.实施例2
53.人工骨材的制备
54.1、外泌体缓释微球的建立
55.将壳聚糖溶解在去离子水中(1：1000，v/v)配制成壳聚糖混悬液10ml，在室温下加入鼠骨髓间充质干细胞bmscs来源外泌体100μl充分混合，装入低压恒温喷头(4℃)中，使其在低温环境下(-20℃)喷射出雾状颗粒，喷雾从喷头喷出后即凝结为大小不一的颗粒状微球，经冷冻干燥后外泌体微球，然后分别经过二次过筛(2000目和5000目)，得到直径在2-6μm范围内的外泌体缓释微球。
56.从大鼠鼠尾提取软骨胶原基质，用去离子水充分搅拌溶解(4％，m/v)得到95ml胶原基质溶液。将制备的外泌体缓释微球分散在去离子中(1:1000，m/m)得到5ml外泌体缓释微球分散液，然后加入95ml的胶原基质溶液中，搅拌使外泌体缓释微球与胶原基质溶混合均匀，得到外泌体缓释微球混悬液。
57.2、人工骨材的制备
58.外泌体缓释微球混悬液并放入塑料模具中。将实施例13d打印的基于“框架剪力墙结构”的可降解支架材料完全浸没于装有外泌体缓释微球混悬液的模具，在摇床上震荡60min去除气泡，放入-20℃冰箱中冷冻24h，然后放入冻干机中冻干24h，获得“钢筋混凝土”式新型人工骨材料。
59.3、理化性质及生物力学研究
60.3.1可降解支架材料的扫描电镜观察
61.取以上制备的可降解支架材料分别对其表面、底面和内部结构喷金处理后置于扫描电镜下，加速电压20kv，放大不同倍数观察。浸入液氮后折断材料，电镜扫描其内部结构，并在材料内部选取3个高倍视野(100
×
)，每视野测量10个孔径值，计算材料的平均孔径。
62.2.2可降解支架材料的孔隙率测定
63.采用液体位移法测定支架的孔隙率。将支架样本切成5mm
×
5mm大小，置入体积为v1的无水乙醇中，5min后负压吸引脱气，使乙醇充分进入多孔支架的孔隙中，直至再无气泡逸出，此时乙醇体积(浸没支架)计为v2。轻轻将浸满乙醇的支架样品取出，剩余乙醇体积计为v3。支架的孔隙率如下计算：孔隙率＝(v1-v3)/(v2-v3)，每个样本测5次，取其均值。
64.2.3可降解支架材料力学性能测试
65.利用预先设计的数学模型结合有限元分析的方法对支架材料进行初步力学性能分析；然后取3d打印出来的支架材料于万能材料试验机检测其力学性能，测定材料的垂直及水平方向的抗压强度，计算弹性模量。
66.2.4人工骨材的生物相容性研究
67.细胞相容性实验
68.取0.5ml mscs细胞悬液，4℃条件下缓慢滴入预湿润上述人工骨材样本中，于37℃，5％co2条件下共培养4h，使细胞与人工骨材充分复合。未与人工骨材复合的细胞悬液吸出、计数，计算初始细胞接种百分比(总细胞数量－未与材料复合细胞数量/总细胞数量)。补充培养液至淹没材料表面，每日换液。
69.将上述复合了mscs的人工骨材置于体外生物反应器中培养。动态培养1、3、7、10、14天后进行下列检测：
70.①
显微镜下观察细胞形态；mtt检测细胞的增殖；流式细胞术(facs，fluorescence activating cell sorter)检测细胞的细胞周期及凋亡。
71.②
透视电镜检测细胞形态学变化：用胰酶消化并收获细胞；常规固定、包埋，经醋酸双氧铀和枸橼酸铝双染；透射电镜观察。
72.③
组织学分析，收集支架材料、固定、包埋、切片、染色。分析功能细胞的粘附、迁移、增殖。
73.④
细胞在支架材料上的连续动态观察采用cm-dil荧光染料预先将复合在材料上的细胞进行荧光染色，通过荧光显微镜比较不同结构材料上细胞的粘附、迁移、增殖规律。
74.组织相容性实验
75.将人工骨材作成1.0cm
×
0.5cm
×
0.2cm块状材料，准确称取质量后，经环氧乙烷灭菌，用已经灭菌的pbs溶液(ph7.4)洗涤。挑选12只健康成年小鼠，雌雄各半，体重20g～30g，经医用酒精消毒后，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在脊柱两侧约0.5cm处作皮肤切口，将块状材料分别植入皮下和肌肉组织中缝合，创面普通消毒，定期将动物处死，每次各取三只动物，首先观察植入部位组织外观形态，有无组织异常病变。然后切取包绕试样周围0.5cm～1.0cm组织，于10％福尔马林中固定24h，石蜡包埋标本切片，he染色，光学显微镜下观察，并拍照(如图3所示)。
76.结果显示：可降解支架材料的孔隙率约为20％，抗压力的抗压强度约02mpa，可以满足脊柱修复过程中三维立体的力学支撑需求。而且细胞相容性和组织相容性好，外泌体可以均匀释放，因此可以用于骨修复。
77.以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。