磁性药物治疗的肿瘤多位于 体表或离体表较近，因此外加磁场的强度可以较弱，且易于控制，若治疗深部器官或组织的 肿瘤，则需要进一步优化磁场强度、定位和药物载体颗粒大小等。而要提高磁性微球的磁化 强度则有一定的难度，因为磁性微粒表面的包覆层会大大降低其磁性能，另外，颗粒大小的 可控也是有待解决的一个问题。
[0037] 3、细胞分离和免疫分析
[0038] 如果磁性微粒表面引接具有生物活性的专一性抗体，在外加磁场的作用 下，利用抗体和细胞的特异性结合，就可以得到免疫磁性微球（Immunomagnetic microspheres, IMMS)或免疫磁性珠 （Immunomagnetic beads, IMBS)，利用它们可快速有效 地将细胞分离或进行免疫分析。尤其是采用MBS对细胞、细胞器表面所特有的抗原物质进 行分离时，具有简便快速、分离纯度高、保留靶物质活性等特点。Mccole等用MBS分离被肝 吸虫感染过的成年牛外周血中的T淋巴细胞，分出的细胞纯净，用于肝吸虫感染机制效果 良好。John用连有单抗的IMMS检测沙门氏菌，整个检测过程只需2-3h，灵敏度为103-104 菌体/ml，一定量血液和粪便的存在对分析无干扰，与凝集法和免疫荧光法相比，灵敏度提 高103倍。Glenn用MBS分离呼吸合包体病毒，结合酶联免疫分析，减低了传统管和微孔分 析中的扩散和非特异性吸附，复合物的形成只需7min，而传统微孔法则需120min。细胞的 分离技术还可用于癌症的治疗。康继超等用物理吸附结合化学键共价结合的方法，将抗人 膀胧癌单克隆抗体连接到预先制备的聚苯乙烯磁性微球载体的表面，构建了能特异地与靶 细胞结合并赋予其以磁响应性的免疫磁性微球。结果表明，所构建的IMMS可有效地和靶细 胞结合，用IMMS从动物骨髓中分离癌细胞的初步实验表明，IMM可有效清除癌细胞，而骨髓 细胞仅有很少量的损失。免疫分析在现代生物分析技术中是一种重要的方法，它对蛋白质、 抗原、抗体及细胞的定量分析发挥着巨大的作用。利用磁性纳米微粒载体结合的抗原或抗 体进行免疫分析，具有特异性高、分离快、重现性好等特点。景晓燕等采用无乳聚合法，在 醇一水体系中，以过二硫酸钾为引发剂，在Fe304磁性流体粒子表面形成引发点，以丙烯酸 (AA)为稳定剂，通过苯乙烯（ST)与丙烯酞胺共聚，制备出单分散的胺基磁性微球，所述微 球可直接、快速与抗体（抗原）蛋白质交联，避免了其它功能团微球结合免疫试剂时需采用 蛋白质为交联剂的缺点（景晓燕，王君，李茹民，等.磁性功能高分子微球的制备研宄[J]. 应用科技，2000, 27 (1) : 16-17))。
[0039] 4、磁控检塞
[0040] 在通常的介人治疗过程中，会发生异位栓塞及梗死等现象，并引起严重的并发症， 这是临床上急需解决的棘手问题，而使用磁性微球载体的介人治疗，在磁控血管内进行栓 塞则具有磁控导向、靶位栓塞等优点，为解决以上难题提供了途径。学者们着重在磁球粒 径、磁控时间、磁场强度、磁性微球包裹材料（粗糙、携带正电荷、具有疏水特性）等方面 做了细致的研宄。Minalnimura等运用热疗和动脉栓塞相结合的疗法用于鼠肝癌模型的 研宄。他们研制了 DM-MS动脉导管局部给药，外加500kHz的磁场。治疗3d后，肿瘤增长 率（栓塞-热疗组、单纯栓塞组和对照组）分别为28%、124%和385% (Minalnimura T， Sato H，Kasaoka S, et al. Tumor regression by inductive hyperthermia combined with hepatic embolization using dextran magnetite incorporated microspheres in rats [J] · Int J Oncol，2000, 16 (6) : 1153-1160)。此研宄显示 DM-MS 热疗和栓塞相结合疗 法是一种抗肿瘤可行性疗法，具有广阔的研宄和应用前景。Goodwin等对阿霉素磁性微球 肝动脉栓塞和药物革E向对抗肿瘤疗法的毒性做了研宄（Goodwin SC, Bittner CA, Peterson CL,et al.Single-dose toxicity study of hepatic intra-arterial infusion of doxorubicin coupled to a novel magnetically targeted drug carrier [J]. Toxical, 2001，60 (I) : 117-183)。他们建立的猪肝癌模型结果显示阿霉素磁性微球低剂量 无毒副作用。只有当磁性微球的含量> =75mg(含或不含阿霉素）靶区才有较好的效果， 肝癌细胞的坏死程度与栓塞程度成正比，阿霉素不能在全身自由循环而成功地被控制在靶 区。惠旭辉等用自制的聚甲基丙烯酸甲醋磁性微球对血管内栓塞进行了探讨，实验表明， 30-50um的PMMA磁性微球具有磁响应能力强、磁控栓塞效果好、在高血流速情况下仍能实 现靶位栓塞等优点，是一种较好的磁控血管内栓塞材料（惠旭辉，高立达，何能前.聚甲基 丙烯酸甲酯磁性微球血管内栓塞实验研宄[J].四川医学，2001，22(10):928-929))。在磁 控栓塞中，磁性微球载体的大小是影响靶区定位最重要的因素。如果粒径较小，则磁响应性 弱，磁控度较差，不能用于高血流速或较大管径血管内的磁控栓塞。因此，与磁性微球在其 他方面的应用有所不同，在磁控栓塞介人治疗中，一般采用粒径较大的磁性微球。
[0041] 也有报告指出，纳米微球可作为DNA疫苗的载体蛋白和佐剂，但应用于预防性多 糖和/或蛋白类疫苗未见报道。
【发明内容】
[0042] 针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种免疫原性更强的轮状病 毒多糖-蛋白结合疫苗。
[0043] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0044] 轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体 蛋白经连接体而成的缀合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球，载体蛋白之一为轮状病毒 蛋白。
[0045] 作为一种优选方案，所述磁性纳米微球的磁性微粒位于磁性纳米微球的内部为 核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部。
[0046] 作为进一步优选方案，磁性微粒为Fe3O4。
[0047] 作为进一步优选方案，磁性纳米微球粒径为0. 1-10 μ m，优选为0. 1-5 μ m。
[0048] 作为另一种优选方案，高分子材料为生物高分子材料，选自壳聚糖、聚乙二醇、聚 乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物（PELA)中的一种或以上的混合 物；最佳为PLGA或PELA。
[0049] 作为另一种优选方案，多价肺炎球菌多糖为多种肺炎球菌荚膜多糖，优选为分离 提纯血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖，所述血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 / 或 33F。
[0050] 作为进一步优选方案，多价肺炎球菌多糖与两种载体蛋白的质量比为（0. 5?2): 1，优选为（〇. 5?1) :1，其中各载体蛋白间的质量比优选为1 :1。
[0051 ] 作为进一步优选方案，所述轮状病毒蛋白为重组人轮状病毒蛋白。
[0052] 作为一种优选优选方案，所述载体蛋白选自白喉类毒素、破伤风类毒素、载体蛋白 CRM197、嗜血流感杆菌表面蛋白HiD、百日咳Prn表面蛋白、百日咳Fha抗原和/或肺炎球菌 表面蛋白A(rPspA)。
[0053] 作为进一步优选方案，所述载体蛋白中有一种为嗜血流感杆菌表面蛋白HiD或肺 炎球菌表面蛋白A(rPspA)。
[0054] 作为进一步优选方案，重组人轮状病毒蛋白为P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基 酸序列或全序列，优选为P基因型轮状病毒毒株P[8]、P[4]、P[6]或P[ll]中的一种；其中， P 基因型轮状病毒毒株选自 P [8] Gl、P [4] G2、P [8] G3、P [8] G4、P [8] G9、P [8] G5 或 P [6] G8 中 的一种。
[0055] 作为更进一步优选方案，？基因型？[8]的轮状病毒毒株选自1&、1(11、？、￥0、皿0、 VA70、D、AU32、CH-32、CH-55、CHW2、CH927A、W161、F45、Ai-75、Hochi、Hosokawa、BR1054、 WT78或WI79毒株中的一种。
[0056] 作为更进一步优选方案，P基因型P[4]的轮状病毒毒株选自DS-1、RV-5、S2、L26、 KUN、E210、CHW17、AU64、107E18、MW333 或 TB-Chen 毒株中的一种。
[0057] 作为更进一步优选方案沖基因型？[6]的轮状病毒毒株选自1〇7、1076、1^-3、5丁3、 SC2、BrB、McN13、US1205、MW023、US585 或 AU19 毒株中的一种。
[0058] 作为另一种进一步优选方案，重组人轮状病毒蛋白选自VP8、VP4、VP8多肽链片 段、核VP8、VP4多肽链片段、VP8特异性抗原簇肽链或VP4特异性抗原簇肽链中的一种。
[0059] 作为另一种进一步优选方案，重组轮状病毒蛋白是G血清型轮状病毒的VP7蛋白 的部分氨基酸序列或全序列。
[0060] 作为另一种进一步优选方案，重组轮状病毒蛋白是G血清型轮状病毒的VP7蛋白 的部分氨基酸序列或全序列。
[0061] 作为更进一步优选方案，G血清型轮状病毒毒株选自G1、G2、G3、G4、G9、G5、G8、G10 或Gll血清型中的一种。
[0062] 作为更进一步优选方案，所述G血清型轮状病毒毒株选自P [8]Gl、P [4]G2、P [8] G3、P [8] G4、P [8] G9、P [8] G5 或 P [6] G8 血清型中的一种。
[0063] 本发明的另一目的是提供该轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，具体是将 多价肺炎球菌多糖与两种或以上的载体蛋白经偶联而成。
[0064] 作为一种优选方案，所述缀合疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
[0065] a)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；
[0066] b)分别制备并分离提纯所选用的载体蛋白；
[0067] c)分别将各种荚膜多糖与磁性纳米微球偶联成多糖-磁性纳米微球偶联体；
[0068] d)再将多糖-磁性纳米微球偶联体分别与多种载体蛋白偶联结合；
[0069] e)分离纯化步骤d)所得偶联体成所述缀合疫苗原液。
[0070] 作为进一步优选方案，所述缀合疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
[0071] a)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；
[0072] b)分别分离提纯所选用的多种载体蛋白；
[0073] c)分别将各种荚膜多糖与磁性纳米微球偶联成多糖-磁性纳米微球偶联体，再经 化学改性，从而将所述多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与多糖反应的-OH改性为-CHO ;
[0074] d)再将多糖-磁性纳米微球偶联体分别与多种载体蛋白偶联结合；
[0075] e)分离纯化步骤d)所得偶联体成所述缀合疫苗原液。
[0076] 作为进一步优选方案，所述制备方法还包括制备磁性纳米微球，包括先制备纳米 磁性粒子再制备磁性纳米微球的过程；其中纳米磁性粒子可通过化学共沉淀法、水热法或 溶胶法热解法制备，磁性纳米微球可通过包埋法、单体聚合法或原位法制备，优选为采用化 学共沉淀法制备纳米磁性粒子再将纳米磁性粒子与高分子材料经快速膜乳化结合溶剂萃 取法和/或包埋法或单体聚合法制备磁性纳米微球；最优选为采用化学共沉淀法制备纳米 磁性粒子再将纳米磁性粒子与高分子材料经快速膜乳化结合溶剂萃取法和/或包埋法制 备粒径均一的磁性纳米微球；其中磁性微粒优选为Fe 304。
[0077] 作为更进一步优选方案，上述纳米磁性离子的制备