etobutylicum gi |15896488| (SEQ ID NO:40) λ Clos_tetani GI: 75543266 (SEQ ID NO:41) λ Desu_desulfuricans gi 23475919. (SEQ ID N0:42)、Vibr-vulnificus gi 1273617341 (SEQ ID N0:43)、Caul- crescentus gi|】6127222|(SEQ ID N0:44)、Micr-degradans gi|23027521」（SEQ ID N0:45)、 Vibr_cholerae gi |15601476| (SEQ ID N0:46) λ Shew_oneidensis gi |24373702| (SEQ ID N0:47)、Rat-betal-sGC gi|2712731§| (SEQ ID N0:48)、Rat-beta2-sGC gi |2195663$ (SEQ ID N0:49)、Nost-punctiforme gi|2312960$ (SEQ ID N0:50)和 Nost-sp.gi|1722977Q| (SEQ ID N0:51)。共有序列显示在图5B的底部（SEQ ID N0:52)。对比使用程序 MULTALIN(Corpet，F. (1988)Nucleic Acids Res. 16:10881 - 10890)产生，并且图 5B使用程 序 ESPRIPT (Gouet，P.et al. (1999) Bioinformatics 15:305 - 308)制作。
[0046] 图6A和6B是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域的血红素环境的三维结构图。图 6A 和 6B 来自 Pellicena，P.等人（2004 年 8 月 31 日），"Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases，" Proc Natl. Acad Sci USA 101 (35):12854-12859。
[0047] 图 7A-7F 是对于 Tt H-NOX (图 7A)、Tt Y140L (图 7B)、Tt W9F-Y140L (图 7C)、Tt F78Y-Y140L(图 7D)、L2H-N0X和 L2F142Y(图 7E)以及 β 1 (1-385)和 β 1 (1-385)Ι145Υ(图 7F)，在暴露于空气合物；每个图的底部图线）之前和之后，在厌氧还原作用（Fe11 未连接复合物；每个图的顶部图线）后H-NOX蛋白的UV-可见光光谱图。除了 L2F142Y和 β 1(1-385) 1145Y 的 Fe11 和 Fe π-02复合物之外，野生型 L2H-N0X 和 β 1-(1-385) H-NOX 在还 原反应和暴露于空气之后的光谱分别显示在图7E和7F中的中间图线，显示出这些蛋白在 加入远侧袋酪氨酸之前不结合O 2。在每个图左上角书写的两个或三个数字代表图中图线峰 的波长。这些数字以其中相应的图线在图中垂直出现的顺序进行垂直书写。例如，图7A中 的430nm值表示该图中顶部图线的波长的峰（其代表Fe 11未连接复合物），而图7A中416nm 值表示该图中底部图线的波长的峰（其代表Fe11-O2复合物）。在空气存在的情况下，波长 的偏移表示该蛋白质结合O 2。在空气存在的情况下，500到600nm间双峰的形成也表示O2 结合。图 7A-7F 来自 Boon, E.M.等人（2005)/'Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,''Nature Chem. Biol. 1:53-59。
[0048] 图8A-8DD包括编码H-NOX蛋白的示例性核酸的多核苷酸序列和相应H-NOX蛋白 的氨基酸序列（SEQ ID NOS :53-162)。 发明详述
[0049] 本发明部分基于这样惊人的发现：H-NOX蛋白具有比血红蛋白低得多的NO反 应性。由于通过内源性NO使H-NOX蛋白失活的较低可能性，和通过H-NOX蛋白清除内 源性NO的较低可能性，这一内在的低NO反应性（和高NO稳定性）使得野生型和突变 H-NOX蛋白成为理想的血液替代物。重要地，远侧袋酪氨酸在一些H-NOX蛋白中的存在 (Pellicena，P.等人（August 31，2004) ,"Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases, " Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859)暗示了不理想的、高NO反应性，表明用作血液替代物不可取。例 如，通过类推，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)血红蛋白，带有结构上类似 的远侧袋酪氨酸，与NO反应极其迅速，并被分支杆菌（Mycobacterium)用于有效清除和 避免由感染的宿主产生的防御性N0(0uellet，H.等人（2002年4月30日），"Truncated Hemoglobin HbN Protects Mycobacterium Bovis From Nitric Oxide, Troc. Natl. Acad. Sci.U S A99 (9) : 5902-5907) 〇然而，我们吃惊地发现，H-NOX蛋白实际上具有比血红蛋白 低得多的NO反应性，使它们用作血液替代物成为可能。
[0050] 此外，令人吃惊地发现，结合NO而不结合O2的H-NOX蛋白可以通过单个氨基酸突 变的引入被转化为结合NO和0 2的H-NOX蛋白。因此，H-NOX蛋白对0 2和NO的亲和性以及 H-NOX蛋白分辨02和NO配体的能力可以通过一个或多个氨基酸突变的引入而被改变，允许 H-NOX蛋白被修改成以期望亲和力结合02或N0。其它突变可以被引入，以进一步改变对0 2 和/或NO的亲和性。H-NOX蛋白家族可以因此被操纵，以显示出改善的或优化的O2输送动 力学和热力学特征。例如，突变H-NOX蛋白已经被产生，其带有改变的对O 2结合的解离常 数和/或解离速率，这改善了 H-NOX蛋白对多种临床和工业应用的有用性。调整H-NOX蛋 白结合和输送O2的能力是解决和克服当前O 2载体主要缺点的治疗途径。因此，本发明提供 了用于氧输送的蛋白质、组合物、试剂盒及方法。
[0051] 使用H-NOX蛋白进行02输送有很多益处。外伤和手术后输血的主要作用是输送 O2。理想的血液替代物避免了传统血液的挑战：病毒污染、配型要求、有限的使用期和有限 的可用性。血红蛋白基血液替代物的主要限制是它们对O2的高亲和性和它们与NO反应的 倾向性。如上文提到，即使低水平的NO破坏也可对血管和器官的紧张性静止状态（tonic resting state)产生严重的影响，并导致高血压和胃肠不良应激。此外，在与NO反应的过 程中，血红蛋白在临床相关时帧（clinically relevant timeframe)内失去其输送02的 能力。已经进行了多种尝试，以将第一代血红蛋白基氧载体（hemoglobin-based oxygen carriers, HBOC)的毒性减到最小，包括分子内和分子间交联（"131〇〇(131^81:;[1：1^68，"1?· Winslow ed. Academic Press, 2006)。尽管这些修饰克服了一些与血红蛋白外渗相关的 严重毒性问题，但是由于高NO反应性，氧结合的破坏仍存在。这些第二代HBOC显示出 降低的氧亲和性，具有接近红细胞P50值的p50值，但它们已经在临床试验中失败。由 Wins low和同事提出了 一种替代假设：具有合适粘度和胶体渗透压的低p50HB0C比高 p50HB0C 更适合用于无细胞氧输送（Tsai, A.G.等人（2003)，"Targeted O2Delivery by low-P50hemoglobin:A New Basis for O2Therapeutics, " Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285:H1411_H1419;Winslow(2007)· "Red Cell Substitutes, "Seminars in Hematology 44:51-59)。这类HBOC的NO反应性是否成为临床试验中的问题仍有待观察。 工程改造 H-NOX蛋白以在最小的NO反应性下结合并输送O2，提供了用于血液替代物中的新 的血液气态O2载体，其中H-NOX蛋白输送0 2而不清除N0,或通过NO被钝化为0 2载体。这 些H-NOX蛋白、组合物、试剂盒和方法在本文中进一步描述。 H-NOX蛋白 H-NOX蛋白家族概览
[0052] 除非另有说明，任何野生型或突变H-NOX蛋白可以被用在本文所述的组合物、试 剂盒及方法中。如本文所使用，"Η-Ν0Χ蛋白"是指具有H-NOX结构域（命名为血红素-一氧 化氮和氧(Heme-Citric oxide and巡ygen)结合结构域）的蛋白质。除H-NOX结构域之外， H-NOX蛋白可以含有或可以不含有一个或多个其它结构域。H-NOX蛋白是高度保守的、良好 表征的血红素蛋白家族的成员（Iyer，L.M.等人（2003年2月3日）"Ancient Conserved Domains Shared by Animal Soluble Guanylyl Cyclases And Bacterial Signaling Proteins, 'T3MC Genomics 4(1) :5 ;Karow，D. S. ·等人（2004 年 8 月 10 日）"Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis, "Biochemistry 43 (31): 10203-10211 ;Boon，E.M··等人（2005). "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase," Nature Chem. Biol. 1:53-59 ;Boon，E.M··等人（2005 年 10 月）· "Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins, Curr. Opin. Chem. Biol. 9 (5) :441-446 ；Boon, E. M··等人（2005). "Ligand Specificity of H-N0X Domains:From sGC to Bacterial NO Sensors, "J. Inorg. Biochem. 99(4) :892-902)。H-NOX 蛋白也被称为 Pfam 07700 蛋白或 HNOB蛋白（Pfam-蛋白结构域家族对比和隐蔽马尔科夫模型（Hidden Markov Models) 的数据库，Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium;GNU LGPL Free Software Foundation, Inc.，59Temple Place-Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA)。在一些实施 方式中，H-NOX蛋白具有，或被预测具有包含6个α -螺旋、接着是2个β -折叠、接着是I 个α-螺旋、接着是2个β-折叠的二级结构。H-NOX蛋白可以是能够结合血红素的脱辅基 蛋白质或带有血红素结合的全蛋白质。H-NOX蛋白可以共价地或非共价地结合血红素基团。 一些H-NOX蛋白结合NO而非O 2，但其它结合NO和O2。来自已经被分离的兼性需氧微生物 的H-NOX结构域结合NO而非O 2。来自专性需氧原核生物、线虫和黑腹果蝇的H-NOX蛋白结 合NO和O2。哺乳动物具有两种H-NOX蛋白：β 1和β 2。小鼠、大鼠、牛和人的H-NOX序列 对比显示出这些物种享有>99 %的同一性。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的H-NOX结构域 或整个H-NOX蛋白与天然存在的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白或天然存在的sGC蛋白（例如， 天然存在的sGC|3 1蛋白）的相应区域具有至少约下列任何一种的同一性：10、15、20、25、 30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99. 5%。如本文进一步讨论，相对于相应的天然存 在的H-NOX蛋白，H-NOX蛋白可任选地包含一个或多个突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋 白包括除H-NOX结构域以外的一个或多个结构域。在具体的实施方式中，H-NOX蛋白包括 一个或多个结构域，或来自另一蛋白质的整个序列。例如，H-NOX蛋白可以是融合蛋白，其 包括H-NOX结构域和另一蛋白的部分或全部，如白蛋白（诸如人血清白蛋白）。在一些实施 方式中，只有H-NOX结构域存在。
[0053] 来自腾冲嗜热厌氧菌的原核O2-结合H-NOX的晶体结构（Nioche，P..等人 (2004 年 11 月 26 日）"Femtomolar Sensitivity of a NO Sensor From Clostridium Botulinum, ''Science 306 (5701) : 1550-1553 ;Pellicena, P. ·等人（2004 年 8 月 31 日）· "Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases," Proc Natl. Acad Sci USA 101 (35) :12854-12859)表明，酪氨酸侧 链羟基基团形成到Fe11-O2部分的关键H键。该远侧袋氢键网络--主要包括Y140,稳定 Fe11-O2复合体（图6B)。该酪氨酸不存在于排斥0 2并只结合NO的H-NOX蛋白中。例如，该 氢键网络被预测不存在于来自sGC和需氧原核生物的H-NOX蛋白中，表明这在由这些血红 素蛋白显示出的针对O 2的显著配体选择性中是关键的分子因素。图7A-7G清楚地表明，在 结合NO但不结合O2的野生型H-NOX蛋白的远侧袋中酪氨酸的添加可以使突变H-NOX蛋白 能够结合O 2。因此，在H-NOX血红素折叠的远侧血红素袋中的酪氨酸发挥开关一样的作用， 以打开或关闭O2结合。
[0054] 如图6A和6B所示，卟啉的结构被高度扭曲。如图6A所示，保守的Y-S-R基序使 氢键合与血红素基团的丙酸侧链相互作用。图6B，保守的H102是血红素的近侧配体（图 6B) 〇
[0055] 如本文所使用，"蛋白质"包括无论从天然来源分离、由重组技术产生或化学合成 的蛋白质和蛋白质片段。蛋白质可具有一种或多种修饰，例如翻译后修饰（如糖基化等） 或任何其它修饰（如聚乙二醇化等）。蛋白质可包含一个或多个非天然存在的氨基酸（例 如，如带有侧链修饰的氨基酸）。在各种实施方式中，H-NOX蛋白具有至少约50、100、150、 181、200、250、300、350、400或更多个氨基酸。在一些实施方式中，！1-勵乂蛋白可包括约50 到约600个氨基酸，例如约100到约500个氨基酸、约150到约400个氨基酸、约150到约 300个氨基酸、或约175到约200个氨基酸。 H-NOX蛋白的来源
[0056] 来自任何属或种的H-NOX蛋白可以被用在本文所述的组合物、试剂盒和方法中。 在各种实施方式中，H-NOX蛋白是来自哺乳动物（例如，灵长类（如人、猴、大猩猩、猿、狐猴 等）、牛、马、猪、犬科或猫科）、昆虫、酵母或细菌的蛋白质，或衍生自这类蛋白质。示例性的 哺乳动物H-NOX蛋白包括野生型人和大鼠可溶性鸟苷酸环化酶（如β 1亚基）。H-NOX蛋白 的实例包括野生型哺乳动物H-NOX蛋白，如智人、小鼠、家犬、西藏黄牛和褐鼠 H-NOX蛋白， 和野生型非哺乳动物的脊椎动物H-NOX蛋白，例如非洲爪蟾、中华青鏘、0. curivatus和红 鳍东方飩。非哺乳动物野生型NO-结合H-NOX蛋白的实例包括黑腹果蝇、闪比亚按蚊和烟草 天蛾的野生型H-NOX蛋白；非哺乳动物野生型O 2-结合H-NOX蛋白的实例包括线虫gcy-31、 gcy-32、gcy-33、gcy-34、gcy-35、gcy-36 和 gcy-37 ;黑腹果蝇 CG14885、CG14886 和 CG4154 ; 以及烟草天蛾β-3的野生型H-NOX蛋白；原核野生型H-NOX蛋白的实例包括腾冲嗜热厌氧 菌、霍乱弧菌、费氏弧菌、点形念珠藻、脱硫脱硫弧菌、嗜肺军团菌1、嗜肺军团菌2和丙酮丁 醇梭菌的野生型H-NOX蛋白。
[0057] 示例性H-NOX蛋白的NCBI登录号包括以下：智人β I [gi : 2746083]、褐鼠 β l[gi:27127318]、黑腹果蝇 β l[gi:861203]、黑腹果蝇 CG14885-PA[gi:23171476]、线虫 GCY-35 [gi : 52782806]、点形念珠藻[gi : 23129606]、新月柄杆菌[gi : 16127222]、沙雷氏菌 [gi:24373702]、嗜肺军团菌（ORF 2)[CUCGC_272624]、丙酮丁醇梭菌[gi:15896488]和腾 冲嗜热厌氧菌[gi :20807169]。
[0058] 示例性的H-NOX蛋白也包括以下H-NOX蛋白，其按照它们的基因名、接着是它们 的种属缩写和Genbank识别码加以列出（例如从2006年5月21日、2006年5月22日、 2007年5月21日或2007年5月22日起可用的以下蛋白序列，它们各自通过引用由此并入 其全部内容）：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、S02144_Sone_24373702、 Mdegl343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_ Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmcl0739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_ Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、 GUCYlB3_Hs_4504215、 HpGCS-betal_Hpul_14245738、 Gycbeta100 B_Dm_24651577、 CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424. 2、gi :62484298)、gcy-32_Ce_13539160、gcy-36_ Ce_17568391 (gi: 32566352、gi :86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi :71990146)、gcy-37_ Ce_17540904(gi: 71985505)、GCYl a 3_Hs_20535603、GCYl a 2-Hs_899477 或 GYCa -99B_ Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayan et al. (2003). ^Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins," BMG Genomics 4:5-13)。这些名称中使用的物种缩写包括：Ana -鱼腥藻 (Anabaena Sp) ;Ccr_ 新月柄杆菌（Caulobacter crescentus) ;Cac_ 丙酮丁 醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum) ；Dde -脱硫脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans)； Mcsp-趋磁细菌某种（Magnetococcus sp.) ;Mde-Microbulbifer degradans;Npu_ 念 珠藻（Nostoc punctiforme) ；Rhsp -球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides) ；Sone -沙雷氏菌（Shewanella oneidensis) ;Tte -腾冲嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacter tengcongensis) ;Vch_ 霍乱弧菌（Vibrio cholerae) ;Ce_ 线虫；Dm-黑腹果幡；Hpul-马奠海胆（Hemicentrotus pulcherrimus) ;Hs -智人。
[0059] 其它示例性的H-NOX蛋白包括以下H-NOX蛋白，它们按照它们的生物体名称 和Pfam数据库登录号排列（例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5 月21日或2007年5月22日起可用的以下蛋白序列，它们各自通过引用由此并入其全 部内容）：线虫种（Caenorhabditis briggsae)Q622M5_CAEBR、线虫种 Q61P44_CAEBR、 线虫种 Q61R54_CAEBR、线虫种 Q61V90_CAEBR、线虫种 Q61A94_CAEBR、线虫种 Q60TP4_ CAEBR、线虫种 Q60M10_CAEBR、线虫（Caenorhabditis elegans)GCY37_CAEEL、线虫 GCY31_ CAEEL、线虫 GCY36_CAEEL、线虫 GCY32_CAEEL、线虫 GCY35_CAEEL、线虫 GCY34_CAEEL、线虫 GCY33_CAEEL、弓背青鏘（Oryzias curvinotus) Q7T040_0RYCU、弓背青鏘 Q75WF0_0RYCU、 青鎌（Oryzias latipes)P79998_0RYLA、青鎌 Q7ZSZ5_0RYLA、黑青斑河膝（Tetraodon nigroviridis) Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚 Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚 Q4S6K5_TETNG、红 鳍东方飩（Fugu rubripes) Q90VY5_FUGRU、非洲爪蟾（Xenopus laevis) Q6INK9_XENLA、 智人 Q5T8J7_HUMAN、智人 GCYA2_HUMAN、智人 GCYB2_HUMAN、智人 GCYB1_HUMAN、大猩 猩（Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、猩猩（Pongo pygmaeus)Q5RAN8_P0NPY、黑猩猩 (Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、称猴（Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿 (Hylobates lar) Q9N191_HYLLA、小鼠 （Mus musculus) Q8BXH3_M0USE、小鼠 GCYB1_M0USE、 小鼠 Q3UTI4_M0USE、小鼠 Q3UH83_M0USE、小鼠 Q6XE41_M0USE、小鼠 Q80YP4_M0USE、褐鼠 Q80WX7_RAT、褐鼠 Q80WX8_RAT、褐鼠 Q920Q1_RAT、褐鼠 Q54A43_RAT、褐鼠 Q80WY0_RAT、 褐鼠 Q80WY4_RAT、褐鼠 Q8CH85_RAT、褐鼠 Q80WY5_RAT、