猪流感血球凝集素与神经氨酸酶变体的制作方法
【专利说明】猪流感血球凝集素与神经氨酸酶变体
[0001] 发明背景
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2012年11月16日提交的美国申请号61/727, 213的优先权。本临 时申请的披露通过引用以其全部内容结合在此。
[0004] 发明背景
[0005] 由猪起源的HlNl流感病毒导致的2009年流感大流行蔓延至超过215个 国家并且引起至少18, 000例实验室确认的死亡（加滕（Garten)等人，2009,科学 (Science) 325:197-201，31)。在这样的一种大流行的情况下，快速生产疫苗是至关重要的。 然而，人类流感病毒在作为产生流感疫苗病毒的基质的鸡胚中的生长典型地被病毒对结合 人类受体的偏好性（相对于鸟类受体）所阻碍。因此，通常需要卵适应以改善疫苗病毒在 卵中的生长（甘巴良（Gambaryan)等人，1989第175-218页，在R.克鲁格（R. Krug)(编 辑）的流感病毒（The Influenza Viruses)中，普雷纳姆出版社（Plenum Press)，纽约；罗 伯森（Robertson) 1993 医学病毒学评论（Reviews in Med. Virol. )3:97-106 ;罗伯森等人， 1987 病毒学（Virol. ) 160:31-37;罗杰斯（Rogers)等人，1983 自然（Nature) 304:76-78)。 在2009年4月HlNl大流行开始时，HlNlpdm疫苗的开发便已经被病毒在卵中的这样的不 良生长所阻碍（罗伯森（Robertson)等人，2011 疫苗（Vaccine)29:1836-1843)。
[0006] 为了产生对抗猪源HlNl流感病毒的减毒活流感疫苗（LAIV)，改变了 HA蛋白中 的三个残基（K119E、A186D、D222G，全部是Hl编号）。这些改变产生了在美国市场可获得 的作为第一种HlNlpdm疫苗的LAIV。LAIV自从2003年已经在美国得到许可并且已经在 其他国家（包括韩国和加拿大）得到批准（安布罗斯（Ambrose)等人，2008流感及其他 呼吸道病毒（Influenza Other Respi Viruses) 2:193-202)。每种 LAIV 病毒都是一种 6:2重配体，该重配体包含来自主供体病毒的6个内部蛋白基因区段和来自野生型病毒的 抗原血球凝集素（HA)和神经氨酸酶（NA)表面糖蛋白基因区段，该主供体病毒赋予温度敏 感（ts)、冷适应（ca)和减毒（att)表型（墨菲（Murphy)等人，2002病毒免疫学（Viral Immunol)15:295-323)〇
[0007]甲型 / 加利福尼亚/7/2009 (A/California/7/2009) (CA/09)样 HlNlpdm病毒自从 2009便一直流通并且已经取代了季节性HlNl病毒作为存在于每年的流感疫苗中的HlNl 株。尽管当前流通的HlNl病毒在抗原性上类似于CA/09,但是已经在新的HlNlpdm株中鉴定 了 CA/09遗传多样性和CA/09内的亚组（⑶C通讯）。另外，获得自动物模型的数据证明通过 改变序列或与其他流感病毒进行重配可以产生更具毒力的HlNlpdm(伊利希纳（Ilyshina) 等人，2010 mBio l:e00249_10;斯科劳温（Schrauwen)等人，2011 新发传染病（Emerging Infectious Diseases) 17;叶（Ye)等人，2010 PLoS 病原学（PLoS Pathog. )6:e100 1145)。 因此，重要的是在HlNlpdm病毒中鉴定出可以促进在卵中快速产生高产率病毒的遗传标 签。
[0008] 像流感HA表面蛋白一样，NA表面糖蛋白在病毒复制中发挥重要作用。HA结 合至细胞表面上的唾液酸受体并在病毒进入过程中介导病毒附着与膜融合（斯凯赫 尔（Skehel)等人，2000 生物化学年评（Annu Rev Biochem. )69:531-569)。NA 催化细 胞表面上的末端唾液酸的去除，这样使得新组装的病毒可以从受感染的细胞中释放并传 播（科尔曼（Colman)等人，1989第175-218页，在R.克鲁格（R. Krug)(编辑）的流感 病毒（The Influenza Viruses)中，普雷纳姆出版社，纽约）。HA和NA蛋白两者均识别 唾液酸糖苷（sialoside)，但是具有抵消功能。因此，HA的受体结合与NA的受体破坏特 性之间的功能平衡对于有效的病毒复制而言是关键的（密劳尔（Mitnaul)等人，2000病 毒学杂志（J Virol. )74:6015-6020;瓦格纳（Wagner)等人2002医学病毒学评论〇^￥. Med.Virol.) 12:159-166)。例如，已经显示，甲型流感 / 福建/411/2002(influenza A/ Fujian/411/2002) (H3N2)在卵和MDCK细胞中的复制可以通过改变两个HA残基以增加 HA的受体结合能力或通过改变两个NA残基以降低NA的酶活性而加以改善（陆（Lu)等 人，2005病毒学杂志（J. Virol. )79:6763-6771)。此外，已经报道，HA-NA平衡与NA活 性影响HlNlpdm病毒传递性（拉克达瓦拉（Lakdawala)等人，2011PL〇S病原学（PLoS ?&七11(^.)7:61002443;延（￥611)等人，2011美国国家科学院院刊（?1'〇(3.恥七1.六〇3(1.5(^. U.S.A. ) 108:14264-14269)。来自使用多糖结合与NA活性测定的许（Xu)等人的报告显示， HA与NA活性之间的功能平衡对于产生HlNlpdm病毒而言是重要的（许等人，2012血球凝 集素与神经氨酸酶活性的功能平衡伴随2009H1N1流感大流行的出现（Functional Balance of the Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Accompanies the Emergence of the 2009 HlNlInfluenza Pandemic)，病毒学杂志（J.Virol.)86:179221-9232;刊载之前 的电子版（Epub ahead of print)2012 年 6 月 20 日 doi:10. 1128/JVI.00697-12)。
[0009] 本披露提供了改善疫苗病毒在卵中的生长的HlNl病毒的HA和NA两者中的另外 的关键性残基。确切地，本披露提供了改善病毒复制的HA球状头部中的若干酸性残基以及 NA残基。这些氨基酸取代不影响病毒抗原性并且适于疫苗的生产。在流感HA和NA多肽中 鉴定这样的氨基酸取代应有助于疫苗厂商生产对抗未来漂变的HlNlpdm样病毒的高产率 重配疫苗病毒。阅读本披露后，许多其他益处将变得清楚。
[0010] 发明概述
[0011] 本披露提供了重配流感病毒，该重配流感病毒包括编码血球凝集素多肽的第一基 因组区段，其中该血球凝集素多肽包括如示于SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4 中的氨基酸序列。
[0012] 本披露还提供了通过以下方式提高甲型流感病毒在鸡胚中的复制能力的方法：将 对应于氨基酸残基位置125、127和209 (Hl编号）的一个或多个血球凝集素氨基酸残基改 变为非天然存在的酸性氨基酸残基。
[0013] 本披露进一步提供了通过以下方式提高甲型流感病毒在鸡胚中的复制能力的方 法：将对应于氨基酸残基位置222、241和369 (NI编号）的一个或多个神经氨酸酶氨基酸残 基改变为非天然存在的氨基酸残基。
[0014] 此外，本披露提供了分离的血球凝集素多肽和分离的神经氨酸酶多肽。分离的血 球凝集素多肽可以包括如示于SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的氨基酸序 列。分离的神经氨酸酶多肽可以包括如示于SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8中 的氨基酸序列。
[0015] 附图简要说明
[0016] 图I. HlNlpdm ca病毒在卵中的不同生长。图1A.描绘了卵中的病毒滴度。简 言之，将具有来自甲型/布里斯班/10/2010 (A/Brisbane/10/2010) (Bris/10)、甲型/新 罕布什尔 /2/2010(A/New Hampshire/2/2010) (NH/10)或甲型 / 吉尔罗伊/231/2011 (A/ Gilroy/231/2011)(Gil/ll)的HA和NA基因区段的6:2 ca重配体接种进卵中并且通过FFA 确定感染性滴度。指示了由卵适应导致的HA蛋白中的氨基酸变化。数据表示三个独立实 验的平均值，用标准差条指示。检测限是3.2L 〇g1(lFFU/ml。图1B.描绘了包含指示的HA氨 基酸变化并生长于MDCK细胞中的Bris/10 ca和NH/10 ca病毒的图像。在MDCK细胞中进 行噬斑测定并且用抗甲型流感病毒的多克隆抗血清对噬斑进行免疫染色。
[0017] 图2. 125、127和209处的HA序列改变改善CA/09 ca病毒在卵中的生长。图2A.描 绘了卵中的病毒滴度。简言之，将在HA基因中具有指示的氨基酸改变的CA/09 ca重配体 接种进卵中并且通过FFA确定感染性滴度。数据表示三个独立实验的平均值，用标准差条 指示。检测限是3.21og 1(lFFU/ml。图2B.描绘了包含指示的HA氨基酸变化并生长于MDCK 细胞中的CA/09 ca变体的图像。在MDCK细胞中进行噬斑测定并且用抗甲型流感病毒的多 克隆抗血清对噬斑进行免疫染色。
[0018] 图3.NA区段对Gil/11 ca病毒在卵中的生长的影响。图3A.描绘了卵中的病毒 滴度。简言之，通过反向遗传学拯救包含具有指示的氨基酸变化的Gil/11 HA变体和来自 Gil/11或Bris/10的NA区段的6:2 ca重配体。将这些病毒接种进卵中并且通过FFA确定 感染性滴度。数据表示三个独立实验的平均值，用标准差条指示。检测限是3. 21og1(lFFU/ ml。图3B.描绘了描述于图3A中的病毒当生长于MDCK细胞中的图像。在MDCK细胞中进 行噬斑测定并且用抗甲型流感病毒的多克隆抗血清对噬斑进行免疫染色。
[0019] 图4. NA残基对Gil/11 ca病毒在卵中的生长的影响。图4A.描绘了卵中的病毒滴 度。简言之，将在HA中包含N2OT/D127E变化并且在NA中包含指示的氨基酸变化的Gil/11 ca重配体接种进卵中并且通过FFA确定感染性滴度。数据表示三个独立实验的平均值，用 标准差条指示。检测限是3.21og 1(lFFU/ml。图4B.描绘了上述Gil/11 ca变体当生长于 MDCK细胞中的图像。在MDCK细胞中进行噬斑测定并且用抗甲型流感病毒的多克隆抗血清 对噬斑进行免疫染色。
[0020] 图 5.图 5A.描绘了 6:2 ca 重配体 CA/09-D127E 和 CA/09-N12OT/D127E 在MDCK细 胞中的生长动力学。在MOI为5或0. 005时将MDCK细胞用两种病毒感染并在33°C下孵育。 在指示的时间间隔下，收集培养上清液并且通过FFA测定确定MDCK细胞中的病毒滴度。图 5B.描绘了获得自生长于MDCK细胞中的病毒的细胞裂解液或上清液的蛋白的蛋白质印迹 图像。简言之，在MOI为5时将MDCK细胞用两种病毒感染并在33°C下孵育。在感染后8hr 或16hr后收获受感染细胞的上清液和细胞裂解液，并使用抗HlNlpdm HA的多克隆抗体通 过蛋白质印迹进行分析。图5C.描绘了用MOI为0.005的两种病毒感染并在33°C下孵育的 MDCK细胞的免疫染色图像。在感染后15hr或48hr，用抗HlNlpdm HA的多克隆抗体对受感 染的细胞单层进行免疫染色。
[0021] 图6.描绘了获得自生长于MDCK细胞中的病毒的细胞裂解液或上清液的蛋白的蛋 白质印迹图像。来自受感染细胞的病毒蛋白表达与释放。在MOI为5时用包含Gil/11 NA 或Bris/10 NA的Gil/ll-N12?/D127E ca病毒感染MDCK细胞并在33°C下孵育。在感染 后8hr或16hr后收获受感染细胞的上清液和细胞裂解液，并使用抗HlNlpdm HA的多克隆 抗体通过蛋白质印迹进行分析。
[0022] 图7. HA和NA的晶体结构。图7A.描绘了 HA的晶体结构图像。鉴别了改善HlNlpdm 病毒生长的经鉴定的HA残基在HA 3D结构（仅示出了一个单体）上的位置。图7B.描绘 了 NA的晶体结构图像。鉴别了三个鉴定的NA残基在一个NA单体结构上的位置。HA结构： PDB#3LZG ;NA结构：PDB#3NSS。通过使用PyMoL软件显示图片。RBS :受体结合位点；AC :NA 活性腔。
[0023] 详细说明
[0024] 应该领会的是在此示出和描述的这些具体的实现方式是实例，并且不旨在以任何 方式以另外方式限制本申请的范围。还应该领会的是在此描述的各个实施例和特征都可以 按任何和所有方式组合。
[0025] 在此提及的这些公开的专利、专利申请、网站、公司名称、以及科学文献特此以其 全文形式通过引用而结合，达到如同每个被确切并单独地表明而通过引用结合的相同程 度。在此引用的任何参考文件与本说明书的具体传授之间的任何冲突应以有利于后者的方 式来解决。同样，在单词或短语的领域理解的定义与如在本说明书中确切传授的该单词或 短语的定义之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。
[0026] 如在此所使用的，单数形式"一个/种（a，an) "以及"该"具体地还涵盖它们所提 及的术语的复数形式，除非本内容清楚地另外指明。
[0027] 在此使用的技术术语和科学术语具有由本申请涉及的领域的普通技术人员通常 理解的含义，除非另外定义。在此参考了本领域的普通技术人员已知的不同方法和材料。 阐明重组DNA技术的一般原则的标准参考文献包括萨姆布鲁克（Sambrook)等人，"分子克 隆：实验室手册（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，"第二版，冷泉港实验室出版 社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约（1989);考夫曼（Kaufman)等人，编著， "医学生物学中的分子和细胞方法手册（Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine)，"CRC 出版社，博卡拉顿（1995);以及麦克弗森（McPherson)，编 著，"定向诱变：实用方法（Directed Mutagenesis:A Practical Approach)，"IRL 出版社， 牛津（1991)，将其中每个的披露通过引用以其全部内容结合在此。
[0028] 重配流感病毒
[0029] 通常，无论是发现于自然界中还是经由人工操纵产生的流感病毒均是由包含分段 的单链RNA基因组的内部核糖核蛋白芯和外部脂蛋白包膜（二者由基质蛋白连接）组成。 流感病毒的基因组由八个直（_)链核糖核酸（RNA)区段构成，这些区段编码免疫原性表面 血球凝集素（HA)和神经氨酸酶（NA)蛋白以及六种内芯多肽：核衣壳核蛋白（NP);基质蛋 白（M);非结构蛋白（NS);及3种RNA聚合酶（PA、PB1、PB2)蛋白。在复制过程中，基因组 病毒RNA在宿主细胞的细胞核中被转录为（+)链信使RNA和（-)链基因组cRNA。这八个 基因组区段中的每个区段都被包装为除RNA之外，还包含NP和聚合酶复合体（PB1、PB2和 PA)的核糖核蛋白复合体。
[0030] 甲型流感和乙型流感典型地与人类群体中的流感爆发相关。然而，甲型流感同样 也感染其他物种，例如鸟、猪以及其他动物。根据在其血球凝集素和神经氨酸酶表面糖蛋白 抗原内的差异，将甲型病毒分类为亚型。甲型病毒中的血球凝集素具有16种已知的亚型并 且神经氨酸酶具有9种已知的亚型。在人类中，当前仅仅已知约4种不同的血球凝集素和 2种不同的神经氨酸酶亚型，例如111、112、113、册、附以及吧。具体而言，两种主要的甲型流 感亚型在人类中具有活性，即HlNl和H3N2。然而，H1N2近来已经令人担忧。未将乙型流感 病毒根据其血球凝集素和神经氨酸酶蛋白划分为亚型。
[0031] 重配流感典型地是一种包括具有超过一种亲本病毒株或来源的遗传和/或多肽 组分的病毒。例如，7:1重配流感病毒包括7个来源于第一亲本病毒的病毒基因组区段（或 基因区段）以及例如对在此描述的血球凝集素或神经氨酸酶进行编码的单个互补的病毒 基因组区段。6:2重配体包括6个来自第一亲本病毒的基因组区段（最常见地6个基因组 区段）以及两个来自一种或多种不同亲本病毒的互补区段（例如，血球凝集素和神经氨酸 酶基因组区段）。如果6:2重配体包括6个来源于第一亲本病毒的病毒基因组区段（即， 6个内部基因组区段）以及来自超过一种不同亲本病毒的血球凝集素和神经氨酸酶基因组 区段，则可以将它称为6:1:1重配病毒。取决于在此的背景，也可以将重配病毒叫做"嵌合 的"。
[0032] 如果重配流感病毒是一种重组流感病毒，则它可以已经通过人为干涉人工地或合 成地（非天然地）改变，例如经由基因克隆操纵和反向遗传学。当流感病毒通过重组核酸 的表达而产生时，它可以是重组体。
[0033] 重配流感病毒可以具有编码血球凝集素多肽的基因组区段，该血球凝集素多肽包 括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。如果该基因组区段对包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的血 球凝集素多肽进行编码，则它在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸，或在氨基酸残 基位置127处可以具有谷氨酸残基，或在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基 酸残基位置125处可以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸，或在 氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸， 或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨 酸，或在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨 酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸。
[0034] 重配流感病毒可以具有编码血球凝集素多肽的基因组区段，该血球凝集素多肽包 括SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。如果该基因组区段对包括SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的血 球凝集素多肽进行编码，则它在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸，或在氨基酸残基 位置125处可以具有天冬氨酸，或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残 基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸并且在氨基酸 残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸并且在氨 基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在 氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸、在氨 基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在 氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且 在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸。
[0035] 重配流感病毒可以具有编码血球凝集素多肽的基因组区段，该血球凝集素多肽包 括SEQ ID N0:4的氨基酸序列。如果该基因组区段对包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的血 球凝集素多肽进行编码，则它在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸，或在氨基酸残 基位置127处可以具有谷氨酸残基，或在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基 酸残基位置125处可以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸，或在 氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸， 或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨 酸，或在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨 酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸。
[0036] 如果该重配流感病毒具有对包括SEQIDNO: 1的氨基酸序列的血球凝集素多肽进 行编码的基因组区段，则它可以是7:1重配流感病毒、6:1:1重配流感病毒或6:2重配流感 病毒。如果它是6:2重配流感病毒，则该重配流感病毒可以进一步具有对包括SEQIDN0:5 的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽进行编码的基因组区段。
[0037] 如果该重配流感病毒具有对包括SEQIDN0:3的氨基酸序列的血球凝集素多肽进 行编码的基因组区段，则它可以是7:1重配流感病毒、6:1:1重配流感病毒或6:2重配流感 病毒。如果它是6:2重配流感病毒，则该重配流感病毒可以进一步具有对包括SEQIDN0:6 的氨基酸序列的神经氨酸酶进行编码的基因组区段。如果该重配流感病毒具有对包括SEQ IDN0:3的氨基酸序列的血球凝集素多肽进行编码的基因组区段和对包括SEQIDN0:6的 氨基酸序列的神经氨酸酶多肽进行编码的基因组区段，则SEQIDN0:3的氨基酸序列可以 在氨基酸残基位置124处具有亮氨酸并且在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸，或可以在 氨基酸残基位置127处具有谷氨酸残基并且在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸，或可以 在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸。
[0038] 如果该重配流感病毒具有对包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的血球凝集素多肽进 行编码的基因组区段，则它可以是7:1重配流感病毒、6:1:1重配流感病毒或6:2重配流感 病毒。如果它是6:2重配流感病毒，则该重配流感病毒可以进一步具有对包括SEQ ID N0:8 的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽进行编码的基因组区段。如果该基因组区段对包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽进行编码，则氨基酸残基位置222可以是天冬酰胺， 或氨基酸残基位置241可以是缬氨酸，或氨基酸残基位置369可以是天冬酰胺，或氨基酸残 基位置222可以是天冬酰胺并且氨基酸残基位置369可以是天冬