%的I型和III型胶原，与天然骨的有机成分非常类似。本发明方法通过在SIS材料上种植并培养MC3T3-E1 Subclone 14细胞作为成骨细胞系细胞，通过诱导使种子细胞在SIS材料上进行原位矿物化和成骨分化，采用特殊的培养方式促进成骨细胞分泌大量的矿物化结晶及细胞外基质成分到SIS骨架材料上，最终可在SIS骨架材料上形成高度类似于天然骨的复合材料，制备得到的细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨具有较高的机械强度，该组织工程骨与天然骨内部的矿物化结构和分布极为接近，具有高度类似于天然骨的微观结构。
[0013]本发明方法中，在使用植入人体体内之前已进行去细胞化，可以避免细胞植入引起的人体免疫排斥等安全问题，同时保留的细胞外基质成分不仅可以提供类似于体内的微环境，而且大量成骨细胞分化过程中释放的各种细胞因子可以促进体内的骨再生。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明公开的细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨，具有较高的机械强度，在干、湿状态下的弹性模量分别可达350MPa、lOOMPa，在植入体内初期能够提供较好的组织支撑，该组织工程骨与天然骨内部的矿物化结构和分布极为接近，具有高度类似于天然骨的微观结构，利于植入后更好地被识别和加速骨再生；本发明公开的细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨的制备方法，是一种新型的组合诱导成骨细胞分化及矿物化方法，通过钙离子和淫羊藿苷组合培养液刺激SIS上的成骨细胞，在SIS材料上进行大量的原位矿物化和成骨分化，同时可以避免钙离子对于分化后期重要基质蛋白OCN的抑制，增强工程骨的成骨诱导性，最终实现SIS材料上大量羟基磷灰石结晶和类骨细胞外基质沉积，且机械强度较SIS本身有大幅提高。
【附图说明】
[0015]图1为实施例中裁剪后的SIS材料的外观图；
图2为实施例中制备得到的复合工程骨的外观图；
图3为原始SIS材料与复合工程骨在干、湿两种状态下的弹性模量测试结果；
图4为原始SIS材料的微观结构示意图；
图5为植有细胞的SIS材料的微观结构示意图；
图6为去细胞化前的SIS复合工程骨的微观结构示意图；
图7为实施例中制备得到的复合工程骨的微观结构示意图；
图8为SIS原始材料与复合工程骨上的种植细胞的成骨分化标志基因ALP、BSP、OCN的mRNA相对表达量的对比结果；
图9为复合工程骨的扫描电镜照片； 图10为小鼠头盖骨的扫描电镜照片；
图11为复合工程骨的X射线衍射结果；
图12为小鼠头盖骨的X射线衍射结果；
图13为应用实例中无植入物的空白对照骨的HE染色结果；
图14为应用实例中复合工程骨的HE染色结果；
图15为应用实例中无植入物的空白对照骨的MTS染色结果；
图16为应用实例中复合工程骨的MTS染色结果。
【具体实施方式】
[0016]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0017]实施例的细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨的制备方法，包括以下步骤:
1)细胞培养及传代:准备含有10%胎牛血清的a-MEM培养基作为培养液；将从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-E1 Subclone 14细胞(可从中科院或ATCC购置)置于5% 二氧化碳浓度、37°C的细胞培养箱中培养，培养液的用量为200 μ L/cm2,每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，确保培养液的用量为200 μ L/cm2,当培养至MC3T3-E1Subclone 14细胞汇合度大于90%时进行细胞传代，细胞传代的过程为:弃去旧的培养液，加入用量为200 μ L/cm2的PBS缓冲液，清洗2_3次；然后加入用量为40-50 μ L/cm2的0.25%的胰酶，在37°C下孵育I min ;收集细胞并加入至离心管，在1000 rpm转速下离心2 min ；弃去上清，然后加入I mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液以(1-2) X 14细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养瓶，然后在该细胞培养瓶中加入5 mL的培养液混匀，置于细胞培养箱中培养；重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3-E1 Subclone 14细胞；
2)SIS仿生工程骨的制备:取出干燥无菌的SIS材料，用剪刀或合适器械裁剪成所需的大小及形状(2X5 cm2)，再将裁剪好的SIS材料浸泡于培养液，置于37°C的细胞培养箱中预处理24-48h ;取汇合度为70-80%的MC3T3-E1 Subclone 14细胞，加入至离心管，在1000rpm转速下离心2 min，弃去上清，再加入I mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度，然后根据计算得到的细胞密度将该细胞悬液稀释至I X 16细胞/mL的终浓度，即配制得到细胞悬液；取出浸泡24-48h的SIS材料(其外观图见图1，微观结构示意图见图4)，平铺于新的细胞培养皿上，再按5 X 13细胞/mm2的细胞密度将配制得到的稀释的细胞悬液均匀滴加于SIS材料上，完成对SIS材料的细胞种植，然后立即放入细胞培养箱中孵育；孵育4h后，取出植有细胞的SIS材料(其微观结构示意图见图5)，用l-2mL/cm2用量的培养液清洗2_3次，除去表面未黏附的细胞，之后以2.5mL/cm2的用量加入新的培养液，最后将该植有细胞的SIS材料置于细胞培养箱孵育；
3)复合工程骨的制备:植有细胞的SIS材料于细胞培养箱孵育16h后，得到细胞-SIS复合材料，从细胞培养箱中取出该细胞-SIS复合材料，弃去旧的培养液，加入等量诱导矿物化及成骨分化的组合培养液，组合培养液为含有1mM的CaCl2、I X 10_5 M的淫羊藿苷和10%胎牛血清的a -MEM培养基，然后置于37°C的细胞培养箱孵育，此后每隔48h更换一次组合培养液，处理4周时间后，得到SIS复合工程骨(其微观结构示意图见图6);
4)复合工程骨的去细胞化:取出上述处理得到的SIS复合工程骨，以用量为(1-2)mL/cm2的PBS缓冲液清洗2-3次；此后将该SIS复合工程骨置于_80°C /37°C反复冻融3_5次，每次I h ;之后再次以用量为(l_2)mL/cm2的PBS缓冲液清洗2_3次，进行去细胞化；将去细胞化后的复合工程骨置于_80°C保存备用，此即为细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨，其外观图见图2，微观结构示意图见图7，该复合工程骨的微观结构包括SIS胶原纤维骨架1、矿物化结晶3和细胞外基质成分4，SIS胶原纤维骨架I呈网状纤维结构，矿物化结晶3和细胞外基质成分4交错并间隔沉积于SIS胶原纤维骨架I上，矿物化结晶3和细胞外基质成分4由MC3T3-E1 Subclone 14细胞分泌得到，矿物化结晶3主要由羟基磷灰石结晶构成。经测定，该复合工程骨中的矿物化结晶的沉积量为68.50±6.75 mg/cm3。
[0018]图4-图7中，I为SIS胶原纤维骨架，2为MC3T3-E1 Subclone 14细胞，3为矿物化结晶，4为细胞外基质成分。
[0019]对制备得到的复合工程骨，测试其在干、湿两种状态下的弹性模量，作为对比，同样测试了原始SIS材料的弹性模量，测试结果见图3。从图3可见，本发明复合工程骨在干、湿状态下的弹性模量分别为350MPa、10MPa,相对于原始SIS材料在干、湿状态下的弹性模量100MPa、20MPa，本发明复合工