包含修饰的抗原的生物缀合物及其用图
【专利说明】包含修饰的抗原的生物缀合物及其用途
[0001] 本申请要求于2012年9月10日提交的美国临时专利申请号61/698,843的优先 权，将其公开内容以其整体通过引用结合于此。
[0002] 1?引言
[0003] 本文提供了一种大肠杆菌（Escherichia coli)的修饰的抗原，来自大肠杆菌 (E. coli)血清型0121的0抗原。本文还提供了所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的用途， 如所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原在治疗和/或预防疾病中的用途，例如，治疗和/或预 防由肠道沙门氏菌（Salmonella enterica)引起的疾病，包括由伤寒沙门氏菌（S.typhi) 引起的疾病。 2.【背景技术】
[0004] 伤寒症仍然是一种严重的公众健康问题，其每年发生2200-3300万病例，包括约 216, 000-500, 000 例死亡[Crump, J. A.，Luby，S. P.，Mintz，E. D. : The global burden of typhoid fever (伤寒热的全球负担）? Bull World Health 0rgan82 (5) ,346-353 (2004)]。 这种人类全身感染的病原体伤寒沙门氏菌（S.typhi)是通过污染的水和食物经口 (feco-orally)传播的。因此，伤寒症是卫生条件仍然较差的较不发达地区中的地方 性疾病。包括亚洲、非洲和南美洲在内的许多国家的学生和年轻人最经常受到影响 [Bhan，M.K.，Bahl，R.，Bhatnagar，S.:Typhoid and paratyphoid fever(伤寒症和副伤 寒）.Lancet366 (9487)，749-762 (2005)]。伤寒热的抗微生物治疗通过出现伤寒沙门氏菌 的多药抗性菌株而日渐变得复杂[Mirza, S. H.，Beeching, N. J.，Hart, C. A. :Multi_drug resistant typhoid:a global problem(多药抗性伤寒：全球问题）? J Med Microbiol 44(5)，317-319(1996)]。
[0005] 高危险人群的疫苗接种被认为是用于控制和预防伤寒症的最有前景策略。目 前，有两种被许可的伤寒疫苗：经口施用的、全细胞减毒活疫苗Ty21a和纯化的Vi多 糖肠胃外疫苗。Ty21a疫苗具有多种缺点：（i)有助于这种伤寒沙门氏菌菌株的减毒 表型的突变未被充分定义[Hone, D. M.，Attridge, S. R.，Forrest, B.，Morona, R.，Dan iels, D. , LaBrooy, J. T. , Bartholomeusz, R. C. , Shearman, D. J. , Hackett, J. :A galE via (Vi antigen-negative)mutant of Salmonella typhi Ty2retains virulence in humans (伤寒沙门氏菌Ty2的galE via(Vi抗原阴性）突变体在人中保持病毒性）.Infect Immun 56(5)，1326-1333(1988)]，（ii)减毒菌株理论上可以恢复为病毒性，和（iii) Ty21a是仅适度免疫原性的并且每5年需要三至四个初始剂量和加强剂量[Levine，M. M. , Ferreccio, C. , Black, R. E. , Germanier, R. :Large-scale field trial of Ty21a live oral typhoid vaccine in enteric-coated capsule formulation (肠包衣的胶囊制齐Ij中 的Ty21a活性伤寒疫苗的大规模现场试验）.Lancet 1 (8541)，1049-1052 (1987) ;Black, R. E. , Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Clements, M. L. , Lanata, C. , Rooney, J. , Germanier, R. :Ef ficacy of one or two doses of Ty21a Salmonella typhi vaccine in enteric-coated capsules in a controlled field trial (肠包衣胶囊中一个或两个剂量的Ty21a伤 寒沙门氏菌疫苗在受控现场试验中的效力）? Chilean Typhoid Committee. Vaccine 8(1), 81-84 (1990) ；Murphy, J. R. , Grez, L. , Schlesinger, L. , Ferreccio, C. , Baqar, S. , M unoz, C. , ffasserman, S. S. , Losonsky, G. , Olson, J. G. , Levine, M. M. : Immunogenicity of Salmonella typhi Ty21a vaccine for young children (伤寒沙门氏菌疫苗对于年轻幼 儿的免疫原性）? Infect Immun 59 (11), 4291-4293 (1991) ；Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Cr yz, S. , Ortiz, E. !Comparison of enteric-coated capsules and liquid formulation of Ty21a typhoid vaccine in randomised controlled field trial (Ty21a伤寒疫苗的肠包 衣胶囊和液体制剂在随机化受控现场试验中的比较）.Lancet 336(8720)，891-894(1990); Levine, M. M. , Ferreccio, C. , Abrego, P. , Martin, 0. S. , Ortiz, E. , Cryz, S. !Duration of efficacy of Ty21a, attenuated Salmonella typhi live oral vaccine(Ty21a 减毒 的伤寒沙门氏菌活口服疫苗的效力的持续时间）.Vaccine 17Suppl 2, S22-27(1999)]。 Vi多糖疫苗的有用性受其年龄相关的免疫原性和针对多糖的免疫应答是T细胞无关 这一事实所限制。因此，不能建立免疫记忆并且再接种疫苗不会引起任何加强应答 [ffeintraub, A. : Immunology of bacterial polysaccharide antigens (细菌多糖抗原的 免疫学）? Carbohydr Res 338 (23) ,2539-2547 (2003)，Landy，M. : Studies on Vi antigen. VI. Immunization of human beings with purified Vi antigen(人类用纯化的Vi 抗原免 疫）.Am J Hyg 60 (I) ,52-62 (1954)]。由于这些缺陷，所以期望用良好定义的、良好耐受的 且高度免疫原性的疫苗替代当前的伤寒疫苗。
[0006] 多糖疫苗的缺点可以通过将糖缀合至蛋白质载体（缀合物疫苗）而克服。在 缀合后，多糖的行为类似于T细胞依赖性抗原。已证实，共价连接至重组绿脓假单胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)外毒素A (EPA)的纯化的Vi多糖在幼儿中诱发针对 伤寒沙门氏菌的保护性免疫应答[3211，3.(1，1&7101'，0.11，1'1'0€&，六.(1，01611161^8，]\ D. , Shiloach, J. , Sadoff, J. C. , Bryla, D. A. , Robbins, J. B. !Laboratory and preliminary clinical characterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines (Vi荚膜多糖-蛋白质缀合物疫苗的实验室和初步临床表征）.Infect Immun 62 (10), 4440-4444 (1994) ；Lin, F. Y. , Ho, V. A. , Khiem, H. B. , Trach, D. D. , Bay, P. V. , Thanh, T. C. , Kossaczka, Z. , Bryla, D. A. , Shiloach, J. , Robbins, J. B. , Schneerson, R. , Szu, S. C. :The efficacy of a Salmonella typhi Vi conjugate vaccine in tw〇-t〇-five_year-〇ld children (伤寒沙门氏菌Vi缀合物疫苗在二至五岁儿 童中的效力）.N Engl J Med 344(17)，1263-1269(2001)]。然而，缀合物疫苗的生产是一 个复杂的多步骤过程。首先，必须培育产生重组蛋白质载体和多糖抗原的分离的细菌菌株。 多糖和蛋白质载体在该两种组分进行化学偶合之前必须通过不同的程序纯化。最后的步骤 涉及用于获得最终产物的额外纯化步骤。该费力的生产过程具有以下缺点：（i)需要多个 纯化步骤，其中可能出现相当大的损失和（ii)由于化学偶合的随机性，所以产物不是均一 结构而是不同糖缀合物的混合物，具有潜在的不同效力分布曲线。
[0007] 因此，仍然需要对感染了肠道沙门氏菌，包括伤寒沙门氏菌的受试者进行治疗和 预防的改进方法。
[0008] 3?概述
[0009] 在一个方面，本文提供了包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀 合物。
[0010] 在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的修饰的大肠杆菌0121 0-抗原共价 结合至载体蛋白的糖基化位点内的天冬酰胺残基（Asn)，其中所述糖基化位点包含氨基酸 序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。在某些实施 方式中，本文提供的生物缀合物的载体蛋白不是天然地（例如，在其正常/天然的或"野生 型"状态）包含糖基化位点。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的载体蛋白被改造 成包含一个或多个糖基化位点，例如，所述载体蛋白被改造成包含一个或多个糖基化位点， 该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的 任何氨基酸。例如，根据本文描述的方法使用的载体蛋白可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 个或更多个糖基化位点，每一个糖基化位点具有氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其 中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸；并且其中一些（例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9个） 或全部糖基化位点已被重组地引入到所述载体蛋白中。
[0011] 适合用于本文描述的方法（例如，治疗和/或预防伤寒沙门氏菌感染）中的任何 载体蛋白可以在本文描述的生物缀合物的生产中使用。示例性载体蛋白包括，但不限于，铜 绿假单胞菌（P. aeruginosa)的外毒素 A (EPA)、CRM197、白喉类毒素（Diphtheria toxoid)、 破伤风类毒素（tetanus toxoid)、金黄色葡萄球菌（S. aureus)的解毒溶血素A、聚集因子 (clumping factor)A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素 (E.coli heat labile enterotoxin)、大肠杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素B亚基 (Cholera toxin B subunit) (CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大 肠杆菌sat蛋白的效应结构域、空肠弯曲杆菌AcrA(C. jejuni AcrA)和空肠弯曲杆菌天然 糖蛋白。
[0012] 在一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0013] - 4)- a -D-GalNAcA-(1 - 4)- a -D-GalNAcA-(1 -
[0014] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0015]
[0016] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0017]
[0018] 在另一种【具体实施方式】中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌0121 0-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌0121 0-抗原包含：
[0019]
[0020]在另一个方面，本文提供了能够生产本文描述的生物缀合物的原核宿主细胞。在 一种【具体实施方式】中，本文提供了一种可用于产生生物缀合物的原核宿主细胞，其中所述 原核宿主细胞包含：（i)编码载体蛋白的异源核苷酸序列，所述载体蛋白包含至少一个糖 基化位点，该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu - X - Asn - Z - Ser/Thr，其中X和Z可以 是除Pro之外的任何天然氨基酸；和（ii)编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列；其中所述 原核宿主细胞被重组地改造成生产Und-PP-修饰的大肠杆菌0121 0-抗原（即，本文描述 的任一个修饰的大肠杆菌0121 0-抗原），其中所述寡糖基转移酶将修饰的大肠杆菌0121 〇-抗原转移至所述糖基化位点的Asn。在一种【具体实施方式】中，本文描述的原核宿主细胞 是大肠杆菌宿主细胞。在另一种【具体实施方式】中，本文描述的原核宿主细胞是大肠杆菌菌 株K12宿主细胞。在另一种【具体实施方式】中，重组地引入到本文描述的宿主细胞，例如，大 肠杆菌宿主细胞中的寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的PglB。
[0021] 在某些实施方式中，除了异源寡糖基转移酶之外，本文描述的宿主细胞包含异源 核酸序列（即，不是与宿主细胞在其自然/天然状态，例如，在其"野生型"状态正常相关联 的核酸序列，例如，基因）。这样的额外的异源核酸序列可以包含编码已知是属于糖基化操 纵子，例如，原核糖基化操纵子的基因的核酸。在具体的实施方式中，这样的额外异源核酸 序列包含属于空肠弯曲杆菌的Pgl簇的基因，或包含空肠弯曲杆菌的全部Pgl簇。
[0022] 在某些实施方式中，本文描述的宿主细胞包含一个或多个基因缺失和/或一个或 多个基因失活，即，宿主细胞的遗传背景已经以使得与宿主细胞正常相关的基因（例如，一 个或多个"野生型"基因）失活或功能失常，或者将该基因全部去除的方式进行修饰。在一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因中的突变或该wbqG基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqC基因中的突变或该wbqC基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqE基因中的突变或该wbqE基因的缺失。在另一 种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细 胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqC基因中的突变或该wbqG基因和 wbqC基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿 主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqE基因中 的突变或该wbqG基因和wbqE基因的缺失。在另一种【具体实施方式】中，在本文描述的生物 缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在 wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因中的突变或该wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因的缺失。
[0023] 在某些实施方式中，大肠杆菌的0121基因簇（例如，大肠杆菌0121参照菌株CCUG 11422 的 0121 基因簇；在 Fratamico 等，2003, J. Clin. Microbiol. 41 (7) :3379-3383 中描 述的0121基因簇）被引入（例如，重组地引入）到本文描述的宿主细胞中。在某些实施方 式中，0121基因簇被引入到不产生任何O抗原的宿主细胞中，例如，所述宿主细胞已以使其 不产生任何0抗原的方式