148,2012 年 11 月，登录号 P13726)，小鼠 TF(UniProtKB/Swiss-Prot. Version 103, 2012 年 11 月，登录号 P20352)，牛 TF (UniProtKB/Swiss-Prot. Version 89, 2012 年 11 月，登录号 P30931)，兔 TF (UniProtKB/ Swiss-Prot. Version 90, 2012年11月，登录号P24055)以及不同动物的TF蛋白。
[0062] SwissProt登录号P13726的人TF蛋白有定义明确的结构域结构，包括：⑴信 号肽或有32个氨基酸前导序列的区域，前导序列从未成熟状态经翻译后加工为成熟状态； (2)含219个氨基酸的N-糖基化的亲水性胞外结构域；（3) 23个氨基酸的高度疏水片段，该 片段形成跨膜结构域；和（4) 21个氨基酸羧基端，该区域为蛋白胞质片段。
[0063] 在具体实施方案中，TF对应于成熟TF。
[0064] 本文使用的术语"成熟TF"指的是氨基酸序列缺少信号肽的TF蛋白。在一个实施 方案中，所述成熟TF蛋白为SEQ ID NO: 1的成熟人TF。
[0065] 在一个实施方案中，TF是糖基化的。
[0066] 本文使用的术语"糖基化的"包括任何程度的糖基化。由于天然的TF含有一些糖 基化位点，如下面详细解释的，表述"组织因子"也包含显示不同糖基化程度的那些蛋白质 形式，所述形式通过在可以发生N-糖基化反应的宿主中表达TF来获得。
[0067] 此外，术语"组织因子"也包括在天然FT序列中一个或多个氨基酸残基的插入、缺 失或取代所产生的那些变体。可以用于评估给定的多肽是否是TF功能性变体的适合的功 能实验是基于TF变体特异性结合FVIIa的能力或基于体外测定血浆或全血中凝结时间的 那些实验，通过严重出血的动物模型的体内实验，或通过致死性出血的动物模型的体内实 验。现有技术已经公开了实施这些实验的方法。
[0068] 根据本发明的此类变体包括与以上提到的天然TF分子至少60 %、70 %、80 %、 90%、95%或96%相同的氨基酸序列。本领域已知，两种蛋白之间的"同一性"通过将一种 蛋白的氨基酸序列和它的保守氨基酸取代与第二种蛋白的序列进行比较来确定。使用本领 域技术人员公知的计算机算法和方法确定两种蛋白之间的同一性程度。两个氨基酸序列之 间的同一性优选地通过利用BLASTP算法确定。
[0069] TF可以是完全糖基化、部分糖基化或非糖基化的。
[0070] 本申请中"完全糖基化的"指全部可能的糖基化位点已被糖基化。
[0071] 本申请中"部分糖基化的"指的是三个N-糖基化位点中至少一个是无功能的，该 位点不能被糖基化。
[0072] 本申请中"非糖基化的"指的是没有一个N-糖基化位点是功能性的，或可选地，TF 多肽在体外通过非糖基化的方法（即，无细胞表达系统）表达，或在失去糖基化代谢途径的 载体（即，大肠杆菌）中表达。
[0073] 在一个实施方案中，TF为部分糖基化或非糖基化的。在这一实施方案中，TF被修 饰，使得N-糖基化位点中至少一个是无功能的，该位点不能被糖基化。
[0074] 所有成熟的TF蛋白包括三个可能的N-连接糖基化位点，所述位点具有 Asn-Xaa-Ser/Thr的共有序列。以人成熟TF为例，这三个糖基化位点位于Asn 11 (序 列 Asnll-Leul2-Thrl3)、Asnl24(序列 Asnl24-Vall25-Thrl26)以及 Asnl37(序列 Asnl37-Asnl38-Thrl39)，所述位置相对于 SEQ ID NO: 1 而言。
[0075] 在一个实施方案中，人成熟TF蛋白中可以被修饰而变为无功能的N-糖基化位点 是对应于上文序列SEQ ID NO: 1的成熟人TF的第11-13位NLT、第124-126位NVT以及第 137-139位NNT的N-糖基化位点。
[0076] 在另一个实施方案中，TF携带一个或多个将Asn残基替换为非N-糖基化受体的取 代。在一个更优选实施方案中，TF变体包括对应于成熟人TF的第11、124或137位的位置 处的Asn残基的一个或多个Asn至Ala突变。优选地，成熟人TF在SEQ ID NO: 1的第124 位携带Asn至Ala的突变。
[0077] 糖基化将根据用于产生TF的表达系统变化。例如，组织因子蛋白可包括一种或多 种植物特异多糖、酵母特异多糖、昆虫特异多糖或动物特异多糖。
[0078] 当TF在酵母中产生时，糖基化通常涉及约10个甘露糖残基的内部核心（该内部 核心通过两个GIcNAc残基与天冬酰胺相连）以及50-100个甘露糖残基的分支外链。因此， N-连接的糖基化可能向TF添加多达300个甘露糖残基，使分子量增加约60kDa。此外，一 些甘露糖残基可能与不同的O-连接糖基化位点（多于25)相连。因此，包含于本发明组合 物中的TF分子具有一个或多个N-糖基化位点中N-连接的糖基化的可变的程度和组成。
[0079] 在另一个实施方案中，TF蛋白是融合蛋白，所述融合蛋白包括含有TF蛋白的第一 部分以及含有另一肽或蛋白的第二部分。
[0080] 所述第二部分可以与所述TF蛋白片段第一部分的N端结合，或可选地，所述第二 部分可以与所述TF蛋白片段的C端区域结合。第一以及第二组分可以直接结合或通过在 所述第一以及第二区域之间的连接多肽结合。
[0081] 在另一个实施方案中，所述第二部分是标签。标签可以与TF蛋白第一部分的C 端或N端结构域结合。在本发明中，术语"标签"应被理解为与所述TF蛋白C端或N端结 构域结合的任意肽或氨基酸序列，该序列可以用于融合蛋白的分离或纯化。因此，所述标 签能够结合一个或多个配体，例如亲和基质的一个或多个配体（例如高亲和力的色谱分析 载体或珠子）。所述标签的实例为组氨酸标签（His标签或HT)，例如含6个组氨酸残基的 标签（His6或H6)，该标签能以高亲和力结合镍柱（Ni 2+)或钴柱（Co2+)。用于分离或纯化 融合蛋白的标签的其它示例性、非限制性的实例包括：Arg标签、FLAG标签、Strep标签、 可被抗体识别的表位，例如c-myc标签（被抗c-myc抗体识别）、SBP标签、S标签、1?调蛋 白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S转移酶标签、麦芽糖结合蛋 白、NusA、TrxA、DsbA、Avi 标签等，氨基酸序列，例如 Ala-His-Gly-His-Arg-Pro (SEQ ID NO:2), Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ ID NO:3), Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys(SEQ ID Ν0:4) ;β-半乳糖苷酶等。
[0082] 之前已公开，用于重组TF的分离或纯化的His标签具有理想的特征，其能在使大 多数蛋白变性并破坏大多数蛋白-蛋白相互作用的条件下与它的配体结合。因此，在破坏 目的蛋白参与的蛋白-蛋白相互作用之后，它可以被用于移除标记有Η6的目的蛋白。
[0083] 因此，在一个实施方案中，标签为His标签。在另一个实施方案中，His标签与TF 蛋白第一部分的C端结构域结合。在另一个实施方案中，His标签与TF蛋白第一部分的N 端结构域结合。
[0084] 在另一个实施方案中，融合蛋白的第一部分包括成熟的TF蛋白，优选地，包括成 熟人TF蛋白。在另一个实施方案中，第一部分为人成熟TF。
[0085] 在另一实施方案中，融合蛋白具有第一部分和第二部分，第一部分包括至少一个 N-糖基化位点无功能的成熟人组织因子蛋白，第二部分包括His标签。在优选的实施方案 中，组织因子为包括SEQ ID Ν0:5的人TF的融合蛋白，其（a)缺少信号序列，（b)在糖基化 位点有N124A突变，和（c)在C端有六个组氨酸的标签。
[0086] 所述融合蛋白可以通过常规手段获得，例如，通过在合适的酵母细胞中对编码所 述融合蛋白的核苷酸序列的基因表达。如果需要，可以使用最终的标签进行融合蛋白的分 离或纯化。
[0087] 本文使用的术语"脂化的组织因子（TF) "指的是TF完全或部分插入脂质囊泡或 细胞膜的任意TF来源。"脂化的TF"来源的示例性、非限制性的实例为：1)含有脂化的TF 的组织提取物（其分离可以从一些组织来实施，例如脑、胎盘以及肺组织，从来自不同动物 的组织来实施，例如羊、牛、兔、狗以及人等）；2)纯化的以及（再）脂化的TF蛋白质组分， 即，TF纯化后加入脂质组分（磷脂）；和3)含脂化的TF的细胞提取物，其中脂质部分来自 宿主细胞，并且TF为重组表达的。
[0088] 作为示例性、非限制性的实例，纯化的以及（再）脂化的TF可以通过根据 Mimms L.T. et al.，"Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside"，Biochemistry, 1981，vol. 20(4)，p. 833-840 描 述的方案来制备。在所述方案中，利用非离子型洗涤剂（例如N-辛基-β-D-半乳吡喃糖 苷），将非脂化的TF并入磷脂囊泡内。可被用于根据本发明的脂化的TF的磷脂可以有任 意来源（动物、植物或合成的）。几乎任何磷脂都可以用于制备本文所述的脂化TF。可用 于制备脂化TF的磷脂的示例性、非限制性的实例包括磷脂酰胆碱、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰 乙醇胺等。TF蛋白质组分：磷脂的比例（摩尔、重量或体积）可在大范围内变化，例如约 1:50000~约1:3000。在具体实施方案中，脂化的TF是脂化的人TF，由分离自人组织或重 组细胞的TF的蛋白质组分组成，并且以合适的TF蛋白质组分：磷脂的比例插入到脂膜。为 达到最佳的TF活性，脂质组分（优选磷脂酰胆碱以及磷酯酰丝氨酸）的优选的摩尔比在本 领域是已知的。
[0089] 关于制备含脂化TF的细胞提取物，其中脂质部分来自宿主细胞且TF为重组表达 的，由于TF分子包含很大的疏水结构域，可以合理地假定在任意可用的真核表达系统中克 隆rTF基因将导致表达或重组TF (rTF)与宿主细胞的脂膜相联。在这种相联中，可能的是， 宿主膜组分可以模拟或向rTF分子提供与TF正常相联的哺乳动物细胞中存在的相似或相 同的支架。因此，这些膜组分的纯化将产生脂化的rTF的可用来源。由于它的化学构成，这 些分离的脂膜组分主要以不同尺寸的囊泡的形式存在。除了 rTF，那些囊泡也包括具体的蛋 白或脂质，这取决于宿主细胞来源。因此，来自酵母、细菌、不同来源的细胞（例如昆虫、哺 乳动物、植物、鱼、藻类）的脂膜会含有此类宿主细胞的蛋白质以及脂质特征。
[0090] TF包括锚定于脂膜的疏水区域（跨膜结构域），其亲水性区域（即，所述TF蛋白 的氨基端区域以及羧基端区域）朝向膜的质膜外侧。
[0091] 在本发明中，术语"脂膜"应被理解为形成细胞边界（即细胞膜或质膜）或胞内细 胞器边界的数个分子（脂质和蛋白质）厚的有组织的层。通常，膜包括两层定向的脂质层， 蛋白可以嵌入其中。脂双层是细胞膜的基本结构，通常在水性环境下由两亲分子（例如磷 月旨、脂肪酸等）形成，每一分子的定向亲水基团位于层的外侧，疏水基团朝向层的内部。优 选地，TF锚定于脂质微泡。
[0092] 本发明中，"脂质微泡"应被理解为小的以及闭合的室，其基本上由脂单层或脂双 层组成。本发明中携带TF的微泡的尺寸可以在相对大的范围内变化，通常，所述尺寸等于 或低于10 μ m，典型地等于或小于0. 5 μ m。在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来 源微泡的尺寸的范围为10-0. 01 μπι。微泡由真核细胞的脂膜或其片段形成。在一个实施方 案中，微泡可以富集带负电的磷脂，优选磷脂酰丝氨酸。用于富集这种磷脂酰丝氨酸的微泡 的方法公开于例如W02011/131658中。简要地，所述富集磷脂的携带TF的微泡可以通过下 列方法制备，该方法包括：a)在允许表达TF蛋白或其具有促凝活性片段的条件下，将表达 TF