160] 式I和式II化合物的化学制备在以下实施例中和通过以下非限制性例举性合成 路线来描述。
[0161]
[0162] 在以上反应路线中，R和f可以非限制性地是例如独立地选自由H，Me或烷基组 成的组。
[0163] 落入权利要求范围内的化合物可以通过下列例举性反应制备。
[0164]
[0165] 本领域技术人员将能够改动本文描述的合成方法，联合或不联合本文所述的分离 技术来制备式I和式II的化合物。
[0166] 在一些实施方案中，以上式I或式II的化合物可以用于系统治疗至少一种选自以 下组成的组的适应证：前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，脱发，痤疮，多毛症，卵巢囊 月中，多囊卵巢病，性早熟，和年龄相关的黄斑变性。在一些实施方案中，式I或式II的化合 物可以用于制备用于系统治疗本文所述适应证的药物或组合物。在一些实施方案中，还提 供了系统治疗任一本文所述适应证的方法。
[0167] 本文所述的化合物可以是游离形式或其盐的形式。在一些实施方案中，本文所述 的化合物可以是药用盐形式，其在本领域中是已知的（Berge等，J. Pharm. Sci.(药物科学 杂志）1977, 66, 1)。本文所用的药用盐包括例如具有母体化合物所需药理学活性的盐（保 留母体化合物的生物效力和/或性质并且在生物学上和/或其它方面不是不合需要的盐）。 具有一个或多个能够成盐的官能团的本文所述的化合物可以例如形成药用盐。含有一个或 多个碱性官能团的化合物可能能够与例如药用有机或无机酸形成药用盐。药用盐可以非限 制性地衍生于例如乙酸，己二酸，海藻酸，天门冬氨酸，抗坏血酸，苯甲酸，苯磺酸，丁酸，肉 桂酸，柠檬酸，樟脑酸，樟脑磺酸，环戊烷丙酸，二乙基乙酸，二葡糖酸，十二烷磺酸，乙磺酸， 甲酸，富马酸，葡庚糖酸，葡糖酸，甘油磷酸，乙醇酸，半磺酸，庚酸，己酸，氢氯酸，氢溴酸，氢 碘酸，2-羟基乙磺酸，异烟酸，乳酸，苹果酸，马来酸，丙二酸，扁桃酸，甲磺酸，2-萘磺酸，萘 二磺酸，对甲苯磺酸，烟酸，硝酸，草酸，双羟萘酸，胶质酸，3-苯基丙酸，磷酸，苦味酸，庚二 酸，特戊酸，丙酸，丙酮酸，水杨酸，琥珀酸，硫酸，氨基磺酸，酒石酸，硫氰酸或十一烷酸。含 有一个或多个酸性官能团的化合物可能能够与例如药用碱形成药用盐，所述药用碱例如非 限制性地是基于碱金属或碱土金属的无机碱，或诸如伯胺化合物、仲胺化合物、叔胺化合 物、季胺化合物、取代胺、天然存在的取代胺、环状胺或碱性离子交换树脂的有机碱。药用盐 可以非限制性地衍生于例如以下的氢氧化物、碳酸盐、或碳酸氢盐：药用金属阳离子如铵、 钠、钾、锂、妈、镁、铁、锌、铜、猛或错、氨、节星、葡甲胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、 三乙胺、异丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺乙醇、2-二乙基胺乙醇、二 环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、氨基葡萄糖、葡 糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、普鲁卡因、N-乙基哌啶、可可碱、四甲基铵化合 物、四乙基铵化合物、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、吗啉、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉、二环 己基胺、二苄基胺、N, N-二苄基苯乙胺、1-二苯轻甲胺（ephenamine)、N, Ν' -二苄基乙二胺 或聚胺树脂。在一些实施方案中，本文所述的化合物可以含有酸性基团和碱性基团两者，并 且可以是内盐或两性离子形式，例如且非限制性地，甜菜碱。本文所述的盐可以通过本领域 技术人员已知的常规方法制备，例如且非限制性地，通过将游离形式与有机酸或无机酸或 碱反应，或通过从其它盐进行阴离子交换或阳离子交换。本领域技术人员将理解，盐的制备 可以在分离和纯化化合物过程中原位进行，或者盐的制备可以通过单独使分离和纯化的化 合物反应来进行。
[0168] 在一些实施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式（例如，游离形式，盐， 多晶型物，异构形式）可以是溶剂加合物形式，例如溶剂合物形式。溶剂合物含有化学计算 或非化学计算量的溶剂，该溶剂与化合物或其盐物理缔合。该溶剂可以非限制性地例如是 药用溶剂。例如，当溶剂是水时形成水合物，或当溶剂是醇时形成醇化物。
[0169] 在一些实施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式（例如，游离形式，盐， 溶剂合物，异构形式）可以包括结晶和无定形形式，例如多晶型物，假多晶型物，构象假多 晶型物，无定形形式，或它们的组合。多晶型物包括相同元素组成的化合物的不同晶体堆积 排列。多晶型物通常具有不同的X-射线衍射图案、红外光谱图、熔点、密度、硬度、晶形、光 学和电学性质、稳定性和/或溶解性。本领域技术人员将理解，包括再结晶溶剂、结晶速率 和贮存温度的各种因素可以导致单一晶型占优势。
[0170] 在一些实施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式（例如，游离形式，盐， 溶剂合物，多晶型物）包括异构体如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构 体、互变异构体、单个的对映体、单个的非对映体、外消旋物、非对映体混合物、和它们的组 合，并且不限于为了便利目的而图示的结构式的描述。
[0171] 在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物可以包括该化合物的盐，优选在药 学上或在生理学上可接受的盐。药物制剂将典型地包含一种或多种载体，赋形剂或稀释剂， 其适于制剂的给药模式，例如通过注射、吸入、局部给药、灌洗或适于所选择治疗的其它模 式。适当的载体、赋形剂或稀释剂是本领域已知的以这些给药模式使用的那些。
[0172] 适当的药物组合物可以通过本领域已知的方法配制，并且它们的给药模式和剂量 由熟练的专业人员确定。关于肠胃外给药，可以将化合物溶解在无机水或盐水或药用载体 中，所述药用载体用于非水溶性化合物的给药，诸如用于维生素K的那些。对于经肠给药， 化合物可以是以片剂、胶囊或溶解在液体形式中施用。片剂或胶囊可以是肠溶的，或者是 缓释剂型。许多适当的剂型是已知的，包括包封待释放的化合物的聚合物或蛋白微颗粒、 软膏剂、糊剂、明胶、水凝胶、或可以局部使用以施用化合物的溶液。缓释贴片或植入物可 以用于提供长时期内的释放。许多本领域技术人员已知的技术描述在Alfonso Gennaro 的 Remington: the Science&Practice of Pharmacy (雷明顿：药物科学 & 实践），第 20 版， Lippencott Williams&Wilkins, (2000)。用于肠胃外给药的制剂可以例如含有赋形剂，聚 烷撑二醇如聚乙二醇，植物来源的油，或氢化萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、 丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。其它潜 在有效的用于调节化合物的肠胃外递送系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透栗， 可植入输注系统，和脂质体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有 例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘胆酸盐和去氧胆酸盐的水溶液，或者可以是用于以滴鼻剂或 作为凝胶形式给药的油性溶液。
[0173] 按照本发明或用于本发明的化合物或药物组合物可以通过医疗装置或器具（诸 如植入物、移植物、假体、支架等）施用。此外，植入物可以设计成意欲含有和释放该化合物 或组合物。一个实例是由聚合物材料制成的适于在一段时期内释放化合物的植入物。
[0174] 按照本发明的药物组合物的"有效量"包括治疗有效量或预防有效量。"治疗有效 量"是指在所需剂量下和时期内有效获得所需治疗结果（如减小的肿瘤尺寸，增加的寿命或 增加的预期寿命）的量。化合物的治疗有效量可以根据诸如以下因素改变：受试者的疾病 状态，年龄，性别，和重量，和化合物在受试者中引发所需反应的能力。剂量给药方案可以进 行调整以提供最佳的治疗反应。治疗有效量也是其中化合物的任何毒性或有害作用被治疗 有效作用超过的量。"预防有效量"是指在所需剂量下和时期内有效获得所需预防结果（诸 如较小的肿瘤，增加的寿命，增加的预期寿命或防止前列腺癌向雄激素非依赖性形式进展） 的量。典型地，在疾病之前或疾病早期在受试者中使用预防剂量，因此预防有效量可以少于 治疗有效量。
[0175] 应当注意，剂量值可以随将要缓解的病症的严重性而变化。对于任何具体的受试 者，具体的剂量给药方案可以随时间根据个体需要和施用组合物或监督组合物给药的人的 专业判断进行调整。本文列出的剂量范围仅是例举性的，并且不限制医学从业者可以选择 的剂量范围。在组合物中活性化合物的量可以按照诸如以下因素而改变：受试者的疾病状 态，年龄，性别和重量。剂量给药方案可以进行调整以提供最佳的治疗反应。例如，可以施 用单次推注，可以随时间施用数个分剂量，或者剂量可以根据治疗情形的紧急情况要求而 成比例的减少或增加。以单位剂量形式配制肠胃外组合物可以是有利的，以便易于给药和 剂量一致性。
[0176] 在一些实施方案中，本文所述的化合物及其所有不同形式可以非限制性地例如与 用于至少一种选自以下组成的组的适应证的其它治疗方法联合使用：前列腺癌，乳腺癌，卵 巢癌，子宫内膜癌，脱发，痤疮，多毛症，卵巢囊肿，多囊卵巢病，性早熟，和年龄相关的黄斑 变性。例如，本文所述的化合物和它们所有的不同形式可以与外科手术、放射（近距放射疗 法或外放射）或其它疗法（例如HIFU) -起作为新辅助疗法（之前）、附属疗法（期间）、 和/或辅助性疗法（之后）使用。
[0177] 通常，本发明的化合物应当在不导致实质毒性情况下使用。本发明化合物的毒 性可以使用标准技术测定，例如通过在细胞培养物或实验动物中测试和确定治疗指数，即 LD50 (50%群体致死剂量）和LD100 (100%群体致死剂量）之间的比率。然而，在一些情况 下，诸如在重病情况下，可能需要施用显著过量的组合物。本发明的一些化合物可以在一些 浓度下是有毒性的。可以使用滴定研究来测定毒性和非毒性浓度。可以如下评估毒性：使 用不表达AR的PC3细胞作为阴性对照，研究具体化合物或组合物对细胞系的特异性。可以 使用动物研究来提供证明化合物是否对于其它组织具有任何影响。靶向AR的系统治疗将 不大可能对其它组织导致重大问题，因为抗雄激素药和雄激素不敏感综合征不是致命的。
[0178] 本文所述的化合物可以施用于受试者。如本文所用，"受试者"可以是人，非人灵 长类，大鼠，小鼠，牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫，等。受试者可以被猜测患有癌症或处于癌 症（如前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌或子宫内膜癌）风险下，或被怀疑患有或处于以下疾病风 险下：痤疮，多毛症，脱发，良性前列腺肥大，卵巢囊肿，多囊卵巢病，性早熟，或年龄相关的 黄斑变性。本领域普通技术人员已知用于各种癌症（诸如前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌或子宫 内膜癌）的诊断方法和用于痤疮，多毛症，脱发，良性前列腺肥大，卵巢囊肿，多囊卵巢病， 性早熟，或年龄相关的黄斑变性的诊断方法，和癌症（诸如前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌或子 宫内膜癌）的临床叙述，痤疮，多毛症，脱发，良性前列腺肥大，卵巢囊肿，多囊卵巢病，性早 熟，或年龄相关的黄斑变性的诊断和临床叙述。
[0179] 所用的定义包括雄激素受体（AR)被雄激素进行配体依赖性激活，所述雄激素如 用于研究目的的二氢睾酮（DHT)或合成的雄激素（R1881)。AR的非配体依赖性激活是指在 缺乏雄激素（配体）的情况下通过例如用毛喉素（FSK)刺激依赖于cAMP的蛋白激酶（PKA) 途径而进行的AR的反式激活。本发明的一些化合物和组合物可以抑制FSK和R1881诱导 的ARE-萤光素酶（ARE-Iuc)(参见实施例1)。这些化合物可以阻断配体依赖性AR激活和 非配体依赖性AR激活两者所共有的机制。这可以包括AR激活中的任何步骤，包括热休克 蛋白的解离，关键的翻译后修饰（例如乙酰化，磷酸化），核易位，蛋白-蛋白相互作用，转录 复合物形成，辅阻遏物的释放，和/或增加的降解。
[0180] 本发明的一些化合物和组合物可以仅抑制R1881，并且可以干扰配体依赖性激活 特异的机制（例如，配体结合结构域（LBD)对雄激素的可及性）。除了前列腺癌以外，许多 病症涉及雄激素轴线（例如，痤疮，多毛症，脱发，良性前列腺肥大）和干扰该机制的化合物 可以用于治疗这些病症。
[0181] 本发明的一些化合物和组合物可以仅抑制FSK诱导，并且可以是AR的非配体依赖 性激活的特异性抑制剂。这些化合物和组合物可以干扰事件级联或任何可以对AR起作用 的下游作用（例如FSK增加MPK活性，MPK活性对于AR活性具有强力作用），所述事件通 常伴随FSK和/或PKA活性发生。实例可以包括cAMP和/或PKA或其它激酶的抑制剂。
[0182] 本发明的一些化合物和组合物可以诱导基础水平的AR活性（无雄激素或刺激PKA 途径）。
[0183] 本发明的一些化合物和组合物可以增加R1881或FSK的诱导。这些化合物和组合 物可以刺激AR的转录或反式激活。
[0184] 本发明的一些化合物和组合物可以抑制雄激素受体N-末端结构域（AR-NTD)的活 性。白介素-6 (IL-6)还导致在LNCaP细胞中AR的非配体依赖性激活，并且可以和FSK - 起使用。
[0185] 本发明的化合物和组合物可以与AR-NTD或反式激活AR-NTD所需的另一种蛋白质 相互作用。
[0186] 在本文中描述了本发明的各种备选实施方案和实施例。这些实施方案和实施例是 举例说明性的，并且不应理解为限制本发明的范围。 实施例
[0187] 一般方法学
[0188] 细胞系，雄激素和受体
[0189] 最初将LNCaP细胞用于所有实验，因为它们是完全分化的人前列腺癌细胞，其中 已经表征了 FSK对AR的非配体依赖性激活（Nazareth等1996J. Biol. Chem.(生物化学 杂志）271，19900-19907 ;和 Sadar 1999J. Biol. Chem.(生物化学杂志）274, 7777-7783)。 LNCaP细胞表达内源性AR并且分泌前列腺特异性抗原（PSA) (Horoszewicz等1983Cancer Res.(癌症研究）43,1809-1818)。LNCaP细胞可以在细胞培养物中作为单层培养或者在充 分表征的异种移植物模型中作为肿瘤培养，其在去势宿主中进展为雄激素非依赖性（Sato 等1996J. Steroid Biochem. Mol. Biol.(类固醇生物化学分子生物学杂志）58, 139-146 ; Gleave 等 1991Cancer Res.(癌症研究）51,3753-3761 ;Sato 等 1997Cancer Res.(癌症研 究）57, 1584-1589 ;和 Sadar 等 2002Μ〇1· Cancer Ther.(分子癌症治疗）1(8)，629-637) 〇 PC3人前列腺癌细胞不表达功能性AR (Kaighn等1978Natl. Cancer Inst. Monogr.(癌症研 究所专论）49, 17-21)并且用于测试化合物对AR的特异性。特异性靶向AR-NTD的小分子应 当对于PC3细胞不具备作用。这意味着它们应该不改变PC3细胞的增殖，如果它们特异性 阻断AR以介导它们的抑制作用的话。使用R1881，因为它是稳定的并且避免了与不稳定的 生理配体二氢睾酮（DHT)相关的问题。可以使用几种备选的报道基因构建体来测定报道分 子的特异性。一些充分表征的已经广泛使用的ARE-驱动的报道基因构建体有PSA(6. Ikb) 增强/启动子，其含有几个ARE并且可由雄激素以及FSK高度诱导（Ueda等2002A J. Biol. Chem.(生物化学杂志）277, 7076-7085)，和ARR3-胸苷激酶（tk)-萤光素酶，其为人工报道 分子构建体，在萤光素酶报道分子上游含有大鼠probasin AREl和ARE2区域的三个串联 重复序列（Snoek等1996J. Steroid Biochem. Mol. Biol.(类固醇生物化学分子生物学杂 志）59, 243-250)。使用CMV-Iuc (无ARE并且是组成型活性的）来确定化合物对于转录没 有一般抑制作用。
[0190] 动物模型
[0191] 一些实验涉及SCID小鼠的使用。选择SCID小鼠，因为人细胞系和可移植肿瘤在 免疫缺失动物和SCID小鼠中显示最佳的接受率（take rate)。所有程序已经被不列颠哥 伦比亚大学动物伦理委员会批准并且每年评审。在不能提供适当动物护理的紧急情况下， 将动物随兽医或动物关爱小组的意思进行安乐死。兽医负责检查和咨询。签署的动物护理 证明明确指出，"动物护理委员会已经检查和批准了将动物用于以上实验计划或教授课程， 并且已经被保证涉及的动物将按照加拿大动物护理委员会出版的Care of Experimental Animals-A Guide for Canada(实验动物护理-加拿大指南）中所含的原则进行护理"。
[0192] 皮下异种移植物
[0193] 将6至8周龄的雄性无胸腺SCID小鼠在腰窝区域通过27-号针用150 μ I LNCaP 或PC3人前列腺癌细胞（lx IO6细胞）的悬浮液皮下接种。在动物处于异氟烷的麻醉下的 同时进行接种。肿瘤接受率约为75%。将携带IOOmm 3的肿瘤的小鼠随机指定为治疗组。如 下所述进行去势。在携带可触或可见和至少40mm3的LNCaP皮下肿瘤的小鼠中测量肿瘤体 积（公式：L X W X H X 0. 5236)。每日监视动物，并且每5天测量肿瘤。
[0194] 实验持续时间
[0195] 肿瘤体积的评估（不超过1000 mm3)是确定皮下异种移植物实验终止的标准。
[0196] 组织学和免疫组织化学
[0197] 对于常规组织学，在实验完成后收获主要器官和异种移植物，并在10 %中性缓冲 福尔马林中固定，然后包埋到石蜡中。切割固定切片，并用H&E染色。为了测定化合物对异 种移植物中增殖率和细胞凋亡的可能影响，进行Kiso-67免疫染色和TUNEL测定。Kiso-67 免疫染色以0. 5 μ g/ml(l :50)的IgG浓度、对处理的组织切片使用MIB-I单克隆抗体。通 过免疫组织化学或蛋白质印迹分析来测定AR水平。
[0198] 雄激素退出以诱导进展
[0199] 通过去势完成雄激素退出。在异氟烷麻醉下，使用5_垂直切口来轻轻拉出附睾 脂肪垫，其上附有睾丸，从身体去除睾丸。将连接睾丸和血液供给的索带用缝合线结扎，然 后切断。然后将索带返回至腹腔。使用外科缝合线来闭合切割。为了减轻疼痛，在外科手 术之前注射丁丙诺啡（0. 05mg/kg)。
[0200] 异种移植物和器官回收
[0201] 将所有异种移植物和主要器官回收用于分析。在通过0)2气体导致心搏停止而牺 牲后，进行回收，并且摘除异种移植物或器官用于免疫组织化学分析。
[0202] 安乐死
[0203] 使动物通过CO2气体导致心搏停止而死亡。该方法是由动物护理委员会设定的政 策并且是环境灵敏的、有效的、经济的和伦理学上批准的。
[0204] 化学合成
[0205] 所有反应在火焰干燥的圆底烧瓶中进行。该烧瓶装配有橡胶隔片，并且反应在正 氩气压下进行，除非另外指出。使用不锈钢注射器转移气体-和湿气-敏感性液体。使用 230-400 目硅胶，如 Still 等（Still, W. C.，Kahn, M.，Mitra, A.，J. Org. Chem.(有机化学杂 志）1978, 43, 2923)所述进行快速柱色谱法。使用用0. 25mm 230-400目硅胶预包被的铝板 进行薄层色谱法，所述硅胶浸渍有荧光指示剂（254nm)。通过暴露于紫外光和对甲氧基苯甲 醛溶液（1 %对甲氧基苯甲醛，2% H2SO4, 20%乙酸和77%乙醇）接着用加热枪（~250°C) 加热（~lmin)，将薄层色谱板显像。将有机溶液在BUchi B-114旋转蒸发仪上在~25托 在25-30 °C下浓缩。
[0206] 商购试剂和溶剂如所接收的原样使用。所有用于提取和色谱法的溶剂是HPLC级。 常态硅胶（Normal-phase Si gel) Sep paks?购自 Waters, Inc。薄层色谱板是 Kieselgel 6〇F254。所有合成试剂购自加拿大西格玛奥德里奇（Sigma Aldrich)。
[0207] 质子核磁共振（1H NMR)谱在25°C使用Bruker 400以反向探头记录，并且Bruker 400光谱仪以δ尺度上的ppm报告，并且参照在NMR溶剂中残留的氕（⑶Cl 3: δ 7. 24(CHC13 )，DMS0-d6: δ 2. 50 (DMS0-d5))。数据报道如下：化学位移[多重性（s =单线，d =双重线，dd =双二重峰，ddd=三二重峰（double doublet of doublets), dm=双多重峰（double multiplet), t =三重线，m =多重线），親合常数以赫兹表示，积分]。碳-13核磁共振 (13C NMR)谱是使用Bruker 400光谱仪记录，以δ尺度上的ppm报道，并且参照溶剂的碳 共振（⑶Cl3: δ 77. 23, DMS0-d6: δ 39. 51)。数据报道如下：化学位移。氟核磁共振（19F NMR) 谱在25°C使用Bruker 300光谱仪记录，并且以δ尺度上的ppm报道。数据报道如下：化 学位移[多重性（td=三个二重峰（triplet of doublets)),親合常数以赫兹表示]。
[0208] 实施例1
[0209] 使用许多筛选的应用来鉴定抑制AR NTD活性的活性化合物。初始筛选是基于细 胞的测定，包括保持在培养物中的LNCaP细胞。该测定由以下组成：使用雄激素（配体依赖 性）和毛喉素（非配体依赖性）两者激活AR，和在粗制提取物存在和不存在下测量LNCaP 细胞分泌的PSA的水平。PSA是雄激素调节的基因，含有几个充分表征的ARE。PSA基因表 达的非雄激素依赖性增加在前列腺癌细胞中通过依赖于AR的机制发生。观察到PNG01-185 提取物阻断由雄激素和毛喉素两者诱导的PSA分泌。
[0210] 为了确保PNG 01-185提取物对内源性PSA蛋白的抑制作用是在转录水平上，还 研究了报道基因构建体。通过测量应答雄激素的报道分子，在LNCaP人前列腺癌细胞中 测量内源性AR的激活，所述应答雄激素的报道分子诸如PSA-萤光素酶报道基因构建体或 ARR3-萤光素酶报道分子。作为单层保持的LNCaP细胞用PSA-萤光素酶转染，并且用于筛 选制备自海洋海绵的粗制提取物以及一些选择的商购化合物。进行PSA-Iuc和ARR3-1UC 两者的测量，因为PSA-Iuc是由雄激素高度诱导的和在缺乏雄激素下由FSK诱导的。使用 R1881 (InM)来介导AR的配体依赖性激活，并且使用FSK (50 μ M)浓度来介导AR的非配体 依赖性激活。观察到PNG01-185阻断由R1881和FSK两者诱导的PSA-萤光素酶活性（图 1)。对照包括使用不表达AR的细胞系和不含有ARE的其它报道分子的平行实验。
[0211] PNG 01-185提取物按照图2所示方案分级，以生成PNG 01-185-17。将每个PNG 01-185-17级分再次检测它们的ARR3-luc活性，级分3和8显示至少50%抑制（图3)。 这些级分接下来测试它们抑制AR NTD的能力。将LNCaP细胞用GaWDBD-AR1 558的表达 载体和互补的5XGal4UAS-萤光素酶报道分子共转染，如图4所不。该报道分子被FSK诱 导是GaWDBD-AR 1 558融合蛋白的反式激活的量度（Sadar 1999J. Biol. Chem.(生物化学杂 志）274, 7777-7783)。以上鉴定的提取物以及一些商购自商业供应商的化合物通过这些测 定筛选。R1881没有诱导这些测定（结合AR的配体结合结构域（LBD)，所述LBD不存在于 GaWDBD-AR 155i^合体中）并因此只是用作阴性对照。这些研究显示PNG 01-185-17-8抑 制ARNTD的激活。
[0212] 表3中的下列各项是使用上述测定、显示活性的来自海绵提取物的化合物或商购 化合物的化学结构：
[0213] 表 3
[0214]
[0215]
[0216] 对于每个显示剂量应答的命中物（hit)测定IC50。将鉴定的提取物用于从天然化 合物库中分离纯化形式的、介导对AR反式激活的抑制作用的化合物（如实施例2所述），接 着进行实施例3中描述的二次筛选。
[0217] 表4中的下列化合物在上述测定中没有显示活性。
[0218] 表 4
[0219]
[0220] 一些活性化合物与BADGE (双酚A缩水甘油醚）的结构类似性指示它们最有可能 是工业来源的。推断收集的海绵从污染的海水中生物累积所述化合物。这是意外事件，因 为不可能这些化合物已经在任何其它情形下在生物测定中进行筛选过。
[0221] 实施例2
[0222] 分离来自实施例1描述的提取物的纯化的活性化合物。使用SCUBA，以从 巴布亚新几内亚Loloata岛附近的防护暗礁上岩石底下5M的深度用手收集Geodia lindgreni (Lendenfeld，1903)样本。将冷冻的海绵（890g)随后用MeOH彻底提取，观察到粗 提物在以上实施例1所述测定中具有活性。通过依序应用Sephadex LH20、反相快速柱色谱 法和反相梯度HPLC，生物测定指导的分级提供了纯化的样品PNG01-185-017-2, -5, -6, -7 和_8(图2)。通过分析NMR和MS数据已经阐明了结构，它们显示在以上实施例1中。
[0223] 生物测定指导的