的微粒时，含有以脂质体B和上述RNA为构成成分的复 合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体成为脂质体A，根据其构成，分类为狭义的脂 质体，即使前导粒子是除作为脂质体B的微粒之外的微粒时，也由于被覆脂双层膜，所以被 分类为广义的脂质体。在本发明中，较优选前导粒子是作为脂质体B的微粒。
[0176] 本发明中以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子，可以在制备该前导粒 子后或在制备该前导粒子的同时，将该RNA附着在前导粒子上或包封在前导粒子中，制备 复合粒子，然后在制备该复合粒子后或制备该复合粒子的同时，用脂双层膜被覆该复合粒 子，由此制备脂质体A。脂质体A例如可以根据日本特表2002 - 508765号公报、日本特表 2002 - 501511 号公报、"BiochimicaetBiophysicaActa"，2001 年，第 1510 卷，p. 152 - 166、国际公开第02/28367号说明书等中记载的公知制备方法或以其为基准进行制备，或 者例如采用包括下述工序的制备方法进行制备，所述工序为：将上述RNA附着在前导粒子 上或包封在前导粒子中制备复合粒子后，使该复合粒子及被覆层成分分散于液体中的工 序，所述液体含有可溶解该被覆层成分的极性有机溶剂，其浓度为该复合粒子不溶解、该被 覆层成分以分散状态存在的浓度；及用该被覆层成分被覆该复合粒子的工序。本发明中以 前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子优选如下制备：在水中制备前导粒子，在制备 该前导粒子后或制备该前导粒子的同时，将上述RNA分散或者溶解在水中并与前导粒子混 合，使该RNA附着在前导粒子上或包封在前导粒子中制备复合粒子，或者在任意的溶剂中 制备前导粒子后，将该前导粒子分散在水中，将上述RNA分散或溶解于水中并与前导粒子 混合，使该RNA附着在前导粒子上进行制备，较优选在水中制备前导粒子，制备该前导粒子 后，将上述RNA分散或溶解于水中并与上述前导粒子混合，使该RNA附着在前导粒子上进行 制备。
[0177] 作为本发明的组合物中的脂质体A的优选制备方法，可以举出包括下述工序的制 备方法，所述工序为：下述的制备以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子的工序（工 序1)及用脂双层膜被覆该复合粒子的工序（工序2或工序3)。
[0178] 工序1)制备以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子的工序
[0179] 优选将前导粒子分散在例如水等溶剂中，通过混合将上述RNA分散或溶解而使其 包含在分散有前导粒子的液体中，由此使该RNA附着在前导粒子上。在工序1中，为了抑制 前导粒子的凝集，优选前导粒子为含有凝集抑制物质的前导粒子，作为凝集抑制物质，优选 举出选自上述糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生 物、或表面活性剂。另外，前导粒子为带有正电荷的粒子时，在分散有前导粒子的溶液中，可 以使该RNA和附着竞争剂共存，使附着竞争剂与该RNA-同附着在前导粒子上，进而前导粒 子为含有凝集抑制物质的前导粒子时，为了进一步抑制前导粒子的凝集，也可以使用附着 竞争剂。作为前导粒子和上述RNA的组合，优选复合粒子能够分散在含有极性有机溶剂的 液体中的组合，较优选复合粒子在极性有机溶剂中的溶解度低于工序2或3中使用的脂双 层膜的构成成分的组合。另外，较优选在含有该极性有机溶剂的液体中存在以下述浓度含 有该极性有机溶剂的液体的组合，以所述浓度含有该极性有机溶剂时该脂双层膜构成成分 能够分散、该复合粒子也能分散。
[0180] 作为附着竞争剂，例如可以举出阴离子性物质等，该阴离子性物质包括通过分子 内电荷、分子内极化等产生的静电引力而静电地附着在前导粒子上的物质。用作附着竞争 剂的阴离子性物质为呈阴离子性的物质，但即使是含有阴离子性基团和阳离子性基团二者 的两性物质，由于通过PH或与其他物质结合等使相对电负性发生变化，所以根据情况可被 分类为阴离子性物质。
[0181] 作为阴离子性物质，可以举出阴离子性脂质、阴离子性表面活性剂（与上述含义 相同）、阴离子性高分子等或在等电点以上的PH值下呈阴离子性的蛋白质、肽或核酸等，优 选举出硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸钠、硫酸软骨素、软骨素硫酸钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮 肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素或葡聚糖葡聚糖荧光素阴离子等。上述阴离子性物 质可以单独使用或者组合2种以上进行使用。
[0182] 作为阴离子性脂质，例如可以举出磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或磷脂 酸等。
[0183] 作为阴离子性高分子，例如可以举出聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙 烯酰胺一丙烯酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰的树枝状高分子、聚乳酸、聚乳酸聚乙二 醇酸、聚乙二醇化聚乳酸、硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸钠、硫酸软骨素、软骨素硫酸钠、透明质 酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素或葡聚糖葡聚糖荧光素阴离子 等。
[0184] 作为在等电点以上的pH值下呈阴离子性的蛋白质或肽，只要是在该物质的等电 点以上的PH值下呈阴离子性的蛋白质或肽即可，没有特殊限定。例如可以举出白蛋白、血 清类粘蛋白、球蛋白、血纤维蛋白原、组蛋白、精蛋白、核糖核酸酶或溶菌酶等。
[0185] 作为为阴离子性物质的核酸，例如可以举出DNA、RNA、质粒、siRNA或ODN等，只要 为不显示生理活性的物质即可，可以为任意长度、任意序列。
[0186] 优选附着竞争剂静电地附着在前导粒子上，优选大小为即使附着在前导粒子上也 不形成使前导粒子凝集之类的交联的物质，或者在分子内具有附着部分、和排斥附着、抑制 前导粒子凝集的部分的物质。
[0187] 工序1，更具体而言可以采用例如下述的制备方法实施，所述制备方法包括如下步 骤，即制备分散有含有凝集抑制物质的前导粒子的液体的步骤、及在分散有该前导粒子的 液体中使上述RNA分散或溶解而包含在液体中的步骤（例如，在分散有该前导粒子的液体 中，加入该RNA使其分散或溶解的步骤，在分散有该前导粒子的溶液中，加入分散或溶解有 该RNA的液体的步骤等）。此处，作为通过在分散有前导粒子的液体中使上述RNA分散或溶 解而包含在液体中的工序所获得的复合粒子，具体而言可以举出下述复合离子，即，该RNA 附着在作为含有该阳离子性物质的脂质体B的微粒上而形成的复合粒子，上述RNA附着在 作为含有阳离子性物质的脂质集合体的微粒上而形成的复合粒子，上述RNA附着在作为含 有聚一L一赖氨酸等阳离子性高分子的高分子的微粒上而形成的复合粒子。另外，在分散 有前导粒子的液体中使上述RNA分散或溶解而包含在液体中的步骤，优选为使在分散或溶 解有该RNA的液体中进一步含有附着竞争剂并将其加入到分散有该前导粒子的液体中的 步骤。此时，该RNA和该附着竞争剂一同附着在该前导粒子上，制备复合粒子，由此能够在 进一步抑制该复合粒子制备中前导粒子的凝集、及制备后复合粒子的凝集的前提下进行制 备。
[0188] 前导粒子在分散有前导粒子的液体中所占的比例，只要上述RNA能够附着在前导 粒子上即可，没有特殊的限制，优选约为Iyg/mL~lg/mL，较优选约为0. 1~500mg/mL。
[0189] 工序2)用脂双层膜被覆复合粒子的工序（1)
[0190] 可以通过包含以下步骤的制备方法制备脂质体A，所述步骤包括制备含有极性有 机溶剂的液体（液体A)的步骤，所述极性有机溶剂中分散有工序1所得的复合粒子且溶解 了脂双层膜的构成成分，以及通过减小液体A中极性有机溶剂的浓度，用脂双层膜被覆复 合粒子的步骤。此时，以分散液（液体B)的形态获得脂质体A。优选液体A中的溶剂是含有 极性有机溶剂的溶剂，极性有机溶剂的浓度为该脂双层膜构成成分可以溶解、该复合粒子 可以分散的浓度，在减小液体A中极性有机溶剂的浓度而得到的液体B中，该脂双层膜的构 成成分可以分散，该复合粒子也可以分散。液体A中的溶剂为极性有机溶剂与除极性有机 溶剂之外的溶剂的混合液时，通过加入例如含有能够与极性有机溶剂混合的除极性有机溶 剂之外的溶剂（液体C)，及/或通过蒸馏除去、半透膜分离、分馏等选择性地除去极性有机 溶剂，能够减小极性有机溶剂的浓度。此处，优选液体C含有除极性有机溶剂之外的溶剂， 也可以含有极性有机溶剂，只要该极性有机溶剂的浓度低于液体A中极性有机溶剂的浓度 即可。
[0191] 作为工序2中的除极性有机溶剂之外的溶剂，例如可以举出水、液体二氧化碳、液 烃、卤化碳或卤化烃等，优选举出水。另外，液体A及液体C可以含有离子或缓冲成分等。上 述溶剂可以单独使用或者组合2种以上进行使用。
[0192] 极性有机溶剂和除极性有机溶剂之外的溶剂的组合，优选为可以相互混合的溶剂 的组合，并可以根据在液体A及液体B中的溶剂及液体C中复合粒子和脂双层膜的构成成 分的溶解度等进行选择。优选复合粒子在液体A及液体B中的溶剂及液体C中的溶解度 均低，还优选在极性有机溶剂及除极性有机溶剂之外的溶剂中的溶解度也低。脂双层膜的 构成成分优选在液体B中的溶剂及液体C中的溶解度低，优选在液体A的溶剂中的溶解度 高，并且优选在极性有机溶剂中的溶解度高，优选在除极性有机溶剂之外的溶剂中的溶解 度低。此处，所谓"复合粒子的溶解度低"是指复合粒子中含有的前导粒子、RNA及附着竞争 剂等各成分在溶剂中的溶出性小，即使各成分各自的溶解度高，只要通过各成分间的键合 等使得各成分的溶出性变小也可以。例如，即使为前导粒子中含有的任意成分在液体A的 溶剂中的溶解度高的情况，在前导粒子带有正电荷时，通过RNA内的电荷、分子内极化等静 电键合能够抑制复合粒子中的成分溶出，由此可以降低复合粒子在液体A的溶剂中的溶解 度。即，在脂质体A的制备中，前导粒子带正电荷能够抑制复合粒子的成分溶出，具有提高 制备性和成品性的效果。
[0193] 液体A中极性有机溶剂的浓度，只要脂双层膜的构成成分可溶且复合粒子可以分 散即可，没有特殊的限制，根据所用的溶剂或复合粒子、脂双层膜的构成成分的种类等的不 同而不同，优选约为30v/v%以上，较优选约为60~90v/v%。另外，液体B中的极性有机 溶剂的浓度，只要以比液体A低的浓度含有该极性有机溶剂，且脂双层膜的构成成分及复 合粒子都可分散即可，没有特殊的限制，优选约为50v/v%以下。
[0194] 作为制备液体A的工序，可以举出下述工序，S卩，混合极性有机溶剂、复合粒子及 脂双层膜的构成成分、并根据需要混合除极性有机溶剂之外的溶剂来制备液体A。只要复合 粒子不溶解，则加入极性有机溶剂、复合粒子及脂双层膜的构成成分、及根据需要加入的除 极性有机溶剂之外的溶剂的顺序没有特殊限制，但优选举出下述工序，即，例如制备含有分 散有该复合粒子的极性有机溶剂的液体（液体D)，制备使该脂双层膜的构成成分溶解于含 有与液体D中的极性有机溶剂相同或不同的极性有机溶剂的溶剂中的液体（液体E)，再混 合液体D和液体E进行制备。混合液体D和液体E制备液体A时，优选缓缓地混合。
[0195] 工序3)用脂双层膜被覆复合粒子的工序（2)
[0196] 通过含有如下步骤的制备方法，可以制备脂质体A，此时，脂质体A以分散液的状 态获得，所述步骤为使工序1所得的复合粒子及脂双层膜的构成成分分散于液体（液体F) 中，所述液体F含有可以溶解该脂双层膜的构成成分的极性有机溶剂，其浓度为该脂双层 膜的构成成分可以以分散状态存在的浓度。需要说明的是，液体F中含有可以溶解该脂双 层膜的构成成分的极性有机溶剂，是以该脂双层膜的构成成分及复合粒子均可以分散的特 定浓度含有该极性有机溶剂的液体。
[0197] 液体F的制备方法可以采取任意方案。例如可以在制备复合粒子的分散液、和脂 双层膜的构成成分的溶解液或分散液之后，将两种液体混合，制备液体F;也可以制备复合 粒子或脂双层膜的构成成分中任一方的分散液，在此分散液中加入固态的复合粒子或脂双 层膜的构成成分的另一方，使其分散，制备液体F。在将复合粒子的分散液和脂双层膜构成 成分的溶解液或分散液混合时，复合粒子的分散介质可以预先含有极性有机溶剂，脂双层 膜的构成成分的溶剂或分散介质可以为含有极性有机溶剂的液体或只由极性有机溶剂构 成的液体。另一方面，制备复合粒子或脂双层膜的构成成分中任一方的分散液，在该分散液 中加入固态的复合粒子或脂双层膜的构成成分的另一方的情况下，该分散液优选为含有极 性有机溶剂的液体。需要说明的是，制备液体F后复合粒子不溶解、脂双层膜的构成成分分 散时，可以在复合粒子不溶解、脂双层膜的构成成分分散的极性有机溶剂浓度的范围内，加 入极性有机溶剂，也可以除去极性有机溶剂或减小浓度。另一方面，制备液体F后复合粒子 不溶解，但脂双层膜的构成成分溶解的情况下，可以在复合粒子不溶解、脂双层膜的构成成 分分散的极性有机溶剂浓度的范围内，除去极性有机溶剂或减小浓度。另外，可以预先在 除极性有机溶剂之外的溶剂中混合复合粒子和脂双层膜的构成成分，可以在复合粒子不溶 解、脂双层膜的构成成分分散的极性有机溶剂浓度的范围内向其中加入极性有机溶剂，此 时，可以使复合粒子和脂双层膜的构成成分分别分散于除极性有机溶剂之外的溶剂中，混 合两分散液后，加入极性有机溶剂，也可以使复合粒子或脂双层膜的构成成分的任一方分 散在除极性有机溶剂之外的溶剂中，在此分散液中加入固态的复合粒子或脂双层膜的构成 成分的另一方，使其分散后，加入极性有机溶剂。另外，优选包括如下步骤，即，使复合粒子 和脂双层膜的构成成分分散的含有极性有机溶剂的液体静置或混合充分时间使脂双层膜 被覆复合粒子的步骤。使复合粒子和脂双层膜的构成成分分散在含有极性有机溶剂的液 体中后，静置或混合的时间，只要不在使复合粒子和脂双层膜的构成成分分散在含有极性 有机溶剂的液体中后立刻结束即可，没有限定，可以根据脂双层膜的构成成分、或含有极性 有机溶剂的液体的种类任意地设定，优选设定所得脂质体A的收率为定值的时间，例如约3 秒~30分钟。
[0198] 作为液体F中除极性有机溶剂之外的溶剂，例如可以举出工序2中的除极性有机 溶剂之外的溶剂中列举的例子，优选举出水。
[0199] 液体F中极性有机溶剂的浓度，只要满足复合粒子和脂双层膜的构成成分均分散 的条件即可，没有特殊的限制，根据所用溶剂或复合粒子、脂双层膜的构成成分的种类等的 不同而不同，优选约为1~80v/v%，较优选约为10~60v/v%，更优选约为20~50v/v%， 最优选约为30~40v/v%。
[0200] 本发明中，所谓"脂双层膜的构成成分可溶解在极性有机溶剂中"，包括下述几种 情况，即，脂双层膜的构成成分具有溶解于极性有机溶剂中的性质的情况，脂双层膜的构成 成分具有通过使用增溶剂溶解于极性有机溶剂中的性质的情况，脂双层膜的构成成分具有 能够在极性有机溶剂中形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的性质的情况等。另外，所 谓"脂双层膜的构成成分分散"，包括下述几种状态，即，脂双层膜的构成成分全部形成凝集 体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的状态；脂双层膜的构成成分的一部分形成凝集体或胶束 等，发生乳浊或乳剂化，剩余部分溶解的状态；脂双层膜的构成成分的一部分形成凝集体或 胶束等，发生乳浊或乳剂化，剩余部分沉淀的状态等。需要说明的是，所谓"脂双层膜的构成 成分溶解"，不包括脂双层膜的构成成分全部形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的状 O
[0201] 本发明中，所谓"复合粒子分散"，是指复合粒子悬浊或乳浊或者乳剂化的状态，包 括如下几种状态，即，复合粒子的一部分悬浊或乳浊或者乳剂化，剩余部分溶解的状态；复 合粒子的一部分乳浊或者乳剂化，剩余部分沉淀的状态等。所谓"复合粒子不溶解"，与上述 "复合粒子分散"的含义相同。
[0202] 在本发明的脂质体A的制备方法中使用的、含有极性有机溶剂的水溶液中的复 合粒子的浓度，只要能够用脂双层膜被覆复合粒子即可，没有特殊的限制，优选约为lyg/ mL~lg/mL，较优选约为0. 1~500mg/mL。另外，所用的脂双层膜的构成成分的浓度，只要 能够被覆复合粒子即可，没有特殊的限制，优选约为Iyg/mL~lg/mL，较优选约为0. 1~ 400mg/mL〇
[0203]脂双层膜相对于本发明的脂质体A的比例，以重量比计优选约为1:0. 1~1:1000， 较优选约为1:1~1:10。
[0204]另外，本发明中的脂质体A的大小，优选平均粒径约为300nm以下，较优选约为 200nm以下，具体而言，优选例如可以注射的大小。
[0205]并且，可以通过抗体等蛋白质、糖类、糖脂质、氨基酸、核酸、各种低分子化合物或 高分子化合物等物质对上述得到的脂质体A进行修饰，通过上述修饰得到的被覆复合粒子 也包括在脂质体A中。例如，为了用于靶向，也可以进一步用抗体等蛋白质、肽或脂肪酸类 等对上述所得的脂质体A进行脂双层膜的表面修饰[参见D.D.Lasic、F.Martin编写的 "StealthLiposomes"（美国），CRCPressInc，1995 年，p. 93 - 102]。另外，也可以用例 如水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物对脂质体A任意地进行表面改 质。用于上述表面改质的水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物，与上述 作为脂双层膜构成成分的水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物的含义 相同。
[0206]通过将本发明的组合物给与包括人在内的哺乳动物，能够将上述RNA送达到靶基 因的表达部位，例如，能够在体内向哺乳动物细胞中导入可抑制基因表达的RNA等，抑制基 因等的表达。本发明的组合物中的靶基因例如如果为与肿瘤或炎症相关的基因，则可以将 本发明的组合物用作癌症或炎症疾病的治疗剂或预防剂，优选用作实体癌或者血管或血管 附近炎症的治疗剂或预防剂。具体而言，本发明的组合物中的靶基因如果为与血管新生相 关的基因等，由于能够抑制血管平滑肌的增殖或血管新生等，则本发明的组合物例如可以 用作伴随着血管平滑肌的增殖或血管新生的癌症或炎症疾病的治疗剂或预防剂。
[0207]S卩，本发明还提供一种将上述说明的本发明的组合物投与哺乳动物的癌症或炎症 疾病的治疗方法。投与对象优选人，较优选患有癌症或炎症疾病的人。
[0208]另外，本发明的组合物也可以在与癌症或炎症疾病的治疗剂或预防剂相关的体内 筛选体系中用作获取POC(Proofofconcept)]的工具。
[0209] 本发明的组合物也可以用作达到下述目的的制剂，例如血液成分等生物体成分 (例如血液、消化管等）中的上述RNA的稳定化、副作用的降低或增加在含有靶基因的表达 部位的组织或脏器中的药物的蓄积等。
[0210] 将本发明的组合物用作癌症或炎症疾病等的治疗剂或预防剂时，作为给药途径， 优选使用治疗时最有效果的给药途径，可以举出口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静 脉内等非口服给药或口服给药，优选举出静脉内给药或肌肉内给药，较优选举出静脉内给 药。
[0211] 给药量根据给药对象的病情、年龄、给药途径等的不同而不同，例如换算为RNA的 1天给药量约为〇?Iyg~l〇〇〇mg。
[0212] 作为适于静脉内给药或肌肉内给药的制剂，例如可以举出注射剂，通过上述方法 制备的脂质体A的分散液也可以直接作为例如注射剂等形态使用，也可以通过例如过滤、 离心等从该分散液中除去溶剂后进行使用，也可以冷冻干燥该分散液或冷冻干燥加入了例 如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖或甘氨酸等赋形剂的分散剂，进行使用。
[0213] 为注射剂时，优选在上述的脂质体A的分散液或上述除去了溶剂或冷冻干燥后的 脂质体A中，混合例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等，制备注射剂。另外， 也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸或H)TA等抗氧化剂，或甘油、葡萄糖或氯化钠 等等渗剂等，制备注射剂。另外，也可以加入例如甘油等冷冻保存剂进行冷冻保存。
[0214] 在上述说明的本发明的组合物中，作为本发明的癌症或炎症疾病的治疗剂，可以 举出含有脂质体A的组合物，所述脂质体A为下述脂质体：含有以前导粒子和下述RNA为构 成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体，该脂双层膜的构成成分可溶解 于极性有机溶剂，并且该脂双层膜的构成成分及该复合粒子能够分散在以特定浓度含有该 极性有机溶剂的液体中；或者是含有以含有阳离子性物质的前导粒子和下述RNA为构成成 分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体，该脂双层膜以中性脂质及水溶性物 质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。其中，上述RNA含有与肿瘤或 炎症相关的靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列（以下记为序列X1)及与该序列互 补的碱基的序列（以下记为互补序列X/ )，并且与序列X1及互补序列X/的碱基键合的糖 的总计1~90%为2'位上被修饰基团取代的核糖。本发明的癌症或炎症疾病的治疗剂中， 作为癌症，优选举出实体癌，作为炎症疾病，优选举出血管或血管附近的炎症。
[0215]另外，本发明还提供了上述说明的本发明的组合物在制备癌症或炎症疾病的治疗 剂优选实体癌或者血管或血管附近炎症的治疗剂中的应用，所述组合物含有包封有RNA的 脂