pCAM等数个肝癌干细胞标记物的表达；采用的抗原递呈树突 状细胞源自自体血、安全性高，毒副作用小；制备的肝癌干细胞的树突状细胞癌症疫苗经试 用后可显著激发肿瘤干细胞特异性细胞毒性效应CTL (细胞毒性T淋巴细胞）反应。
【附图说明】
[0022] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0023] 图1是本发明一个实施例1中用PCR基因型分型方法来证明在四个IfepG2癌症干 细胞株里特异性地证合在aavsl位点上；
[0024] 图2是本发明一个实施例1中RT-PCR分析0ct4和Sox2基因在H印G2癌症干细 胞上的表达；
[0025] 图3是本发明一个实施例1中定量实时PCR分析显示0ct4和Sox2 mRNA表达量 在4个H印G2肿瘤干细胞克隆里有所增加；
[0026] 图4是本发明一个实施例2中癌症干细胞标记物在H印G2癌症类干细胞的克隆体 上的表达；
[0027] 图5是本发明一个实施例3中DC预激后的T细胞特性结果；
[0028] 图6是本发明一个实施例3中ELISP0T测定具有CSC抗原特异性的CTL的产生结 果；
[0029] 图7是本发明一个实施例3中ELISP0T测定具有CSC抗原特异性的CTL的产生结 果。
【具体实施方式】
[0030] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例，对本 发明作进一步详细的说明。
[0031] 实施例1 0ct4和Sox2基因在AAVSl位点的整合
[0032] 肿瘤细胞存在于异质性的人群中。因此，为了获得一致的肝癌细胞基因工程效果， 本发明通过单细胞克隆，首次获取了同源群体的IfepG2。单细胞分别接种于96孔板，且扩大 孔眼。当它的亲本细胞株IfepG2、SC被选定进入下一步应用时，克隆显示了相似的形态和生 长速度。
[0033] 为了产生IfepG2 CSC样细胞，本发明利用杆状病毒介导的锌指核酸酶技术将含有 0ct4和Sox2基因（0ct4和Sox具体的基因序列如附加的基因序列表所述）的基因盒引入 HepG2 SC细胞的AAVSl位点。两个不同的启动因子CMV与EF1A，分别检验了这两个基因的 表达。肝癌细胞HepG2和BV-ZFN被同时转导，供体载体与两基因在MOI 100中停留24小 时。在2天的转导后，开始G418筛选，介质也要隔天更换。通过2周的药物选择，G418抗 体的克隆被单独扩增。
[0034] 对这些克隆的基因组DNA进行了提取，并进行了 PCR引物对供向量和19号染色 体的同源臂的AAVSl位点的3'端下游特定的基因分型。四个克隆体显示有一个2. 6kb片 段的扩增（如图1所示），证明通过bv-zfn切割介导同源重组而进行AAVSl修改是成功 的。为了表明供体基因盒的整合能调节两基因的表达，定量实时的PCR(qPCR)以及4个重 编程基因的反转录酶-聚合酶链锁反应在4个克隆上进行（图2、图3所示）。具体的，图 1为用PCR基因型分型方法来证明在四个H印G2癌症干细胞株里，转基因借助oksm基因特 异性地证合在aavsl位点上。这两个基因被成功整合在该位点是通过一段2. 6kb的扩增 信号来验定的；图2为RT-PCR分析0ct4和Sox2基因在H印G2癌症干细胞上的表达；其中 1. H印G2 SC ;2. CMV 2.3 ;3. EFla 2.3 ;4. CMV 2.31 ;5. CMV 2.60.;图 3 为定量实时 PCR分析 显示0ct4和Sox2 mRNA表达量在4个H印G2肿瘤干细胞克隆里有所增加；GAPDH mRNA作为 内参。RT-PCR分析表明，与母本的SC细胞中HepG2的表达相关，在CMV 2. 31和CMV 2. 60 克隆体内这两种基因都有增加，其中最高的上调基因（0ct4-75倍，Sox2-57556倍）在CMV 2. 60克隆细胞中。
[0035] 实施例2 :制备带有癌症干细胞标志物表达的肝癌细胞
[0036] 常规细胞培养在含10 %胎牛血清（Invitrogen)和1 %的青霉素/链霉素 (Invitrogen)的 DMEM 培养基（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中，37 摄氏 度，5%二氧化碳的加湿培养箱中进行。球培养技术常用于从培养的粘附细胞里聚集、保持 和扩增CSC的数量。上述转基因肝癌细胞通过球培养来检测是否上调0ct4和Sox2的基因 表达就可以增加CSC的数量，界定CSC的标准是标志物基因的表达谱和表达水平。
[0037] 首先人肝癌细胞H印G2细胞被分离进行单细胞克隆。细胞被单独接种于一个96孔 培养板的培养基中。每个克隆随后单独增殖。人肝癌细胞单细胞克隆H印G2 SC subclone 用于进一步的基因修饰。进行基因修饰时，5x 104IfepG2SC细胞被接种于6孔培养板中，加 入上述重组杆状病毒，以一个细胞100个病毒颗粒的比例感染转导24小时。G418 (500 y g/ mL)筛选在转导后第五天开始。转导后2周培养基变更为CSC培养基。CSC培养基含DMEM/ F12培养基加入2mM/升谷氨酰胺、2 %去除维生素A的B-27补剂（Invitrogen)，20ng/ml 表皮生长因子（EGF) (P印roTech)，I %胎牛血清（FBS) (Invitrogen)和I %青霉素/链霉素 (Invitrogen)。基因修饰后的HepG2 SC按上述方法再进行单细胞克隆。单个克隆随后被 采集供进一步增殖和研究。
[0038] 使用细胞流式仪分析CSC标记物；BD ACCuri C6流式细胞检测仪（BD BiosCiences，新泽西富兰克林湖泊）。针对 CD1、CD24、CD44、CD90、CD133 和 EpCAM 的 APC 共辄体购于MiltenyiBiotec公司。结果如表1 :
[0039]表1
[0040]
[0041] 表1显示公认的CSC的标记，已在4个研究中得到测试。母本IfepG2SC细胞在控 制组。
[0042] 值得注意的是，CMV 2. 31和CMV 2. 60球体中的表达CD13 (29 %和23. 3% Vs 4. 6% )、CD90(10%和 14. 3% Vs2% )和 EpCAM(84%，82. 2%和 48. 1% )与原株细胞 SC 细 胞球相比显著增加。这些细胞克隆体也将他们的⑶24和⑶44的表达水平保持在99-100 %， 这表明了上调的0ct4和Sox2基因能够维持但不影响⑶24和⑶44的表达。因为H印G2 SC 球型培养皿中几乎没有显示⑶133的表达，本发明只观察到在克隆CMV2. 60上这种基因表 达轻微增加的迹象。
[0043] 上皮间质转化（EMT)通常被认为在肿瘤细胞的增长和转移中发挥重要作用，是肿 瘤干细胞的一个重要的特性。为了确定EMT确实是这一代的CSC细胞被激活，本发明运用 定量聚合酶链反应检测3EMT相关基因的表达（如图4所示）。图4表示癌症干细胞标记物 在H印G2癌症类干细胞的克隆体上的表达。其中，四个H印G2癌症类干细胞克隆体被分离 并接种在聚（甲基丙烯酸羟乙酯）（PHEMA)(西格玛奥德里奇）上用6孔低附着板进行无血 清悬浮培养5-7天。（B)定量实时PCR分析显示，在H印G2类癌症干克隆细胞中，与EMT相 关基因N-cadherin，Snail and Slug的mRNA表达水平有所增加。GAPDHmRNA作为内参。
[0044] 其中，选用的基因修饰后的H印G2 SC单细胞克隆进一步接种于一个经2聚甲基丙 稀酸轻乙酯（pHEMA) (Sigma-Aldrich)处理的6孔低吸附培养板上，并于无血清培养基中悬 浮培养5-7日，用于生成肿瘤干细胞球体。无血清培养基含DMEM/F12培养基（Invitrogen)， 2mM/升谷氨酰胺、2%去除维生素A的B-27补剂（Invitrogen)、20ng/ml表皮生长因子 (EGF) (PeproTech)和 1 %青霉素 / 链霉素（Invitrogen)。
[0045] 正如预期的那样，qPCR分析表明，...