P的cDNA(P12A)。采用杆状病毒感染 昆虫细胞生产FMDV VLP的研究并未发现报道需要提升培养pH。
[0225] 如果细胞生长加入不能明确的5%胎牛血清复杂了整个无血清繁殖和生产方法。 发明从BHK-21生产正真的FMDV VLP标准到昆虫细胞生产VLP都实现了无血清条件下生产。
[0226] 发明的检测分析方法与以往的发明、研究报道不同，特别是制备抗体用于VLP的 定量。
[0227] 提高培养pH。提升杆状病毒表达口蹄疫病毒病毒样颗粒不只限于猪0型/ Mya98-XJ-2010 口蹄疫疫苗株，也适合其他的口蹄疫疫苗株、BHK细胞、昆虫细胞。
[0228] 在pH 6. 6 - 6. 8时，感染Sf21细胞生产的FMDWLPs通过qELISA检测表明，这个 pH范围超出Sf9、Sf21细胞系的正常生理范围，接近培养昆虫细胞的极限值。由于Sf21细 胞系的异质多样性性质，本发明设定了采用PH压力，通过在适宜生长培养基多次传代驯化 或选择在高pH条件下有效产出生产FMDV VLP的细胞。
[0229] 在培养基直接加入碱、无菌过滤调节Sf-900II培养基到pH 6. 6 - 6. 8足以说明起 初的调高pH可有效提高FMDV VLP产出，但pH提高到一定水平，培养基有可见显著的培养 基组分沉淀，这种pH诱导的沉淀现象导致培养基在贮存过程的不稳定，降低Sf21细胞生长 速率和活性，因此有必要改良培养基配方使pH范围适合细胞的正常生长。调pH过程中，磷 酸缓冲液的磷酸钙和其他双价阳离子有可能形成沉淀。为此（BES)作为缓冲液，减少磷酸 浓度，采用改良了培养基Sf-90011-BES-MISS。除此Sf-900II培养基，无血清BaculoGold Max-XP(BD Biosciences)、和ESF-921 (Expression Systems)培养基在减小磷酸浓度、增高 pH条件下都能提高细胞的增长速率。其他的缓冲液，包括MOPS、HEPES、TES，在30 - 40mM浓 度范围可减少培养基的磷酸、对细胞无毒性且具有缓冲作用。
[0230] Sf-90011-BES-MISS生长培养基和标准培养基在培养pH7. 0-7. 4时，沉淀最少，可 使Sf21细胞在较大的pH范围获得驯化和适应，经过长达8周连续从pH6. 0到7. 4(每步 0. 2pH单位）不断提升的pH压力选择，获得了稳定的高pH7. 0-7. 4适应的昆虫细胞，冷冻保 存，为区别母本细胞sf21，命名为SfHpH。Sf21细胞起初暴露在pH6. 2的培养基培养时，胎盘 蓝染色分析观察细胞总数和活性略微下降，但仍约为89%的细胞是活的。通过驯化活细胞 可恢复到96 - 98%，具有常规pH培养时稳定性。揭示及时压力选择和长期压力诱导使细胞 长时间的耐受，获得驯化和适应。根据Vi-CELLXR电子显微图像和数据统计分析，SfHpH细 胞平均直径3. 5 μ m，大于母本细胞。SfHpH的体积19. 3 ±0. 2 μ m，Sf 21体积15. 8 ±0. 1 μ m， 增大82%。pH适应的细胞群与母本细胞平均直径的差异具有显著性（12次独立样本的2 样本t-检验，p小于0. 01)。
[0231] SfHpH细胞二碘化丙锭（PI)染色，在普通荧光显微镜下暴露国定信号强烈.用流 式细胞仪分析，SfHpH细胞Gl期细胞平均荧光密度高出母本细胞的sf21细胞1. 9倍。这 种细胞大小分布的变化和核酸浓度提高（约为2N)，与Sf9、Sf21适应到高温度环境的观察 结果一致。pH压力选择和驯化适应方法驯化改造昆虫细胞尚未见报道。
[0232] SfHpH在标准的昆虫细胞pH条件下仍保持了正常的生长能力，但在pH 7. 2时生 长速度翻倍，之后PDT略微提高。Sf21H)TpH 6. 6开始提升，在pH 7. 0-7. 4时，PDT显著提 升，说明昆虫杆状细胞对pH升高的敏感。SfHpH pH正常生长范围的扩展说明细胞已经对pH 的耐受形成了新的真正适应的细胞群。SfHpH平均细胞直径、培养活性、生长速率在适应后 30代次传代内稳定（约经历90次群落倍增），在连续培养传代过程中没有观察到表型不稳 的现象。
[0233] SfHpH在高的培养pH下驯化适应可正常生长，但这种在特殊的培养条件下高效细 胞生长对杆状病毒生产重组产品未得到验证。为确定pH驯化是否提高FMDVVLP的产出， Sf21和SfHp细胞在改良的高pH条件下分别感染AcMNPV-FMDV 0mP12A并生产口蹄疫病毒 样颗粒，SfHpH生产的FMDVVLP产量高于其母本细胞Sf21 ((二样本t检验，p小于0. 01)， 且在摇瓶小量培养到摇瓶大量培养的放大中以及搅拌式生物反应器从小到大的培养中， SfHpH生产的FMDV VLP产量高于其母本细胞Sf21 ((二样本t检验，p小于0. 01)。SfHpH 生产的VLP可达28mg/L，BHK-21生产的FMDV VLP 31mg/L，二者产量无显著差异（二样本t 检验，P = 〇· 50)。
[0234] SfHpH每百万细胞可产9 μ g VLP，而BHK-21每百万细胞可产8 μ g VLP，SfHpH和 BHK-21细胞的出芽VLP产量类似，二样本t检验，p = 0. 43。
[0235] SfHpH生物反应器悬浮感染培养使大量的FMDV VLPs大量表达，获得15-20%的 纯化VLP。蔗糖梯度超速离心和免疫印迹检测显示从SfHpH培养、纯化VLPs的浮力密度与 BHK-21细胞生产的标准VLP浮力密度相似。动力光散（DLS)分析，SfHpH生产的VLP平均直 径为65. 8 ±2. 2nm，BHK-21生产的标准VLP平均直径为63. 7 ±2. 4nm，二者无显著差异（二 样本t检验，p = 0. 19)。SfHpH生产VLPs和BHK-21细胞生产的标准VLPs电子密度稍微有 些差别，但颗粒大小，二十面体对称性和结构二者相似。SfHpH纯化后的收集液中在电镜下 观察，视野中含97%的FMDV VLP，含3%的残余杆状病毒。经SDS-PAGE纯度分析为83%， 与BHK-21生产的标准VLP纯度相当。
[0236] 5. 4高pH适应的SfpH细胞生产病毒样颗粒疫苗免疫原性
[0237] SfHpH生产VLPs和BHK-21细胞生产的VLPs在生物物理性质上类似，因此对作为 疫苗免疫原的适合性进行了研究。
[0238] SfHpH生产的VLPs抗原和BHK-21细胞生产的VLPs抗原，用目前现行口蹄疫疫苗 佐剂ISA-V206或ISA-V201乳化制成不同抗原含量疫苗。采用10倍上升剂量免疫豚鼠，每 剂0. 01 μ g-ΙΟ μ g，注射2剂，间隔二周。SfHpH生产的VLPs疫苗和和BHK-21细胞生产的 VLPs疫苗免疫豚鼠14天后加强免疫。免疫前、免疫后21天血清中抗FMDV抗体（0型口蹄疫 病毒/Mya98-XJ-2010株的中和活性）进行比较。1 μ g和10 μ g免疫组1剂免疫，抗FMDVIgG ELISA滴度对比免疫前背景显著提高（p小于0.05)，但0型口蹄疫病毒/Mya98-XJ-2010株 的中和活性没有提高。2剂免疫后，中和活性随剂量从0. 01 μ g提升到1 μ g，中和活性稳定 攀升，说明疫苗的最小剂量在1-10 μ g之间。
[0239] SfHpH生产VLP疫苗和BHK-21细胞生产的VLPs疫苗1剂或2剂免疫豚鼠的血清 抗FMDV IgG经检测，ELISA滴度无显著差异（剂量配伍的Kruskal-Wallis检验和Dunn' s post检验），这种总体免疫原性的相似确证了重组杆状病毒感染的SfHpH细胞生产重组 FMDV VLPs，也是哺乳动物细胞BHK-21表达口蹄疫病毒样颗粒生产疫苗的候备方法。
【主权项】
1. 一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，通过以下方法制备得到：将口蹄疫病毒 衣壳前体蛋白P12A cDNA序列克隆到真核表达载体中，所得的重组质粒转染哺乳动物细胞， 使其表达口蹄疫病毒衣壳蛋白并组装成口蹄疫病毒样颗粒，纯化、乳化，即得； 其中，所述的衣壳前体蛋白P12A的结构蛋白VPl在原始口蹄疫病毒VPl蛋白基因的基 础上进行了以下位点的突变：Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A连接处Lys210 - Glu。2. -种口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，通过以下方法制备得到：将口蹄疫病毒 衣壳前体蛋白P12A cDNA序列克隆到杆状病毒转移载体pFastBacl中，所得的重组杆状转 移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，得到重组杆状质粒，重组杆状质粒转染Sf21昆 虫细胞产生感染性重组杆状病毒，重组杆状病毒转染SfHpH细胞，使其表达口蹄疫病毒衣 壳蛋白并组装成口蹄疫病毒样颗粒，纯化，乳化，即得； 其中，所述的衣壳前体蛋白P12A的结构蛋白VPl在原始口蹄疫病毒VPl蛋白基因的基 础上进行了以下位点的突变：Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A连接处Lys210 - Glu ;所 述的SfHpH细胞为无血清培养基培养pH7. 0-7. 4适应的昆虫细胞Sf21。3. 根据权利要求1所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述的真核表达载体 为pTT5或pVIJNS ;所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。4. 根据权利要求2所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述的SfHpH细胞采用 以下方法驯化得到：Sf21细胞首先用pH 6. 0的无血清培养基完全换液，之后每隔2-5天用 调节好pH的无血清培养基换液，经过2月连续从pH6. 0到7. 4,每次提高0. 2pH单位，不断 提升Sf21细胞的pH压力选择，获得了无血清培养基培养pH7. 0-7. 4适应的稳定的昆虫细 胞Sf21，即为SfHpH细胞。5. 根据权利要求2或4所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述的无血清培 养基为 Sf-90011-BES-MISS 培养基，Sf-90011-BES-MISS 培养基含 50mMN, N-双（2-羟乙 基）-2_氨基乙磺酸、124mM鹿糖、5mM葡萄糖、50mM氯化钠、20mM氯化钾、3mM氯化|丐、IOmM 硫酸镁、0. 1% w/v嵌段式聚醚F-68。6. 根据1-5任一项所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述的口蹄疫病毒为 来源于猪、牛、羊以及骆驼的O型口蹄疫病毒。7. -种制备权利要求1所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗的方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 合成口蹄疫病毒病毒全长传染性cDNA基因，基因合成后，克隆到改造的 pGEMR-7Zf [-]质粒，制成重组质粒 pGEM-FLOSFS ; (2) 以重组质粒pGEM-FLOSFS为模板，合成口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P12AcDNA序列，插 入质粒PGEM-3Z，制成重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A ; (3) 以重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A为模板，采用PCR方法进行口蹄疫病毒衣壳前体蛋 白 P12A 的结构蛋白 VPl 基因 Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A 连接处 Lys210 - Glu 的突 变，突变后产物连接到PGEM-3Z克隆质粒上，制成重组质粒pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、 VP1E83K、VP1C134S)，重组质粒在在大肠杆菌DH5 a扩增，纯化，测序确认； (4) 重组质粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、VP1E83K、VP1C134S)用 Nhe I 和 Not I 酶切，酶切产物亚克隆至真核表达载体PTT5或pVIJNS中，制成重组质粒pTT5-mP12A或 pVlJNS-FMDV0mP12A，重组质粒在在大肠杆菌DH5 a扩增，纯化，测序确认； (5)重组质粒pTT5-mP12A或pVlJNS-FMDV0mP12A转染BHK-21细胞，经无血清悬浮培养 后离心收集上清，经纯化制得口蹄疫病毒样颗粒，乳化，即得。8. -种制备权利要求2所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗的方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 合成口蹄疫病毒病毒全长传染性cDNA基因，基因合成后，克隆到改造的 pGEMR-7Zf [-]质粒，制成重组质粒 pGEM-FLOSFS ; (2) 以重组质粒pGEM-FLOSFS为模板，合成口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P12AcDNA序列，插 入质粒PGEM-3Z，制成重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A ; ((3)以重组质粒pGEM-3Z-0-Pl-2A为模板，采用PCR方法进行口蹄疫病毒衣壳前体蛋 白 P12A 的结构蛋白 VPl 基因 Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A 连接处 Lys210 - Glu 的突 变，突变后产物连接到PGEM-3Z克隆质粒上，制成重组质粒pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、 VP1E83K、VP1C134S)，重组质粒在在大肠杆菌DH5 a扩增，纯化，测序确认； (4) 重组质粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、VPlE83K、VPlC134S)用 Nhe I 和 Not I酶切，酶切产物亚克隆至克隆到杆状病毒转移载体pFastBacl中，制成重组质粒 pFast-Bac-FMDV0mP12A，重组杆状病毒DNA制备是使用Bac-to-Bac系统Tn7,在大肠杆菌 DHlOBac感受态细胞转位获得重组杆状质粒；重组杆状质粒使用Cellfectin-II转染Sf21 细胞产生感染性重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A ; (5) 重组杆状病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A转染SfHpH细胞，经无血清悬浮培养后离心收 集上清，经纯化制得口蹄疫病毒样颗粒，乳化，即得。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤⑴所述的改造的 pGEMR-7Zf[-]质粒为采用快速定点试剂盒在质粒pGEMR-7Zf(_)多克隆位点进行定点突 变形成NdeI、NheI、N 〇tI、SpeI限制酶切位点；步骤（2)所述的合成口蹄疫病毒衣壳前体蛋 白P12A cDNA序列的引物序列为SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，或者为SEQ ID N0:1 和SEQ ID NO: 3所示；步骤（3)所述的PCR方法中的引物序列为SEQ ID NO: I-SEQ ID NO: 9 所示。10. 权利要求1-6任一项所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗在制备预防或防治口蹄疫药物 中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法。本发明首先通过表达P12A(3个氨基酸位点突变，VP1K210E、VP1E83K、VP1C134S)和无血清悬浮培养，建立类似自然的75S？FMDV病毒样颗粒(VLP)标准，并提高了病毒样颗粒的产量。本发明进一步提供了一种无血清悬浮培养、高pH驯化昆虫细胞，该昆虫细胞可稳定、高效生产FMDV？VLP，生产的VLP大小和结构类似标准BHK-21上生产的VLP，产量高出母本细胞Sf21的11倍。VLP制备疫苗免疫动物产生IgG抗体反应。IgG抗体滴度、口蹄疫病毒中和抗体滴度和BHK-21制备的VLP疫苗免疫所产生的无显著差异。这表明这种高pH适应昆虫细胞可用于FMDV？VLP的疫苗生产。
【IPC分类】A61K39/135, C12N15/85, A61P31/14, A61K9/16
【公开号】CN105126096
【申请号】CN201510568131
【发明人】张澍, 吕宏亮
【申请人】吕宏亮, 张澍
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月8日