富含加兰他敏的凤蝶朱顶红的提取物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及来自朱顶红属（genusHippeastrum)的提取物的组合物 (composition)以及它们的成分在药物和食品工业中用于生产药物和饮食增补剂（dietary supplement)的应用。
【背景技术】
[0002] 根据目前技术水平已知朱顶红属（石蒜科（Amaryllidaceae))中的物种（种）是 显示出其生物碱组合物中显著变化的大型热带植物（Rev.Latinoamer.Quim. 2012, 40:83)。 还已知石蒜科的不同物种如夏雪片莲（Leucojumaestivum)、大花雪花莲（Galanthus elwesii)和雪花莲（G.nivalis)中的生物碱的组合物（成分）和浓度存在显著种内变化 (Chem.Biodiv. 2011，8:115 ;Biochem.Syst.Ecol.，2013, 46. 152)，但是在朱顶红属的物种 或栽培品种内还没有发现这种变化的证据。
[0003] 根据目前技术水平，已知来自朱顶红属的提取物的组合物包括以下生物碱：加 兰他敏（雪花胺，galanthamine)、雪花碱、石蒜碱（lycorine)、蒜碱（hippamine)、水仙 定（narcissidine)、小星蒜碱、网球花胺（haemanthamine)、文殊兰定（crinidine)、坡威 灵和多花水仙喊（tazettine)(ArchivderPharmazieundBerichtederDeutschen PharmazeutischenGesellschaft1962,295:920)〇
[0004] 根据目前技术水平，已知来自朱顶红属的提取物的组合物包含生物碱：2, 7-二甲 氧基高石蒜碱、candimine、多花水仙碱、前多花水仙碱（pretazettine)、epimacronine、网 球花胺、扁担叶喊（hamayne)和triphaeridine(Magn.Res.Chem. 2011，49:668)。
[0005]还已知来自朱顶红属的提取物的组合物包含生物碱：朱顶红定碱（hippadine)、 顶红星碱（hippacine)、小星蒜碱、条纹小星蒜碱、滨生全能花星碱（pancracine)和多花水 仙喊（PlantaMedica1975,28:336)。
[0006] 就我们所知，还没有通过分析技术如气相色谱-质谱分析法（GC-MS)或高压液相 色谱（HPLC)测量的朱顶红属提取物的生物碱组合物中生物碱百分比的数据。
[0007] 文献中还没有从朱顶红属工业生产加兰他敏的数据。
[0008]加兰他敏（化学式A)是由石蒜科植物包括雪花莲属、水仙（Narcissus)、 雪片莲（Leucojum)和石蒜属（Lycoris)的相对小的植物产生的已知的天然生物碱 (Biotechnol. &Biotechnol.Eq. 2009:1170)。加兰他敏是具有止痛和抗氧化性质的可逆胆 碱酯酶抑制剂（AChE)。它用于治疗阿尔茨海默氏病（Drugs2000,60:1095)以及对酒精、毒 品和尼古丁的依赖性（美国专利5, 643, 905)。W0/2010/025485专利描述了加兰他敏氢溴 酸盐在生产治疗青光眼的药物中的应用。EP0236684专利描述了加兰他敏或其类似物用于 治疗阿尔茨海默氏病的应用。根据专利W0/2006/099635,加兰他敏从生物材料，优选从雪花 莲属、水仙（Narcissus)、雪片莲（Leucojum)和/或石蒜属（Lycoris)的植物中分离。
[0009] 还已知适用含有加兰他敏并且特别地夏雪片莲（Leucojumaestivum)提取物的饮 食增补剂来改善运动员的肌肉力量和耐力（W02000041540)。
[0010] 那维定（Narwedine)(化学式B)是另一种已知的可逆胆碱酯酶抑制剂（Proteins 2001，42:182)，其用作加兰他敏合成的前体（W02005/030713)。
[0012] 网球花胺（化学式C)是另一种已知的生物碱。已显示在微摩尔浓度，这种重要的 分子在肿瘤细胞中是细胞凋亡的有效诱导剂（Phytochemistry2007, 68:1068)，并因此，近 年来已成为密切研究的主题。
[0013] 专利W0/2006/099635中描述的从加兰他敏植物来源获得的已知组合物的缺点 是它们含有大量相伴的生物碱，所述生物碱影响其分离和/或具有有毒影响，因此来自这 些植物的提取物用于制备药物和饮食增补剂的直接应用是不希望的。例如，在不同的夏雪 片莲（1^11(3〇加1113681：；[￥11111)种群中，加兰他敏在干重的0.03至0.4%的范围内，并且伴有 大量的石蒜喊、尚石蒜喊和8 -0-脱甲基尚石蒜喊（Biochem.Syst.Ecol.，2013, 46:152)。 种植用于生产加兰他敏的黄水仙（Narcissuspseudonarcissus)栽培品种"Carlton"主 要是营养繁殖，并因此具有低遗传变异性（HanksG. 2002,Narcissusanddaffodil,the genusNarcissus,Taylor&Francis,LondonandNewYork,p.53)。该水仙栽培品种中只 有球茎作为用于加兰他敏生产的原材料使用，但是它们还含有大量的网球花胺和水仙环素 (Phytochemistry2013,88:43)。从石蒜球莖（Lycorisradiatabulbs) (Helv.Chim.Acta 2011，94:178)，在中国作为加兰他敏来源栽培的植物中分离了加兰他敏、石蒜碱和石蒜裂 碱以及其它十一种生物碱。
[0014] 专利W0/2006/099635中所述的作为加兰他敏来源的植物的主要缺点是它们尺寸 小、生长期短并且生理休眠期长。
[0015] 发明的技术特征
[0016] 本发明提供了来自朱顶红属（genusHippeastrum)的提取物的组合物 (composition)，如通过GC-MS所确定的，其包含来源于朱顶红属总提取物的以下成分： 40%至98%的加兰他敏，0. 01%至35%的网球花胺，0. 01%至10%的那维定（narwedine) 和/或0. 001 %至35 %的来自高石蒜碱、和/或多花水仙碱、和/或山小星蒜碱 (montamine)、和/或水仙环素（narciclasine)和/或石蒜碱型的其它生物碱，和/或 0. 001 %至1 %的非生物碱植物代谢物。
[0017] 本发明的主题，来自朱顶红属的提取物的组合物可以是干燥的或者液体的完全或 部分纯化的提取物的一部分，并且通过适合的提取方法和溶剂获得。来自朱顶红属的完全 或部分纯化的提取物的非生物碱成分可以在1至99%的范围内。
[0018] 来自朱顶红属的提取物的组合物由通过常规技术或者作为溶液培养或者通过生 物技术方法，在不同地理区域户外或在温室内生长的选择的完整植物或植物器官获得。用 清水清洗原料并将其在空气中干燥。此后，将植物机械切割至l_5cm大小，并在用于干燥水 果的具有循环热空气的常规设备中进行干燥。在15°至85°C的温度下干燥5至96小时， 直至生物质的最终含水量小于15%。当使用新鲜植物材料工作时，可以在切割后直接进行 提取。使用常规工业磨机，将植物材料研磨至85微米至3_颗粒大小。
[0019] 为了获得朱顶红属提取物的组合物及其成分，可以对植物材料进行用于生物碱的 液-液提取的常规程序。将在干燥草本中含有0. 05%至2. 0%之间的加兰他敏的干燥并且 细磨的完整植物或植物器官（叶、球茎（bulb)和根）或新鲜植物加载到渗滤器系统中并用 0. 1-5% (v)的无机酸（例如，硫酸、磷酸等）水溶液逆流提取。用1-10%的氢氧化钾或其 它碱的水溶液使初步提取物变为碱性至pH8-9,并用不溶于水的有机溶剂如氯仿、二氯甲 烷等提取。用水清洗有机溶剂，然后用0.1-5% (v)的无机酸的水溶液提取生物碱。在用 1-10%的氢氧化钾或其它碱的水溶液将所述水溶液碱化至pH8-9后，通过用水不溶性有 机溶剂如氯仿、二氯甲烷、己烷、苯、乙酸乙酯等提取获得朱本发明主题的顶红属提取物的 组合物及其组分。在真空下使溶剂蒸发后，朱顶红属提取物中存在的生物碱处于碱的形式。 可以在有机溶剂蒸发前，通过加入适合的酸将它们转化为药用盐。允许对所述组合物进行 其它化学或物理改性，如衍生化（derivatization)(例如，酯化）或者冷冻以获得具有改变 的物理和/或化学性质的副产物。
[0020] 可以通过其它常规方法如浸渍获得或者通过微波、超声或超临界二氧化碳提取和 /或用于提取的膜技术获得本发明主题的朱顶红属提取物的组合物及其成分。多种有机溶 剂和水可以用于提取，用多种有机和无机酸和碱来控制pH为1至12。
[0021] 可以通过色谱方法（如制备液相色谱、分配色谱法等）实现朱顶红属提取物各种 成分的分离和纯化。
[0022] 可以以游离形式或以例如通过加入无机酸或有机酸例如氢溴酸获得的盐的形式 优选以药用盐的形式使用如上所述的加兰他敏和生物碱组合物。还可以在化学或物理改性 后使用。
[0023] 通过文献（Talanta2011,83:1455)中所述的方法进行植物材料以及朱顶红属提 取物组合物及其成分的质量和数量控制。用含有50微克可待因作为内标的lml甲醇提取来 自朱顶红属的干燥植物材料（50mg)。将混合物在60°C提取30分钟，并在离心后，分离800 微升上清液并蒸发。将所得固体溶解在500微升2%H2S04中并用500微升氯仿提取三次。 然后，用25%的氨溶液使水相变为碱性至pH8-9,并用氯仿提取生物碱。在蒸发有机溶剂 后，在气相色谱-质谱分析法之前将干燥的提取物溶解在甲醇中。
[0024] 在用于预防或治疗使用AChE抑制剂控制的多种疾病的药物生产中使用朱顶红 属提取物的组合物及其组分。这些包括轻度