养于Ibidi?小室中，用来人为模拟 伤口的情况。
[0167] 成纤维细胞与浓度为lmg/mL的低聚糖共同孵育，通过视频-显微镜监测细胞迀移 情况，监测48小时。进而重组细胞迀移的轨迹。
[0168] 可以清晰地知道：通过实施本发明的方法得到的低聚糖组分为中性低聚糖，其截 留分子量分别位于5, 000至15, OOODa之间，以及15, 000至50, OOODa之间的两个区间，可 以有效地促进细胞迀移，包括体外人为创伤的快速愈合。
[0169] 例7 :亚麻籽中提取的低聚糖对m铟和IV铟胶原合成的影响。
[0170] 此处已经证明：从亚麻籽中提取的含有中性低聚糖的成分显著提高了胶原的合成 量，特别是提高了成纤维细胞进行组织修复过程中III型胶原的合成。
[0171] 体外培养成人皮肤成纤维细胞，并用亚麻籽中提取的低聚糖成分刺激24小时（图 7A)和48小时（图7B)，浓度为lmg/mL。回收培养液上清液，III型胶原的量由商用的ELISA 试剂盒测定。
[0172] III型胶原合成的结果见图7。
[0173] 该图明确地显示出样品包含了由超滤分离获得的两类截留分子量的中性低聚糖， 其中一类的截留分子量位于5, 000至15, OOODa之间，另一类的截留分子量位于15, 000至 50, OOODa之间。所述根据本发明方法获得的样品可以显著促进成纤维细胞合成III型胶原。
[0174] 另有实验表明亚麻籽中提取的中性低聚糖可以促进成纤维细胞合成IV型胶原。
[0175] 具体说来，人真皮成纤维细胞在体外培养至汇合阶段，随后与不同样品孵育24小 时，所述样品即为通过实施本发明的方法得到的二次和三次透过液中的低聚糖组分。组分 的浓度为lmg/mL。
[0176] 培养上清液进行回收，分别分析培养上清液和细胞层中的IV型胶原。
[0177] 结果如图8所示，通过超滤分离得到的两类截留分子量的低聚糖组分能够激活IV 型胶原的合成，该组分其中一类的截留分子量位于15, 000至50, OOODa之间，另一类的截留 分子量位于5, 000至15, OOODa之间。该效果十分有益，因为IV型胶原是基底膜的基本组分 之一，且在衰老过程中，该组分的合成趋于减少。
[0178] 例8 :亚麻籽中提取的中件低聚糖对小蛋白多糖合成的影响。
[0179] 名为蛋白多糖的化合物，即SLRPs(小的富含亮氨酸的蛋白多糖），对细胞活性的 调节以及皮肤功能性质的组织起到重要作用。
[0180] 具体来说，核心蛋白聚糖和基膜聚糖是重要的蛋白多糖。核心蛋白聚糖在成人皮 肤中含量丰富且在稳态的调节中起着关键的作用。随着年龄的增长，皮肤中核心蛋白聚糖 的量也增加。相反，基膜聚糖的量往往随着年龄的增长而减少。基膜聚糖具有保持皮肤功 能特性的作用。
[0181] 为了确定据本方法从亚麻籽中提取的中性低聚糖对这些小蛋白多糖合成的影响， 进行了以下实验。
[0182] 成纤维细胞加入亚麻中提取的中性低聚糖孵育24小时，孵育浓度为lmg/mL。
[0183] 提取成纤维细胞中的RNA，并进行一系列的RT-PCR，以评价编码核心蛋白聚糖和 基膜聚糖的合成的基因表达水平。以GAPDH基因的表达作为阳性对照。
[0184] 结果如图9所示。结果显示，从亚麻中提取的中性低聚糖可以导致真皮成纤维细 胞中核心蛋白多糖的合成下降，基膜聚糖基因表达反而升高。
[0185] 因此，在衰老的皮肤中引入据本发明方法得到的中性低聚糖可以使皮肤有更年轻 的表型，所述低聚糖即为通过超滤分离得到的截留分子量分别位于5, 000至15, OOODa之 间，以及15, 000至50, OOODa之间的中性低聚糖。
[0186] 例9 :亚麻籽中提取的中件低聚糖对角质形成细朐的作用。
[0187] 光学显微镜下观察发现，亚麻籽中提取的中性低聚糖的组分对表皮角质形成细胞 具有积极作用。
[0188] 具体说来，中性低聚糖诱导角质形成细胞的分化，而角质形成细胞发生变化的特 征即为其形态学的变化。
[0189] 使用多种不同的分化标志物进行免疫细胞化学实验，如外皮蛋白（颗粒层的标志 物），或丝聚蛋白和兜甲蛋白（表皮角质层的标记物），显微镜下观察到的结果也证实了这 一结论（结果未显示）。使用据本发明的方法从亚麻籽中提取的中性低聚糖处理后，有效地 刺激了角质形成细胞中这些标志物的表达。
[0190] 刺激角质形成细胞的分化有利于提高保护皮肤抵御外界侵袭的能力。
[0191] 当然，本发明并不局限于上述的实施例说明和描述，在不偏离本发明目标的范围 内，可以进行变动和修饰而不受限制。
【主权项】
1. 一种从亚麻籽中提取中性低聚糖混合物的方法，所述低聚糖具有高分子量，所述方 法包括以下步骤： -亚麻粘胶溶液进行酸性pH条件下的水解反应，所述亚麻粘胶溶液由亚麻籽经溶剂萃 取而得； -所述溶液通过加入足量的碱进行中和； -所述溶液通过孔径为50, OOODa的滤膜进行第一次超滤，以获得首次回流液和首次透 过液； -所述首次透过液通过孔径为15, OOODa的滤膜进行第二次超滤，以获得二次回流液和 二次透过液； -所述二次透过液通过孔径为5, OOODa的滤膜进行第三次超滤，以获得三次回流液和 三次透过液； -将所述二次和三次回流液混合，以获得上文所述的低聚糖混合物，所述二次回流液含 有通过超滤分离方法得到的截留分子量位于15, 000至50, OOODa处的低聚糖，所述三次回 流液含有通过超滤分离方法得到的截留分子量位于5, 000至15, OOODa处的低聚糖。2. 根据权利要求1所述的方法，其中从亚麻籽中萃取的步骤在水溶剂中进行。3. 根据以上任一权利要求所述的方法，其中粘胶溶液的水解反应条件为：pH2,反应温 度80°C，反应时间24小时。4. 根据以上任一权利要求所述的方法，其中所述粘胶溶液通过加入足量的强碱进行中 和，可选的强碱溶液至少包括氢氧化钡和氢氧化钠。5. 实施以上任一权利要求所述的方法从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，其中所 述混合物包含由超滤分离方法得到两类截留分子量的低聚糖，其中一类的截留分子量位于 15, 000至50, OOODa之间，另一类的截留分子量位于5, 000至15, OOODa之间。6. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，其中所述混合 物中含有的低聚糖，其糖链组成中至少包括岩藻糖和/或果胶糖和/或半乳糖和/或葡萄 糖和/或木糖。7. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，其中所述混合 物包含一类低比例的低聚糖，该低聚糖的糖链组成中含有鼠李糖和低比例的糖醛酸。8. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于在皮肤美 容或化妆品中使用，以对抗皮肤衰老的影响或促进皮肤组织修复。9. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于刺激成纤 维细胞的增殖。10. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于刺激成 纤维细胞的趋化。11. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于刺激成 纤维细胞的细胞迀移。12. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于刺激成 纤维细胞合成III型胶原或IV型胶原。13. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于刺激成 纤维细胞合成基膜聚糖以及抑制成纤维细胞合成核心蛋白聚糖。14. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于诱导角 质形成细胞分化。15. 根据上述任一权利要求所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于促进伤 口愈合。16. 含有上述任一权利要求所述的中性低聚糖混合物的化妆品或皮肤用药成分，含有 至少用于化妆品或皮肤科用药的赋形剂。17. 根据上述权利要求16所述的化妆品成分，其中中性低聚糖的浓度在0. 1至5mg/mL 之间。18. 根据上述权利要求1-7之一所述的亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于药物 中。19. 根据上述权利要求之一所述的从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物，用于促进组 织愈合，即应用于慢性溃疡或手术后用药。
【专利摘要】本发明涉及一种从亚麻籽中提取中性低聚糖混合物的方法，所述低聚糖混合物由超滤分离方法获得，具有高分子量，包含两类截留分子量的低聚糖，其中一类的截留分子量位于15,000至50,000Da之间，另一类的截留分子量位于5,000至15,000Da之间。本发明还涉及一种实施所述方法得到的低聚糖混合物，以及所述混合物的应用，尤其是在皮肤修复以及控制皮肤衰老中的应用。
【IPC分类】A61K8/00, A61K36/55
【公开号】CN105246498
【申请号】CN201480023810
【发明人】佛朗索瓦·马库特, 乔治斯·贝罗, 克莱尔·马歇尔, 伊莲·杜卡特, 奥利弗·迪皮伊, 鲁克·皮克顿, 迪迪尔·勒塞尔夫, 雷诺·福贝斯
【申请人】兰斯大学, 法国国家糖产品中心, 鲁昂大学, 范德普特油脂化学公司, 国家科学研究中心
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年4月24日
【公告号】CA2909792A1, EP2988765A1, US20160101120, WO2014174220A1