均为Invitrogen公司产品；
[0040] 哺乳动物双杂交系统CheckMate? Mammalian Two-Hybrid System和焚光素酶检 测试剂盒 ONE-Glo? Luciferase Assay System 为 Promega 公司产品；
[0041] 目的基因序列PPARY由广州复能基因有限公司合成；
[0042] 细胞培养瓶及96孔板为NUNC公司产品；
[0043] 化合物库来自天津国际生物医药联合研究院高通量药物筛选中心。
[0044] 实施例1 :基于哺乳动物细胞单杂交技术的高通量药物筛选模型的建立
[0045] 目的蛋白PPARy是一种在细胞内表达的重要的核受体，是调节脂肪细胞分化的 重要转录因子，在机体的多种生理功能中起关键作用。为了筛选新的PPARy调节剂，本研 究建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因技术的高通量PPARy调节剂筛选模型。利用 基因合成的方法合成目的蛋白PPARy的配体结合区（PPARy-LBD)基因序列，并插入含 GAL4DNA结合域的pBIND表达质粒构建pBIND-GAL4-PPAR γ -LBD的嵌合表达质粒。该质粒 与含GAL4响应元件和荧光素酶的报告质粒pG51uc质粒共转染，通过测定荧光素酶的活性 评价PPARy调节剂的转录调剂的活性。经过多种条件优化，激动剂阳性药噻唑烷二酮类 药物（TZDs)中的匹格列酮对照可以剂量依赖地诱导荧光素酶的表达，最大下调倍数为6. 3 倍，EC50为0. lmol/L。该筛选模型可微量化于96孔板，且Z'因子均大于0. 5。该模型灵 敏、稳定，可以快速进行多种来源的PPARy调节剂的筛选和活性评价。
[0046] (1)相关质粒构建与制备
[0047] 本研究选用的为目的蛋白PPAR γ的配体结合区（PPAR γ -LBD)，此区域包括D区和 E/F结构区，其中D区为辅助因子结合区；E/F结构区包含两个重要区域，一个是配体结合区 或Ε区，在二聚体形成及核定位中起重要作用，另一个是依赖配体的转录激活区或F区，在 PPAR γ辅助因子的利用中起关键作用。
[0048] 目的蛋白PPARy的配体结合区（PPARy-LBD)的基因序列为PPARy基因序列 (ΝΜ_015869· 4)全长的第625位至1434位。
[0049] 本研究所采用的核心技术为基于哺乳动物细胞水平的单杂交技术，所采用的核心 报告系统为米购于promega公司的CheckMate? Mammalian Two-Hybrid System(promega) 〇 采用了其中的pBIND Vector和pG51uc Vector。附图2所示为载体pBIND基因图谱，载体 pBIND为哺乳动物细胞蛋白质表达载体，核心区域为GLA4融合蛋白区和MCR区即多克隆位 点区，将目的蛋白质基因插入到MCR区，这样构建成融合蛋白GAL4-目的蛋白的基因表达序 列。附图3所示为载体pG5基因图谱，核心区域为GAL4结合位点区和荧光素酶表达基因区。
[0050] 采用分子克隆技术将目的蛋白PPAR γ的配体结合区（PPAR γ -LBD)的基因序列克 隆至哺乳动物细胞单杂载体pBIND之中，构建成哺乳动物细胞单杂重组质粒pBIND-LBD。
[0051] (2)药物筛选模型的建立
[0052] 技术路线：如附图4所示，包括以下6个步骤。
[0053] 本研究拟采用转染效率较高，易于培养的哺乳动物细胞293T，将293T细胞以每孔 1. 5xl04个细胞均一的培养于96孔板中。
[0054] 采用已报导的PPARy激活剂噻唑烷二酮类药物中的匹格列酮作为阳性对照组的 激活剂。
[0056] 采用MTT比色法寻找待测药物对细胞没有毒性伤害的药物浓度即无损伤浓度。
[0057] 构建好的哺乳动物细胞单杂重组质粒pBIND-LBD中包含酵母细胞转录因子GAL4 的DNA结合结构域（DBD)的基因序列和PPARy的依赖配体的转录激活区PPARy-LBD的 基因序列，将重组质粒pBIND-LBD与含有GAL4特异响应元件的荧光报告质粒pG51uc采用 瞬时转染的方法共同转染至哺乳动物细胞293T中。采用的转染试剂为LipofectamineTM 2000Reagent〇
[0058] 加入待测药物，使用荧光素酶检测试剂盒测定报告基因荧光素酶的表达水平。
[0059] 实验中每个96孔板设立加入匹格列酮的阳性对照组和不加任何药物的空白对照 组，每个药物筛选组设立3个复孔，高通量筛选本实验室已有的化合物库。并计算药物对 PPARy的相对激动活性，计算方法为：
[0060] 药物的相对激动活性=(给药组的荧光强度-空白对照组的荧光强度）八匹格列 酮组的荧光强度-空白对照组的荧光强度）
[0061] (3)实验结果
[0062] a)药物筛选模型建立数据结果
[0063] MTT比色法寻找匹格列酮对细胞没有毒性伤害的药物浓度即无损伤浓度，结果见 附图5。筛选匹格列酮对报告基因荧光素酶的表达水平激活最高时的药物浓度，结果见附图 6。综合上述数据可得：在对细胞损伤允许范围内匹格列酮在25 μ Μ时对报告基因荧光素酶 的表达水平激活最高。同时检测了待测的化合物对293Τ细胞的毒性，发现在25 μ Μ浓度时 各个待测药物对293Τ细胞均没有明显毒性。
[0064] 因此在高通量药物筛选实验中，匹格列酮及待测药物浓度均选择为25 μ Μ进行测 试。
[0065] b)药物筛选结果
[0066] 基于哺乳动物细胞水平的单杂交技术的高通量药物筛选技术筛选化合物库中对 PPAR γ有激动活性的化合物。通过对化合物库的筛选，发现1401、1402、1403、1404、1413等 一系列的丙酰胺类化合物，对PPARy有较好的激动活性。与阳性药匹格列酮比较，计算化 合物对PPAR γ的相对激动活性。
[0067] 化合物对PPAR γ的相对激动活性如表1所示：从表1中可以看出，筛选出的1401、 1402、1403、1404、1413等丙酰胺类化合物对PPAR γ具有不同程度的激动活性。
[0068] 表1.化合物对PPAR γ的相对激动活性（阳性药为匹格列酮，药物浓度为25 μ Μ)
[0071 ] 实施例2 :生物质谱法验证化合物与目的蛋白相互作用 [0072] (1)目的蛋白PPAR γ-LBD的表达和纯化
[0073] a)原核表达重组质粒的构建
[0074] 具体步骤包括：
[0075] ①将PPARy蛋白的配体结合区PPARy-LBD的基因序列（PPARy基因序列 (ΝΜ_015869· 4)全长的第625位至1434位）用PCR技术进行体外扩增；
[0076] ②经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收大小 为800bp左右的片段；
[0077] ③BamHI和Xhol双酶酶切载体pET_15b，并琼脂糖凝胶回收酶切的片段；
[0078] ④将回收目的基因片段与pET_15b载体进行连接，然后将连接产物转化到大肠肝 菌Escherichia coli DH5a感受态细胞中，并涂在LB平板（含100mg/L氨苄青霉素）上， 培养过夜。
[0079] ⑤从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管（该LB溶液中 加入氨卞青霉素，使其终浓度为l〇〇mg/L)中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒（博大泰 克公司B型质粒小量快速提取试剂盒）提取质粒。进行测序。
[0080] 测序结果表明，PPAR γ -LBD的编码基因已被正确地克隆到pET-15b载体中。
[0081] b) PPAR γ -LBD的表达与纯化
[0082] 包括步骤：
[0083] ①将上述步骤a中得到的含有编码PPAR γ -LBD基因的pET_15b载体转化到大肠 杆菌Escherichia coli BL21(DE3)菌株中，并用LB平板（含100mg/L氨节青霉素）筛选 阳性克隆；
[0084] ②在上述的LB平板上挑取阳性克隆（在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的 单克隆），培养过夜，然后转入800mL的LB培养基（含100mg/L氨苄青霉素），当0D6。。达到 0. 6-