2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝损伤保护和肝纤维化防治中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于医药领域，涉及2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝病防治中的应 用。
【背景技术】：
[0002] 慢性肝病是威胁人类健康的一个重要问题，每年死于慢性肝病的人数接近80万。 急慢性肝损伤都会导致肝纤维化（Liverfibrosis)的产生。肝纤维化是肝脏内弥漫性细 胞外基质（extracellularmatrix，ECM)，特别是I型胶原α1过度沉积的病理过程，其细 胞学基础是肝星状细胞的活化。肝纤维化是机体对肝损伤的一种修复反应。这种自我修复 并不完美，肝纤维化的进一步发展会导致肝硬化、肝功能衰竭及门脉高压，并最终需要肝移 植来延续生命。著名的肝病专家Rogking在对肝纤维化进行深入研究后提出，人典型的肝 纤维化是可以逆转的，而一旦发展到中晚期肝硬化则无法逆转。由于肝纤维化是各种慢性 肝病的共有病理改变，也是肝硬化、肝癌等严重致死性疾病的必经病变过程，因此，研究如 何控制纤维化进程，在各种慢性肝病、肝硬化甚至肝癌的治疗和预防中具有重要的意义。随 着对肝纤维化产生机制及病理过程研究的深入，发现了越来越多抗肝纤维化的潜在作用靶 点，如TGFP1 及其受体、TIMP1、TLR4、整合素av、大麻素受体（cannabioniodreceptor)、 内皮素A受体（endothelinArec印tor)、Smad7、IL-1/4/6、PDGF、FGF、VEGF、Toll样受体 (TLR)、ATlR、mT0R等。但是，目前除针对病因治疗外，仅有中国批准了两种中药一一复方鳖 甲软肝片和扶正化瘀胶囊用于其治疗，其中复方鳖甲软肝片正在进行IV期临床试验，而扶 正化瘀胶囊已在国内完成IV期临床试验，目前已经通过美国FDA的临床II期实验。除此之 外，国际上尚无其它药物被批准用于肝纤维化的治疗。我国是一个肝病高发国家，现有1. 2 亿HBsAg携带者，3000万慢性HBV患者需要治疗。慢性HBV病人经过5~20年后约有12 % 可发展为肝硬化。此外丙肝、酒精肝、脂肪肝和药物性肝炎等的发病率也在逐年上升。因此， 肝损伤保护和肝纤维化新药的研发迫在眉睫。
[0003] 2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物，是课题组王菊仙副研究员等以Baringhaus等 人筛选的ASBT抑制剂S-1647为先导化合物，经结构改造得到的一系列新型苯磺酰胺基苯 甲酰胺类衍生物。目前，据文献报道，该类化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗胆固醇等活性。 近年来，本实验室利用已构建的基于I型胶原α1基因C0L1A1启动子药物筛选靶标的抗 肝纤维化药物细胞筛选模型，对2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物抗纤维化活性进行研究， 发现该类化合物对C0L1A1启动子具有不同程度的抑制作用，表明该类化合物具有潜在的 抗肝纤维化活性。本实验室以Ν-(3, 4, 5-三氯苯基）-2-(3-硝基苯磺酰胺基）苯甲酰胺 (16-4)、N-(2, 4-二氯苯基）-2-(3-硝基苯磺酰胺基）苯甲酰胺（16-5)和N-(3, 4-二氯苯 基）-2-(3-三氟甲氧基苯磺酰胺基）苯甲酰胺（17-15)为代表化合物，对其体外抗肝纤维 化作用进行了深入地研究，并在考察化合物安全性的基础上，从体内动物模型中进一步验 证了化合物16-4和16-5对化学诱导剂α-萘异硫氰酸酯（alpha-naphthylisothiocyan ate，ANIT)所致肝损伤的保护作用以及16-4抗胆管结扎肝纤维化作用。本实验研究所述 2_苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物的肝损伤保护作用和抗纤维化活性，迄今尚未见有国内外 的相关报道。
【发明内容】
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[0004] 本发明提供了2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物在肝损伤保护和制备抗肝纤维化 药物或保健品中的应用。
[0005] 本发明以I型胶原α1基因C0L1A1启动子作为药物筛选靶标，将本实验室构建 的C0L1A1荧光素酶质粒pGL4. 17-C0L1A1与Renailla质粒共转染人肝星状细胞LX2,利 用双荧光素酶报告系统发现2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物对C0L1A1启动子均具有不 同程度的抑制作用。为确定该类化合物的体外抗肝纤维化作用，本发明以N-(3, 4, 5-三氯 苯基）-2-(3-硝基苯磺酰胺基）苯甲酰胺（16-4)、N-(2, 4-二氯苯基）-2-(3-硝基苯磺 酰胺基）苯甲酰胺（16-5)和N-(3, 4-二氯苯基）-2-(3-三氟甲氧基苯磺酰胺基）苯甲酰 胺（17-15)为代表化合物，在人肝星状细胞LX2上进行体外抗肝纤维化实验研究。利用 Real-timePCR、WesternBlot实验证明，三个化合物均能显著地抑制经TGFP1诱导活化的 LX2细胞中肝纤维化主要标志物mRNA水平和蛋白水平的表达。为进一步评价化合物体内药 效，本发明首先采用2000mg/kg剂量水平进行急性毒性试验评估药物毒性，结果显示，给药 14天后各组小鼠体重无明显下降，并且无中毒迹象及死亡发生，表明药物安全性较高，这不 仅为化合物体内药效学评价提供了依据，也为该类化合物开发成为药物或保健品奠定了基 础。本发明体内药效学实验，首先是利用化学诱导剂α-萘异硫氰酸酯（alpha-naphthylis othiocyanate，ANIT)肝损伤模型，评价16-4和16-5的肝损伤保护作用。肝组织病理切片 染色结果表明，16-4和16-5均能缓解ANIT诱导的肝损伤。与此同时本发明还利用胆总管 结扎（BDL)肝纤维化模型，系统分析了 16-4给药后对模型组动物肝功能、肝组织病理改变、 肝组织纤维化程度、胶原纤维含量及肝纤维化相关标志物的影响，结果显示，16-4能改善模 型组大鼠肝功能和肝脏病理改变，降低肝纤维化的程度，延缓肝纤维化的发生和发展。
[0006] 本发明用于肝损伤保护和肝纤维化防治时，2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物口服 或非口服给药均属安全有效的。口服用药可以制成任何常规剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒 等；非口服用药，可制成注射液针剂等。
[0007] 本发明所述2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物给药剂量，可根据给药方式、患病程 度、患者年龄，有无既往病史等因素综合考虑进行调整。
[0008] 本发明用于肝损伤保护和制备抗肝纤维化药物或保健品时，其辅料及制备方法可 选用药学上可接受的任何形式。
【附图说明】：
[0009] 图1-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15对I型胶原α 1基因 C0L1A1启动子活性的抑制作用
[0010] 其中：*ρ〈〇· 05, #ρ〈0· 01与对照组（给药浓度为零）相比。
[0011] 图2-Real-timePCR检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15对 肝纤维化主要标志物mRNA水平的影响
[0012] 其中：*ρ〈0· 05, #ρ〈0· 01与对照组（未诱导活化的LX2细胞）相比，#ρ〈0· 05， ffip〈0. 01与TGFf3 1诱导组（给药浓度为零）相比。
[0013] 图3-WesternBlot检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5、17-15对肝 纤维化主要标志物蛋白水平的影响
[0014] 图4-小鼠急性毒性试验评价2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4U7-15安全 性
[0015] 其中：A图为16-4给药组小鼠体重变化情况；B图为17-15给药组小鼠体重变化情 况；相对体重=第14天体重/第1天体重。
[0016] 图5-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、16-5对α-萘异硫氰酸酯（alpha-n aphthylisothiocyanate,ANIT)所致肝损伤的保护作用
[0017] 其中：A为对照组（未加ANIT)小鼠肝脏组织切片HE染色结果；B为ANIT模型组 小鼠肝脏组织切片HE染色结果；C为16-4给药组小鼠肝脏组织切片HE染色结果；D为16-5 给药组小鼠肝脏组织切片HE染色结果。
[0018] 图6-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对BDL模型大鼠肝脏病理变化的影响
[0019] 其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；B为BDL模型组大鼠肝脏组织 切片HE染色结果；C为16-4给药组大鼠肝脏组织切片HE染色结果；D为对所有动物组织 HE染色双盲评分的统计图；#P〈〇. 01与假手术组相比；##P〈〇. 01与BDL模型组相比。
[0020] 图7-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对BDL模型大鼠肝纤维化程度的影响
[0021] 其中：A为假手术组大鼠肝脏组织切片Masson染色结果；B为BDL模型组大鼠肝脏 组织切片Masson染色结果；C为16-4给药组大鼠肝脏组织切片Masson染色结果；D为对所 有动物组织Masson染色双盲评分的统计图；#p〈0. 01与假手术组相比；##p〈0. 01与BDL模 型组相比。
[0022] 图8-2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量的影响
[0023] 其中：**p〈0. 01与假手术组相比；ttp〈0. 05与BDL模型组相比。
[0024] 图9-Real-timePCR检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对大鼠肝脏组织 中肝纤维化相关基因表达的影响
[0025] 其中：#p〈0. 01与假手术组相比；#p〈0. 05, ##p〈0. 01与BDL模型组相比。图 10-WesternBlot检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4对大鼠肝脏组织中肝纤维化 主要蛋白表达的影响
【具体实施方式】：
[0026] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述，但所述内容是对本发明的解释而 不是限定。
[0027] 《实施例1》双荧光素酶报告系统检测2-苯磺酰胺基苯甲酰胺类化合物16-4、 16-5、17-15抑制I型胶原α1基因C0L1A1启动子活性试验
[0028] 在37°C，5%C02条件下，用含10%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco)培养人肝星 状细胞LX2。待细胞汇合度约95%后，以每孔2X104个细胞铺于96孔白板。待细胞汇 合度约90%，换成不含胎牛血清的DMEM培养基（Gibco)无血清培养24h，用Lip〇2000将 pGL4. 17-C0L1A1与Renailla质粒共转染LX2细胞，转染6h后加TGF0 1 (2ng/ml)诱导，同 时加入不同浓度的 16-4、16-5、17-15，浓度分别为1以111〇1.1^1、5 41]1〇1.1^1、1〇41]1〇1.1^1，每 组实验设至少3个复孔，继续培养24h。按照Dual-Glo?LuciferaseAssaySystem说明 书操作步骤，吸弃培养基，PBS漂洗一遍。加入lxPLB20μL/孔，裂解细胞（15min