49-60)。
[0020] 尽管由EHEC感染引起严重的社会和经济问题，目前没有许可的疫苗或有效疗法可 供人使用。最大的挑战之一是开发有效且安全的免疫原，以确保无毒性并且对宿主免疫系 统具有强输入，以诱导持久的、高亲和性的抗体，从而确保血清中的良好中和能力。Stx2的B 亚基(Stx2B)是最有吸引力的候选物，因为在Stx家族中Stx2是最具致病性的毒素，并且基 于Stx2B的免疫原将防御与HUS发展最相关的Stx(Smith等，2006.Vaccine 24:4122-4129; Wen等，2006 .Vaccine 24(8): 1142-8 ;Tsuji 等，2008 .Vaccine 26(17): 2092-9)。此外，B亚 基代表毒素的结合单元，并且对于哺乳动物细胞是无毒的（0〇11〇11116-1? 〇1&等，1991.1?^ Infect Dis 13Suppl 4:S293_297;Lingwood，1996.Trends Microbiol 4(4):147_53)〇能 够阻断与哺乳动物细胞中的特异性受体（Gb3)的结合过程的抗体应该能阻止毒性级联 (cascade)的第一步骤(Ling等，1998 .Biochemistry 37(7): 1777-88)。此外，针对HUS的基 于Stx的疫苗将不仅防御已知EHEC菌株(通常为0157和非0157血清型），也将在对抗产志贺 毒素的大肠杆菌的新致病菌株或罕见致病菌株中有用，正如同由〇1〇4:Η4菌株引起的HUS的 最近的大爆发的情况（Beutin等，2012 · J Virol 86 :10444-10455; Scheutz等，2011 · Euro Surveill 16)。
[0021] 尽管存在多种途径，尚未获得成功的基于Stx2B的免疫原，主要是因为Stx2B是非 常差的免疫原(Marcato等，2001 .J Infect Dis 183:435_443; Imai等，2004 · Infect Tmmun 72(2) :889-895)。三个结合位点中的两个是由来源于相邻单体的残基形成，因此要求五聚 体的正确组装，以使结合位点有活性(Ling等，1998.Biochemistry 37(7): 1777-88)。如上 述所讨论的，Stx2B五聚体在不存在A亚基的情况下仅勉强稳定，并且，当用作免疫原时，它 无法生成针对构象表位(conformational epitopes)的特异性抗体，所述构象表位大部分 位于五聚体的单体之间的交界面处。
【发明内容】
[0022] 本发明人令人惊奇地发现，可通过制造嵌合肽来生产能够引发对免疫和/或生产 抗Stx抗体而言足够的免疫应答的非致病性稳定Stx抗原，所述嵌合肽包含与布鲁氏菌属2， 4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的单体融合的志贺毒素2型的B亚基(Stx2B)的单体。出乎意料的 是，当这样的嵌合肽形成五个相同单体的寡聚复合体时，Stx2B亚基中的构象表位得到稳 定，使得该高度稳定的BLS-Stx2B融合蛋白成为在对抗HUS的斗争中有价值的免疫原。
[0023] 因此，根据第一方面，本发明包括嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含与志贺毒素2型的B 亚基的单体具有至少95%的氨基酸序列一致性的肽，所述肽与布鲁氏菌属2,4_二氧四氢蝶 啶合酶的单体直接融合或通过肽接头融合。
[0024]志贺毒素2型的B亚基可与布鲁氏菌属2,4_二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端直接 融合或通过肽接头融合。"布鲁氏菌属2,4_二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端"是指10个氨 基最末端氨基酸中的任何氨基酸，例如从氨基末端起第一个、第二个、第三个、第四个、第五 个、第六个、第七个、第八个、第九个或第十个氨基酸。
[0025] 布鲁氏菌属2,4_二氧四氢蝶啶合酶的单体可与SEQ ID No. :9具有至少95%的序 列一致性，例如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高的序列一致性。
[0026] 布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的单体可在前8个N末端氨基酸位置内具有一 个或多个替换、删除和/或插入，使得删除和插入的组合并未导致相对于SEQ ID No. :9而言 延长超过5个氨基酸。例如，布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的单体在前8个N末端氨基酸 位置内可具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个替代、删除和/或插入，使得删除和插入 的组合并未导致相对于SEQ ID No. :9而言延长超过5个氨基酸。
[0027]在本发明的优选实施方式中，志贺毒素的B亚基的单体(SEQ ID NO: 1)通过肽接头 (所述肽接头例如为G/S柔性肽，所述G/S柔性肽可为2-20个氨基酸长或5-15个氨基酸长的 G/S柔性肽)连接至布鲁氏菌属2，4_二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端，例如包含氨基酸SEQ ID No:3、SEQ ID No:5或SEQ ID No:7,优选SEQ ID No:5的嵌合肽。
[0028]根据另一方面，本发明包括蛋白寡聚复合体，所述蛋白寡聚复合体的特征在于其 包含本发明嵌合蛋白的五聚体的二聚物。
[0029]根据再一方面，本发明包括编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸，例如含有SEQ ID No:4、SEQ ID No:6或SEQ ID No:8,优选SEQ ID No:6的DNA分子。
[0030] 根据又一方面，本发明包括含有编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸的载体，例如 含有SEQ ID No:4、SEQ ID No:6或SEQ ID No:8,优选SEQ ID No:6的载体。
[0031] 本发明还包括含有本发明的多核苷酸或载体的转基因细胞。在【具体实施方式】中， 转基因细胞为大肠杆菌细胞，优选大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在另一实施方式中，转基因细 胞为哺乳动物细胞，优选293T细胞。在又一实施方式中，转基因细胞为巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)细胞。
[0032] 本发明的另一方面包括药物组合物，所述药物组合物包含本发明的蛋白寡聚复合 体和/或载体以及药学上合适的赋形剂(vehicle)。本发明的药物组合物优选为疫苗。在优 选的实施方式中，本发明疫苗中的寡聚复合体包含选自于由如下氨基酸序列所组成的组中 的氨基酸序列：SEQ ID No: 3、SEQ ID No: 5和SEQ ID No: 7,优选SEQ ID No: 5。
[0033] 本发明的另一方面包括生产本发明的嵌合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤： a)在合适的条件下培养本发明的转基因细胞，以表达所述嵌合蛋白，所述转基因细胞含有 本发明的多核苷酸或载体;以及b)回收所述嵌合蛋白。
[0034] 在又一方面，本发明包括用于获得特异性结合志贺毒素 2的B亚基的抗体的方法， 所述方法的特征在于其包括以下步骤：
[0035] a)在适于引发针对本发明的蛋白寡聚复合体的中和抗体的免疫方案 (immunization scheme)下，向哺乳动物给予所述蛋白寡聚复合体；
[0036] b)从所述哺乳动物获得包含所述中和抗体和/或能够生产所述中和抗体的细胞的 生物样品；以及
[0037] c)将所述生物样品用作所述抗体的来源。
[0038] 在本发明的用于获得抗体的方法的优选实施方式中，步骤b)中获得的生物样品包 含B细胞，将所述B细胞用于步骤c)中以生产杂交瘤。在优选的实施方式中，向其给予蛋白寡 聚复合体的哺乳动物为小鼠。在另一优选的实施方式中，向其给予蛋白寡聚复合体的哺乳 动物为骆驼科动物(camelid)。通过本发明这一方面的方法所获得的抗体也被考虑在本发 明的范围之内。
[0039]在另一方面，本发明包括通过向期望降低细菌负荷的动物给予本发明的寡聚复合 体来降低动物(例如牛）中的肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的方法。
[0040] 在另一方面，本发明包括通过向期望降低细菌负荷的动物给予本发明的抗体来降 低动物(例如牛）中的肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的方法。
[0041] 根据又一方面，本发明包括在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征 (HUS)的抵抗力(resistance)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者给予本发明的 疫苗，例如包含本发明的寡聚复合体的疫苗，所述寡聚复合体包含选自于由如下氨基酸序 列所组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:5、SEQ ID No:7,优选SEQ ID No: 5〇
[0042]根据又一方面，本发明包括供在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征 (HUS)的抵抗力的方法使用的本发明的疫苗。
[0043]根据又一方面，本发明包括本发明的嵌合蛋白在制备用于在哺乳动物受试者中诱 导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力的药物中的用途。
[0044]本发明的再一方面涉及结合本发明的嵌合蛋白的抗体。此类抗体优选对本发明的 嵌合蛋白而言是特异的。在这一背景下，术语"特异的"是指抗体优先结合本发明的嵌合蛋 白，但并不排除以较低的程度与其它蛋白结合。本发明的抗体在制备用于在哺乳动物(例如 人)中预防或治疗溶血性尿毒综合征的药物组合物中的用途也是本发明的一部分。
[0045] 本发明的再一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体和药学上 合适的运载体(carrier)。本发明的抗体和药物组合物例如在用于在有需要的受试者中治 疗或预防溶血性尿毒综合征(HUS)的方法中有用，这一方法是本发明的又一方面。此类方法 优选用于在人受试者中治疗或预防溶血性尿毒综合征(HUS)。
【附图说明】
[0046] 图 l:BLS-Stx2B-L5(子图 A)、BLS-Stx2B-L10 嵌合体（子图 B)和 BLS-Stx2B-L15(子 图C)的理论结构。根据实施例1所述，对这些蛋白的结构进行建模。BLS单体的颜色为黑色， 而与BLS的结构融合的Stx2B单体的颜色为浅灰色。Stx2B和BLS之间的接头(GSGSG)的颜色 为深灰色。该图是用程序Pymol Molecular Graphics Systems构建的。
[0047] 图2:重组体Stx2B-BLS的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。将所表达和纯化的Stx2- BLS(LlO)通过15%SDS-PAGE进行分离，并用考马斯蓝进行染色(A和B)、或者用特异性抗体 来显现(C)。对所有三种嵌合体实施相同的方案。A)泳道1，未诱导的pET-Stx2B-BLS转化的 大肠杆菌BL21 (DE3)的总蛋白质；泳道2，诱导的pET-Stx2B-BLS转化的大肠杆菌BL21 (DE3) 的不溶性沉淀；泳道3，诱导的pET-Stx2B-BLS转化的大肠杆菌BL21 (DE3)的可溶部分。B)泳 道1，纯化的Stx2B;泳道2，纯化的BLS;泳道3，纯化的Stx2B-BLS。〇纯化的Stx2B-BLS的蛋白 质印迹分析。将SDS-PAGE用多克隆抗Stx2小鼠 I gG (泳道1和泳道2)或多克隆抗BLS小鼠 I gG (泳道3和泳道4)进行探测，并用过氧化物酶缀合的兔抗小鼠 IgG来显现。泳道1，纯化的 Stx2B;泳道2，纯化的Stx2B-BLS;泳道3，纯化的BLS;泳道4，纯化的Stx2B-BLS。0)纯化的蛋 白的SDS-PAGE。泳道I，纯化的Stx2B;泳道2，纯化的BLS;泳道3，纯化的Stx2B-BLS L5;泳道 4,纯化的Stx2B-BLS L10;泳道5,纯化的Stx2B-BLS L15。
[0048]图3:具有质粒 pCine〇-BLS-Stx2B-L5、pCine〇-BLS-Stx2B-L10 和 pCineo-BLS-Stx2B-L15的经转染的293T细胞的蛋白质印迹分析。泳道1，纯化的BLS;泳道2,具有空 pCIneo质粒的转染细胞;泳道3，转染分析的阴性对照；泳道4，具有BLS-Stx2B-L5的转染细 胞;泳道5，具有BLS-Stx2B-L10的转染细胞;泳道6，具有BLS-Stx2B-L15的转染细胞。
[0049] 图4:BLSwt(黑色虚线）、Stx2B(黑色实线)和BLS-Stx2B(灰色实线）的三个远UV-CD 光谱的比较。各个BLS-Stx2B嵌合体的理论光谱（由Stx2B光谱和BLS光谱的结合计算得到） 由灰色虚线表示。
[0050]图5:三个BLS-Stx2B嵌合体的尺寸排阻色谱(分析S200柱)偶联SLS分析。以0.5mL/ min的流速实施所有分离。通过折射率(实线）和UV280nm(点线)信号对洗脱进行监测。根据 其90°和RI信号计算各样品的分子量，并将该值与以BSA作为标准品得到的值进行比较。第 一个峰对应于高Mff聚集体(aggregates )，主要的峰对应于嵌合体BLS_Stx2B。
[0051 ]图6:BLS的热变性继以随温度变化的蛋白的222nm⑶信号。野生型（黑色虚线）、 Stx2B(黑色实线）、BLS-Stx2B L5(深灰色实线）、BLS-Stx2B LlO(灰色实线）和BLS-Stx2B L15(浅灰色实线）。
[0052] 图7:通过Gb3结合ELISA检测进行的BLS-Stx2B组装评估。将连续稀释的此3_ 5七叉28-1^5、81^-5丨128-1^10、81^-5丨128-1^15、81^15丨12或大肠杆菌121裂解物（用作非特异 性结合的阴性对照)加入到Gb3涂覆的板中。根据实施例13中所详述的，对结合进行测定。 [0053] 图8:针对Stx2B的特异性IgG滴度的时程。A)通过ELISA测定来自用BLS-Stx2B-L10 或Stx2B (两者均配制于FA中）免疫的小鼠的血清中的Stx2B特异性I gG滴度。每个时间点代 表4-6只小鼠/组的平均值土 SEM。#P〈0.005相对于Stx2B组的相同时间点。B)来自用不同配 方或方案(regimens)的Stx2-BLS-L10免疫的小鼠的血清中的Stx2B特异性IgG滴度。每个时 间点代表4-6只小鼠/组的平均值土 SEM。*P〈0.05相对于BLS-Stx2B-L10+无佐剂(N/A)组的 相同时间点；#P〈〇.005相对于所有其它组的相同时间点。黑色箭头表示蛋白免疫；灰色箭 头表示DNA免疫。
[0054]图9: Stx2B特异性IgG的亚型。根据材料和方法中所详述的，通过ELISA对来自用不 同配方的BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠的血清进行分析。各个棒代表每组4-6只的平均值土 SEM; *#P〈0.001相对于各组中的IgG2a。
[0055]图10:死亡率曲线。A)用来自免疫小鼠的血清进行的rStx2毒性的离体(ex vivo) 中和（ILDiqq )。如附图图例中所标明的，根据体外中和滴度对来自各免疫组(4-6只小鼠/池） (最后一次免疫后45天)或未免疫小鼠的血清池 (pool of sera)进行稀释。B)保护免疫小鼠 抵抗纯化的rStx2的致死激发。在最后一次免疫后45天，用lLD100rStx2i.v.激发以Stx2B+ FA或不同配方的BLS-Stx2B;或BLS+FA(4-6只小鼠/组）免疫的成年雄性BALB/c小鼠。*P〈 0.05相对于Stx2B+FA免疫的小鼠；？〈0.005相对于未免疫的小鼠或此3+?4免疫的小鼠。**?〈 0.005相对于所有其它组。
[0056]图11:长期特异性IgG抗体应答和保护性免疫应答。A)通过ELISA分析的针对Stx2B 的特异性IgG滴度，直到给予最后一次免疫后9个月；B)在A部分中所指出的时间（第二次激 发）处，使经第一次rStx激发后存活的小鼠接受用2LD100rStx2进行的第二次激发。**P〈 0. 005相对于BLS-Stx2B-L10+无佐剂(N/A)免疫的小鼠或BLS-Stx2B-L10+AH免疫的小鼠。C) 在A部分中所指出的时间（第三次激发）处，使经前两次rStx2激发后存活的小鼠接受用 3LD100rStx2进行的第三次激发。#P〈0.005相对于未免疫的小鼠。
[0057] 图12:利用一剂量的BLS-Stx2B-L10得到的特异性IgG滴度的时程。通过ELISA对血 清中的Stx2B特异性IgG滴度进行测定，所述血清来自用一剂量的BLS-Stx2B-L10(配制于AH 中）免疫的小鼠。每个时间点代表6只小鼠的平均值±SEM。灰色箭头表示用rStx2进行激发。
[0058]图13:死亡率曲线。保护免疫小鼠抵抗纯化的rStx2的致死激发。用如下对未免疫 的成年BALB/c小鼠或BLS-Stx2B-L10免疫(一剂量）的成年BALB/c小鼠（4-6只小鼠/组)进行 1. v.激发：（A)免疫后 30 天，lLD100rStx2;(B)免疫后 60 天，3LD100rStx2;以及(C)免疫后 120 天，5LD100rStx2。不同的激发在图12中以灰色箭头示出。#P〈0.005相对于未免疫的小鼠。
【具体实施方式】
[0059]本发明提出了克服缺乏成功的基于Stx2B的免疫原的新策略:在BLS蛋白颗粒上展 示Stx2B五聚体。BLS(布鲁氏菌属2,4_二氧四氢蝶啶合酶)被描述为非常有效的用于抗原递 送的运载体（Laplagne等，2004 · Proteins 57 :820-828; Cassataro等，2007 · Vaccine 25: 4437-4446;BelIido等，2009. Vaccine 27:136-145) ALS是五聚体的具高免疫原性且稳定 的二聚物，并且是已用于在其结构上展示外来抗原的支架（Vel ikovsky等，2003 . Infect Immun 71:5750-5755;Zylberman等，2004.J BiolChem 279:8093-8101;Bellido等， 2009.Vac cine 27:136-145; Cassataro等，2007 · Vaccine 25 :4437-4446 ; Lap Iagne 等， 2004. Proteins 57 :820-828)。然而，关于使用蛋白聚合支架来展示另一聚合蛋白，可想到 很多困难:a)插入的抗原的聚合可发生在不同蛋白颗粒之间，从而产生交叉和巨大的聚集 体;b)BLS和B亚基的五聚体的折叠和缔合的动力学可能非常不同，由此融合颗粒的折叠可 能会被困在中间状态；c )为了共价连接到BLS五聚体而施加的结构约束（structural constrains)可能不足以稳定B亚基的五聚体结构;d)寡聚支架的拓扑学可能与寡聚革E标的 拓扑学不兼容;e)不同蛋白的中间构型之间的相互作用可能妨碍融合颗粒的正确折叠和组 装;f)融合靶标的低稳定性或低溶解性可能对整个颗粒的稳定性产生不利影响，从而诱导 复合体聚集。
[0060] 寡聚支架上整个蛋白的展示可以受到以下情况的约束:外来蛋白不适合