满天星异荭草苷在制备治疗免疫性肝纤维化药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药满天星提取物的用途，具体地说是以满天星异荭草苷为原料在制 备治疗免疫性肝纤维化药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化(fibrosis of liver)是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变， 主要表现为肝内细胞外基质（extracellular matrix，ECM)成分过度异常地沉积，并影响肝 脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化必经阶段。肝纤维化具有可逆性，然而当其发展成肝硬 化则很难逆转，因此逆转和治疗肝纤维化显得非常重要。
[0003] 猪血清作为一种异种血清通过免疫反应可造成免疫性损伤。研究发现，大鼠腹腔 注射猪血清使得其中的抗原物质经腹腔内吸收产生相应抗体，形成抗原抗体复合物沉积于 肝细胞中，引起慢性免疫性炎症反应，ECM在肝内过度沉积导致肝纤维化发生，猪血清建立 的大鼠免疫性肝纤维化模型肝纤维化持久且致纤维化的过程中对肝细胞损伤较小，并且该 动物模型形成较稳定，其分子机制与人类肝纤维化有一定相似性，因而，是研究肝纤维化较 理想的动物模型。目前，临床对免疫性肝纤维化的治疗仍没有明确的方案和有效治疗药物。 近些年来，国内外大量研究表明天然药物和中药在治疗免疫性肝纤维化方面显示出了可靠 疗效和较少不良反应的特点。因此采用现代化技术从天然药物和中药中开发治疗免疫性肝 纤维化的新药具有重要意义。
[0004] 满天星(Gypsophila elegans Bieb)，又名丝石竹、霞草等，是石竹科石头花属植 物[1 ]，是广西壮民族地区抗肝脏疾病习用草药，其主要活性成分之一满天星异荭草苷 (isoorientin-2〃-〇-a-L_arabinopyranosyl，Ι0Α)对猪血清诱导的肝损伤的作用尚无报 道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是从天然药物和中药中开发治疗免疫性肝纤维化的新药，挖掘草药 满天星的新用途。
[0006] 本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分： 一、满天星异荭草苷的制备 提取方法:干燥的满天星10 kg粉碎后，用80L的75%乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提 取液，回收乙醇，得到乙醇提取物315.7g。乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液，接着 分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取方法简述如下：首先，用630ml石油醚萃取， 弃石油醚液;接着，用630ml乙酸乙酯萃取，弃乙酸乙酯液;最后，用630ml正丁醇萃取，回收 正丁醇，得正丁醇萃取物177.6 g。
[0007] 纯化方法：正丁醇萃取物上D101型大孔树脂，先用5倍量水洗脱后，再用10倍量 90%的甲醇洗脱，回收甲醇，得粗提物。将粗提物溶于甲醇，与等量硅胶拌样，上样于硅胶 柱，以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3:3:2; 4:3:2; 5:3:2; 6:3:2;7:3:2 ;8:3:2;9:3:2; 10:3:2，进行梯度洗脱。薄层色谱跟踪，合并相似馏分。合并用比例为4:3:2; 5:3:2; 6:3:2; 7:3:2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分，再经3次硅胶柱层析后再次合并相似馏分，回收洗 脱剂，得淡棕色结晶28.3 mg。
[0008] 二、满天星异荭草苷治疗免疫性肝纤维化药效学实验 将SD雄性大鼠以猪血清诱导大鼠免疫性肝纤维化模型，观察满天星异荭草苷治疗免疫 性肝纤维化的作用。结果表明满天星异荭草苷能明显降低肝组织白细胞介素-l(IL-l)，人 肿瘤坏死因子-a(TNF-a)，转化生长因子jl(TGF-m)，升高白细胞介素-IO(IL-IO)，含量， 降低肝组织及血清丙二醛(MDA)的水平，显著提高肝组织及血清超氧化物歧化酶(S0D)的活 性，提示满天星异荭草苷具有抗脂质过氧化反应的作用;此外，满天星异荭草苷可明显降低 血清透明质酸(HA)，层粘连蛋白（LN)，羟脯氨酸(Hyp)，ΙΠ 型前胶原氨基端肽(ΡΙΠΝΡ)，I型胶 原(Col-I)，IV型胶原(Col-IV)的含量，说明满天星异荭草苷具有抑制胶原沉积的作用。
[0009] 通过病理学检查显示，正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整，肝细胞索以中央静脉 为中心，向四周呈放射状排列，肝细胞未见变性、无炎细胞浸润，未见病理性改变，只有极 少量细小的蓝色纤维。模型组大鼠汇管区炎性细胞、坏死细胞增多，肝小叶结构紊乱，细胞 索排列紊乱，纤维间隔增厚，成纤维细胞大量增生，大量纤维生成，并可见假小叶形成。满天 星异荭草苷组大鼠可观察到肝组织病理损伤比模型模型组明显减轻。
[0010] 免疫组化法测定大鼠肝细胞核转录因子-KB p50(NF-KB p50)、TNF-a、基质金属蛋 白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-Ι(??ΜΡ-Ι)和细胞间粘附分子-l(ICAM-l)的表达， 结果表明，与模型组比较，满天星异荭草苷可明显抑制NF-kB p50蛋白、ICAM-1、HMP-1、 TNF-a蛋白的表达，升高MMP-9蛋白的表达。
[0011] RT-PCR法检测肝组织I型胶原（c〇i-i)、m型胶原（c〇i-m)、细胞核转录因子-κΒ P65(NF-kB ρ65)、核因子κΒ抑制蛋白a亚基（ΙκΒ-α)和转化生长因子-01(TGF_m)mRNA的表 达，结果表明，与模型组比较，满天星异荭草苷可明显抑制(：〇1-1、(：〇1-111、册-仙？65、1仙- a、TGF-m mRNA 的表达。
[0012] Western blot法检测肝组织NF-κΒ p65、磷酸化NF-κΒ p65、NF_KB ρ50、ΙκΒ_α、磷 酸化ΙκΒ-α、核因子κΒ抑制物激酶β(ΙΚΚ-β)、Col_I蛋白的表达，结果表明，与模型组比较，满 天星异荭草苷可明显抑制肝组织NF-κΒ p65、磷酸化NF-κΒ P65、NF-kB ρ50、ΙκΒ-α、磷酸化I κΒ-a、ΙΚΚ-β、Co 1 -1 蛋白的表达。
[0013] 结论:满天星异荭草苷可应用于治疗免疫性肝脏炎症;满天星异荭草苷可应用于 治疗免疫性慢性肝损伤;满天星异荭草苷可应用于治疗免疫性肝纤维化。
[0014]总之，本发明首次对满天星异荭草苷治疗免疫性肝损伤进行了研究，实验表明，满 天星异荭草苷可作用于免疫性肝损伤的多个环节或多个靶点，主要通过NF-κΒ信号转导通 路达到作用。可有效的抑制脂质过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、抑制胶原沉积、调苄基 质金属蛋白酶的活性、阻断NF-κΒ信号转导通路，使肝损伤明显减轻，对防治肝损伤具有独 特优势。满天星异荭草苷对猪血清引起的肝损伤具有明显抑制作用，是治疗免疫性肝纤维 化的一种非常有潜在价值的新药。
【具体实施方式】
[0015] 一、满天星异荭草苷的制备 提取方法:干燥的满天星10 kg粉碎后，用80L的75%乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提 取液，回收乙醇，得到乙醇提取物315.7g。乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液，接着 分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取方法简述如下：首先，用630ml石油醚萃取， 弃石油醚液;接着，用630ml乙酸乙酯萃取，弃乙酸乙酯液;最后，用630ml正丁醇萃取，回收 正丁醇，得正丁醇萃取物177.6 g。
[0016] 纯化方法：正丁醇萃取物上D101型大孔树脂，先用5倍量水洗脱后，再用10倍量 90%的甲醇洗脱，回收甲醇，得粗提物。将粗提物溶于甲醇，与等量硅胶拌样，上样于硅胶 柱，以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3:3:2; 4:3:2; 5:3:2; 6:3:2;7:3:2 ;8:3:2;9:3:2; 10:3:2，进行梯度洗脱。薄层色谱跟踪，合并相似馏分。合并用比例为4:3:2; 5:3:2; 6:3:2; 7:3:2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分，再经3次硅胶柱层析后再次合并相似馏分，回收洗 脱剂，得淡棕色结晶28.3 mg。
[0017] 光谱检测数据：ESI-MS(m/z):604[M+Na] + ; 1H 匪R (500 MHz，CD30D) δ: 7.33 (lH，s，H-2'），7.30 (lH，d， J = 8.0 Hz，H-6'），6.87(lH，d，J = 8.0 Ηζ，Η-5'），6·47 (1Η， s，H-3)，6.41(lH，s，H-8)，4.99 (lH，d，J = 9.5 Hz，H-l〃），4.37 (1H，J = 5.5 Hz，H-Γ''）； 13C 匪R(125 MHz， CD30D)S: 166.7 (C-2)，104.2 (C-3)，184.4 (C-4)，159.2 (C-5)，109.3(C-6)，165.9(C-7)，95.2(C-8)，163.1(C-9)，105.4(C-10)，123.3(C-1，），114.3(C-2，），147.1(C-3，），151.5(C-4，），117.6(C-5，），120.6(C-6，），73.4(C-1〃），82.5(C-2〃），74.3(C-3〃），73.5(C-4〃），82.9(C-5〃），63.4(C-6〃），107.4(C-Γ''），72·2 (C-2'''），80.8 (C-3'''），69.1 (C-4'''），67.2 (C-5'''）。最后鉴定为:异荭 草苷-2〃- 〇-α- L_阿拉伯糖（isoorientin-2〃-〇-a-L-arabinopyranosyl)，简称满天星异 荭草苷，其分子式为C26015H28，分子量为580.48。
[0018] 二、满天星异荭草苷治疗免疫性肝损伤药效学实验 实验方案： (1)实验动物模型的制备、分组及处理 90只雄性SD大鼠，（120 ± 20g)，SPF级，随机分为2组:造模组75只，正常组15只。造模组 大鼠采用猪血清腹腔注射每只0.5ml，造成免疫性肝纤维化模型，正常对照组腹腔注射等量 的生理盐水，每周2次，连续注射16周。分别于造模后12周和16周末，抽取肝纤维化大鼠及正 常对照组大鼠，进