，IL-6 (白介素6)和TNF α (肿瘤坏死因子）表达量的变化。
[0028] 图3 (G，H，I)分别表示，用LPS和MLN4924共同处理小鼠1天、3天和7天时，小鼠 肺泡灌洗液中总细胞数、中性粒细胞数和巨噬细胞数量的变化。
[0029] 图4表示MLN4924显著抑制巨噬细胞中LPS诱导的促炎因子的表达。
[0030] 图4(A)表示RAW264. 7细胞中，MLN4924刺激对LPS诱导的iNOS表达量的影响。
[0031] 图4(B)表示RAW264. 7细胞中，MLN4924刺激对LPS诱导的NO含量的影响。
[0032] 图4(C，D，E)分别表示，RAW264. 7细胞中，MLN4924刺激对LPS诱导的IL-I β， TNF α和MCP-I (单核细胞趋化蛋白-1)表达量的影响。
[0033] 图5表示MLN4924对中性粒细胞的凋亡没有显著影响。
[0034] 图5 (A)表示，流式细胞术检测不同浓度的MLN4924刺激下，凋亡的中性粒细胞占 中性粒细胞总数的比例。
[0035] 图5 (B)表示，免疫印迹实验检测不同浓度的MLN4924刺激中性粒细胞后，细胞凋 亡过程中重要的蛋白Mcl-I含量的变化。
[0036] 图6表示MLN4924显著抑制Α549细胞系中IL-I β诱导的趋化因子表达量的上调。
[0037] 图6(A，B，C)分别表示，MLN4924刺激后，E-I β诱导的趋化因子Ε-8(白介素 8)，CXCL5 (趋化因子配体-5)和KC (趋化因子KC)表达量的变化。
[0038] 图7表示MLN4924通过抑制NF- κ B和MAPK信号通路发挥作用。
[0039] 图7仏）表示，在狀1264.7细胞系中，不同浓度梯度的1^4924刺激下，1^3诱导 的NF- κ B信号通路激活程度的变化。
[0040] 图7出）表示，在狀1264.7细胞系中，不同浓度梯度的祖14924刺激下，1^3诱导 的MPK信号通路激活程度的变化。
[0041] 图7(C)表示，在A549细胞系中，不同浓度梯度的MLN4924刺激下，IL-Ιβ诱导的 NF- κ B信号通路激活程度的变化。
[0042] 图7(D)表示，在A549细胞系中，不同浓度梯度的MLN4924刺激下，IL-Ιβ诱导的 MAPK信号通路激活程度的变化。
[0043] 图8表示MLN4924通过抑制早期炎症过程从而抑制肺纤维化过程的示意图。
【具体实施方式】
[0044] 结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容 不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的 变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过 程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常 识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，本说明书中使 用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含 义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。
[0045] 实验材料：
[0046] 1 · DMEM培养胎牛血清（Hy c I one);胰蛋白酶（Hy c I one);免疫组织化学试剂盒 (上海妙通生物有限公司）；N0检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；Mass〇n三色染色 试剂盒（福建迈新生物技术开发有限公司）；Prime Script RT翻转录试剂盒（大连宝生 物有限公司）；QPCR试剂盒（大连宝生物有限公司）；anti-ERK (CST) ;anti-p-ERK (CST); anti_p38(CST) ;Anti-p-p38(CST) ;Anti_I κ Ba (CST) ;Anti_Mcll (Santa Cruz); anti-tubulin (Sigma) ;anti_Ms/RbIgG 二抗（Santa Cruz);常用生化试剂（上海生工）。
[0047] 2.实验动物：C57BL/6黑鼠，SPF级，8周龄，雄性；购买于中国科学院上海实验动 物中心。
[0048] 3.细胞株
[0049] 人非小细胞肺癌细胞系A549,购买于中国科学院上海细胞库。小鼠单核巨噬细胞 白血病细胞RAW264. 7,购买于中国科学院上海细胞库。小鼠3T3成纤维细胞系，购买于中国 科学院上海细胞库。
[0050] 4.实时荧光定量核酸扩增检测系统
[0051]
[0053] 实施例1气管给药
[0054] 本研究中动物疾病模型的建立均采用气管滴注给药的方式。首先用乙醚对小鼠进 行浅麻醉，以小鼠失去知觉但保留均匀呼吸为适宜麻醉程度，右手抓住小鼠，使颈部伸展， 暴露出嘴部，用20 μ L毛细采血针顺着小鼠舌头往下插入约2cm滴注BLM (5mg/kg) 0. 05mL， 注意不要太深入以免损伤咽喉部周围组织，根据症状判断，如果老鼠呼吸急促，心跳加快， 且毛细采血针管内液面快速下降，说明进入了气管。滴注完成后，将小鼠直立旋转Imin左 右，使滴注的药液能够均匀分布于两侧肺内。
[0055] 实施例2腹腔注射
[0056] 本研究中MLN4924干预采用腹腔注射给药的方式进行。将小鼠用前文所述的抓取 方法固定后，用酒精棉球对其腹部进行消毒。注射前使其头部朝下，腹部朝上，以免针头刺 入内脏。针头斜面朝上以45°角斜刺入皮肤后，将针头转直向下刺少许即可进入腹腔，这 样做的目的是为了使两个针眼不在一条直线上，从而避免在拔出针头时，注射液体流出污 染皮肤或者造成注射剂量的损失。进针部位不应过于靠近上腹部也不易进针过深以保护内 脏。
[0057] 实施例3肺泡灌洗液收集与总蛋白测定
[0058] 1.肺泡灌洗液收集：
[0059] 断颈处死小鼠后，剪开颈部皮肤，暴露出气管，在远心端轻轻剪一小口，插入静脉 留置针头固定，注入预冷的PBS缓冲液lmL，停留30s后回抽，如此操作灌洗2次，将灌洗液 1500rpm转速离心5min，取上清液用BCA蛋白定量法检测BALF中总蛋白含量及细胞因子。
[0060] 2.总蛋白测定
[0061] 肺泡灌洗液中总蛋白含量采用BCA蛋白定量法测定，具体操作如下：
[0062] (1)取试剂盒中I. 2mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准中，充分溶解后配制 成25mg/mL的蛋白标准溶液-20°C长期保存；
[0063] (2)取配好的25mg/mL蛋白标准品原液稀释至0· 5mg/mL，-20°C长期保存；
[0064] (3)根据样品数量，配置适量体积BCA工作液，试剂盒中A液和B液按照50:1比例 配制，配制完成后充分混匀，按照每孔200 μ L体积加入到96孔板中；
[0065] (4)绘制蛋白标准曲线；
[0066] (5)将待测样品每孔20 μ L同样加入到已加入BCA工作液的96孔板中；
[0067] (6)将96孔板于37°C烘箱中放置20-30min，注意观察孔中颜色变化，从而避免反 应过度；
[0068] (7)用酶标仪测定A562处吸光值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的 蛋白含量。
[0069] 实施例4肺组织总RNA提取与免疫印迹
[0070] 1.肺组织总RNA提取：
[0071] (1)预冷研钵，剪取约IOOmg重量肺组织于研钵中，倒入适量液氮，研磨至组织块 成匀浆状，加入ImL Trizol继续研磨，用无 RNA酶的枪头转移裂解液至无 RNA酶的I. 5mLEP 管中，室温静置5min。
[0072] (2)将裂解