三氟乙酰肼类化合物及其制备方法和在制药中的应用与流程

本发明属于医药技术领域，涉及一种多功能具有神经保护作用的化合物，尤其是一种三氟乙酰肼类化合物，其合成方法、制药用途和用于预防或治疗疾病方面的应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年期痴呆的主要类型，是老年认知衰退的主要病因，是严重影响老年人生活质量的神经系统变性疾病。根据我国多个流行病学调查结果，AD在65岁以上人群的患病率约为5％，其发病率一般随增龄而增加。目前临床上还没有能有效逆转认知缺损的药物。乙酰胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、卡巴拉汀、石杉碱甲、加兰他敏)治疗轻-中度AD患者有一定疗效，但也只是暂时缓解症状，无法进一步阻止神经细胞的衰减，且伴随严重不良反应。联合应用脑血流和脑代谢改善剂如奥拉西坦(oxiracetam)在提高记忆力方面具备一定疗效，但是更多时候是作为益智剂存在。针对淀粉样前体蛋白和β淀粉样蛋白的药物开发，一直被认为是一条新的有希望的途径，但是随着礼来等各大医药公司开发的一系列分泌酶抑制剂的临床试验结果来看无疑是当头喝棒，针对淀粉样前体蛋白和β淀粉样蛋白的药物的开发很有可能是殊途同归，失败收场。

由于AD的发生有着多种多样的原因，目前只是针对单个途径或者单个靶标给药并不能带来很好的疗效，采用“一个药物一个靶点”的模式无法从根本上治疗此类疾病。多功能药物(Multifunctional Drugs)是指那些针对同一疾病有着多个治疗机制的药物。许多医生和科学家相信，针对一种疾病的多个靶点同时起作用的多功能药物将比目前公认的“一个药物一个靶点”的模式更有潜力。多功能药物针对的疾病主要包括认知和运动障碍、抑郁症、精神分裂症等疑难杂症(Morphy et al.Drug Discov Today.2004,9(15):641-651)。

前期我们实验室根据美国Salk研究所Schubert教授合成的具有神经保护作用的化合物J147，经过结构修饰，引入传统中药川芎里面的主要药效成分川芎嗪，得到了具有多功能治疗机制的化合物T-006。T-006是一种三氟乙酰肼类化合物，对AD的治疗具有多重作用机制，包括抑制谷氨酸受体、激活MEF2转录活性、提高认知能力、具有神经分化作用及清除自由基，且对细胞尤其是神经细胞具有较好的保护作用。

谷氨酸受体分为两类：一类为离子型受体，包括：N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、海人藻酸受体(KAR)和α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体(AMPAR)。它们与离子通道偶联，形成受体通道复合物，介导快信号传递；另一类属于代谢型受体(mGluRs)，它与膜内G-蛋白偶联。这些受体被激活后通过G-蛋白效应酶、脑内第二信使等组成的信号转导系统起作用，产生较缓慢的生理反应(Wang S J,Yang T T,et al.Drug News Perspect,2005,18(9):561-566)。谷氨酸是中枢神经统中最丰富最重要的氨基酸，既参与突触传递又维持神经细胞正常的生理功能。正常情况下，谷氨酸的释放、摄取和重吸收保持在动态平衡。然而，当其过度释放或摄取障碍时，谷氨酸在脑内大量积聚浓度急剧升高，受体过度激活可导致广泛的脑组织病理性损害(Kumar A,Zou L,Yuan X,et al.Journal of neuroscience research,2002,67(6):781-786)。谷氨酸这种兴奋性毒性作用与多种神经退行性疾病的发生、发展都有密切联系，是导致神经退行性疾病中神经细胞死亡的重要机制之一。

MEF2由四种亚型结构组成(MEF2A-D)，是一类最早发现于肌肉中的核转录因子，它与DNA中富集A/T的序列结合，调控众多参与肌肉形成和发育的基因表达。大量研究证实，MEF2不仅在肌肉组织中高表达，在神经系统中也大量存在，对细胞的分化、生长、形态、存活及凋亡具有调剂作用(Potthoff M J,Olson E N,et al.Development,2007,134(23):4131-4140,McKinsey T A,Zhang C L,Olson E N,et al.Trends Biochem Sci,2002,27:40–47)。大量实验表明MEF2能调节依赖性突触生长及长期记忆的形成，但是MEF2促进记忆形成的作用又跟传统转录因子CREB不同(Josselyn S A,Nguyen P V,et al.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord,2005,4(5):481–497)。对MEF2的激活或者抑制作用主要是由其DNA结合的亲和力所决定的：PKA,CKII and GSK3β，p38,ERK5and CaMKIV，PP2B通过对MEF-2C-端的残基乙酰化或者泛素化激活MEF2转录活性；而神经毒物对溶酶体的降解及半胱天冬酶(caspase)的表达均可通过与MEF2D上的HSc70结合抑制MEF2的转录活性；HDAC则可以分别通过PP1α和CaMKIIα对其的激活和抑制来抑制MEF2的转录活性(Rashid AJ,Cole C J,et al.Genes,Brain and Behavior,2014,13(1):118-125)。MEF2的表达可提高新生神经元的存活率，而MEF2C的突变可引起凋亡神经元数目的增加以及记忆的减退，导致一系列的神经疾病产生。Wang等证实，参与AD病理改变的微管相关蛋白Tau是糖原激酶3(GSK3)的底物之一，后者通过直接磷酸化MEF2D抑制其活性，这一过程参与了AD的退行性改变(Wang X,She H,et al.Journal of Biological Chemistry,2009,284(47):32619-32626.)。Lipton教授最新的研究结果更是表明PD的发病机制也与MEF2C-PGC1之间的转录过程被抑制，导致线粒体功能紊乱、凋亡的发生及细胞死亡有着紧密联系(Ryan S D,Lipton S A,et al.Cell,2013,155(6):1351-1364.)。

AD患者的一个主要病理特征是β淀粉样蛋白沉积，即俗称的老年斑。而其行为学重要变化则是学习记忆功能发生障碍。β淀粉样蛋白简称Aβ，是由其前体蛋白APP经一系列分泌酶水解而成。Aβ主要有两种形式：一种是Aβ40；另一种是Aβ42，其中Aβ42所占比例约为10％。由于Aβ42极具疏水性而易形成纤维，这也是在AD患者大脑中发现的大脑斑块(俗称老年斑)中的主要组成成分。研究表明：单个的Aβ并不会对机体产生毒害作用，但是大量的Aβ的生成、聚集和沉积则能引起一系列的神经毒性如：干扰神经突触活动，导致蛋白体功能障碍；引起钙内流，促进Tau蛋白的磷酸化等(LaFerla F M,et al.Nature Reviews Neuroscience,2007,8(7):499-509)。

氧化应激是指机体在受到刺激时，体内产生大量氧化物中间体，使活性氧和抗氧化系统失衡的生理过程。失衡偏向于生成大量的自由基而抗氧化体系的活性减弱从而导致机体氧化损伤。这些自由基包括活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(Reactive nitrogen species,RNS)。自由基的生成环节十分复杂，与多种生理生化过程密切相关(Conrad et al.Neurochem Int.2013,62(5):738-49)。由于神经元的磷脂双分子层中有大量的多元不饱和脂肪酸，极易发生脂质过氧化，因而，神经元细胞比其他细胞对氧化应激更为敏感(Facecchia K,et al.Journal of toxicology,2011,2011.)。中枢神经系统的氧代谢损伤能够产生较为严重的氧化应激作用，导致对神经系统的进一步损害(Mohsenzadegan et al.Iran J Allergy Asthma Immunol.2012Sep；11(3):203-16)。正常生理状况时，体内过多的自由基和过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧、臭氧(O₃)等活性氧都能被抗氧化体系快速清除，但是在病理条件下，这种清除能力受到损伤。活性氧的累积能够引起核酸断裂、酶钝化、多聚糖解聚、脂质过氧化最终导致神经元死亡(Yan et al.Free Radic Biol Med.2013；62:90-101)。引起氧化应激的因素有很多，Aβ、金属离子以及线粒体等都被认为在氧化应激过程中起着重要的作用。可溶性Aβ的含量与过氧化氢的产生速率呈良好的线性关系。Aβ能改变钙离子通道通透性，活化NADPH氧化酶II(NOX₂)，使电子由NADPH转移到氧上，提高ROS的生成速率，同时Aβ对具有氧化还原活性的金属离子有很强的亲和力(Pimentel et al.Oxid Med Cell Longev.2012；2012:132-146)。它与这些活性金属离子结合后能产生过氧化氢。研究表明，促氧化剂能够促进Aβ的生成，而抗氧化剂，如维生素E以及其他一些自由基清除剂则能阻止Aβ对神经元的损害，改善认知障碍。

线粒体是细胞内氧化还原反应的主要场所和能量的主要供体，它所产生的自由基超过了细胞内自由基总量的90％，因而，线粒体的正常功能对维持神经元正常的生理活性有重要意义(Yan et al.Free Radic Biol Med.2013,62:90-101)。有观点认为，多种神经退行性疾病，包括Alzheimer’s disease(AD)、Parkinson’disease(PD)、Huntington病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和进行性核上性麻痹(PSP)等，主要是由于神经元线粒体功能异常而引起的(Du et al.Int J Biochem Cell Biol.2010,42(5):560-572)。通过对AD患者大脑神经元中不同类型的线粒体(正常、部分损伤和完全损伤)定量形态学计数发现，与同样年龄正常大脑的神经元相比，AD大脑神经元正常线粒体含量明显降低而完全损伤的线粒体含量则明显增加(Beal et al.Curr Opin Neurobiol.1996 6(5):661-6666)。线粒体损伤导致神经元氧化损伤主要作用在两方面：一方面是使电子传递链(ETC)功能异常，使自由基含量升高。另一方面，通过降低线粒体内谷胱甘肽、辅酶Q、维生素C、维生素E等抗氧化小分子以及一些氧化反应催化酶的含量，降低线粒体内抗氧化体系的活力。

美国Salk研究所已经完成了J147临床前主要的一些药理和毒理研究，J147前期试验结果已充分表明三氟乙酰肼类化合物具备良好的成药性，目前正在向FDA申报临床试验。而本发明将传统中药川芎中的主要药效成分川芎嗪(TMP)引入J147得到全新化合物T-006，赋予T-006兼有J147和TMP的多重作用机制和多功能治疗AD活性。

技术实现要素：

本发明提供了一种三氟乙酰肼类化合物，该化合物具有较强的抑制谷氨酸受体、激活MEF2的转录活性、提高认知能力、具有神经分化作用及清除自由基，且对细胞尤其是神经细胞具有较好的保护作用。

本发明还提供了所述三氟乙酰肼类化合物的制备方法。

本发明还提供了所述三氟乙酰肼类化合物在制药中的用途以及在预防和治疗疾病方面的应用。

本发明中的提供的化合物具有下面通式I的结构或其药学上可接受的盐：

其中：

R1，R2和R3相同或者不同，各自独立的为H，OH，NH2，COOH，烷基，芳基，杂环芳基，脂类基，胺基，氨基甲酸酯，但不能同时为H。

X和Y相同或不同，分别为C，N，O，S；但不能同时为C。

根据一些实施方式，通式I所述的优选化合物中，X和Y同时为N。

通式I所述的优选化合物中，X和Y同时为N，R1，R2，和R3可以相同或者不同，各自独立的为烷基。

根据一些实施方式，所述烷基为低级烷基；例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、新戊基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基；尤其是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。

通式I所述的进一步优选化合物中，X和Y同时为N，R1，R2和R3为甲基，亦即，所述化合物的结构如下(式II)：

本发明提供的化合物对细胞尤其是神经细胞具有较好的保护作用，可以用于制备预防或治疗具有细胞保护作用的药物。所述药物可包含提供给患者服用的有效治疗剂量的具有前述结构的化合物或其药学可接受的盐。

本发明提供了一种具有多重作用机制，包括抑制谷氨酸受体、激活MEF2受体的转录活性、提高认知能力、具有神经分化作用及清除自由基，且对细胞尤其是神经细胞具有较好的保护作用。所述化合物可以用于制备具有细胞保护作用的药物，用于预防或治疗与谷氨酸受体激活、MEF2功能失调或自由基等相关疾病，例如老年痴呆、帕金森、脑中风等与神经退行性有关的疾病，以及心脏疾病、糖尿病等与自由基相关的疾病。用于预防或治疗上述疾病的方法包括给患者服用本发明所述化合物制备的药物，其中包括有效治疗剂量的具有前述结构的化合物或其药学可接受的盐。

以下定义用以阐明和界定该发明中所用到的各种术语的含义以及范围。

本文所用的术语“烷基”是指未被取代的或被取代的直链、支链或环形的多至10个碳原子的烷基碳链。直链烷基包括如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基。支链烷基包括如异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、新戊基。环状烷基(“环烷基”)包括如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。烷基可被一个或多个取代基取代。上述取代基的非限定性例子包括NH₂、NO₂、N(CH₃)₂、ONO₂、F、Cl、Br、I、OH、OCH₃、CO₂H、CO₂CH₃、CN、芳基和杂芳基。术语―烷基”也指未取代或取代的直链、支链或环状的含有多至10个碳原子的在链上含有至少一个杂原子(例如氮、氧或硫)的烷基。上述直链烷基包括，例如，CH₂CH₂OCH₃、CH₂CH₂N(CH₃)₂和CH₂CH₂SCH₃。支链基团包括，例如，CH₂CH(OCH₃)CH₃、CH₂CH(N(CH₃)₂)CH₃和CH₂CH(OCH₃)CH₃。上述环状基团包括，例如六员环CH(CH₂CH₂)₂O、CH(CH₂CH₂)₂NCH₃和CH(CH₂CH₂)₂S及相应的五员环等。上述烷基可被一个或多个取代基取代。上述取代基的非限定性例子包括NH₂、NO₂、N(CH₃)₂、ONO₂、F、Cl、Br、I、OH、OCH₃、CO₂H、CO₂CH₃、CN、芳基和杂芳基。

本文所用的术语“芳基”是指未被取代的或取代的芳香化合物、碳环基团和杂芳基。芳基或者是单环或者是多环稠合化合物。例如，苯基是单环芳基。萘基是具有多环稠合的芳基的例子。芳基可以被一个或多个取代基取代，取代基的非限制性的例子包括NH₂、NO₂、N(CH₃)₂、ONO₂、F、Cl、Br、I、OH、OCH₃、CO₂H、CO₂CH₃、CN、芳基和杂芳基。

杂芳基涉及到取代的或非取代的单环或多环的基团，环内至少包括一个杂原子，譬如氮、氧以及硫。举例来说，典型的杂环基团包括一个或多个氮原子譬如四唑基、吡咯基、吡啶基(如4-吡啶基，3-吡啶基，2-吡啶基等)、哒嗪基、吲哚基、喹啉基(如2-喹啉基，3-喹啉基等)、咪唑基、异喹啉基，吡唑基、吡嗪基、嘧啶基、吡啶酮基或哒嗪基；典型的含一个氧原子的杂环基团包括2-呋喃基，3-呋喃基或苯并呋喃基；典型的硫杂原子基团包括噻吩基、苯并噻吩基；典型的混合杂原子基团包括呋吖基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和吩噻噁基。杂环基团能被一个或多个取代基取代。这些取代基包括NH₂、NO₂、O-烷基、NH-烷基、N(烷基)₂、NHC(O)-烷基、ONO₂、F、Cl、Br、I、OH、OCF₃、OSO₂CH₃、CO₂H、CO₂-烷基、CN以及芳基和多芳基。这些情况同时包括环内杂原子被氧化，譬如形成N-氧化物、酮或砜。

本文使用的术语“药学上可接受的”指的是在化合物如盐或赋形剂中不具有不能接受的毒性。药学上可接受的盐包括无机阴离子，例如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、亚硫酸根、硝酸根、亚硝酸根、磷酸根、磷酸氢根等。有机阴离子包括乙酸根、丙酸根、肉桂酸根、苯甲磺酸根、柠檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根等。药学上可接受的赋形剂在后文有描述，参见E.W.Martin,in Remington’s Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Company(1995),Philadelphia,PA,19^th ed。

本发明中涉及的新化合物包括具有式(I)和式(II)的TMP三氟乙酰肼化合物。结构式(I)和(II)涉及的三氟乙酰肼化合物具有抑制谷氨酸受体、提高MEF2活性及强的自由基清除活性，对细胞尤其是神经细胞具有较好的保护作用，可以用于制备预防或治疗具有细胞保护作用的药物，用于与谷氨酸受体过度激活、MEF2功能失调和/或自由基生成过多等相关疾病的治疗，通常是指用于与神经退行性有关的疾病，以及与自由基相关的疾病等，这些疾病包括如帕金森病，阿尔茨海默病，痴呆症，高血压，腹泻，抑郁症，哮喘，过敏；还包括与胆碱酯酶有关的疾病如阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿舞蹈症，肌肉萎缩性侧索硬化症，重症肌无力，青光眼，老年痴呆症，甲状腺功能亢进、高血压、支气管哮喘、IV型高脂蛋白血症、肾功能衰竭；还包括与氧化应激损伤或自由基相关的疾病如脑中风、脑创伤、癫痫、帕金森症、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默病、缺氧缺血脑损伤、脑溢血，痴呆症、缺血性心脏病，血管栓塞，动脉粥样硬化，高胆固醇血症，肺气肿，白内障，糖尿病，急性胰腺炎，酒精引起的肝脏疾病，肾脏伤害，癌症；也可用于预防、治疗神经退行性疾病如脑缺血，帕金森病，阿尔茨海默病，肌肉萎缩性侧索硬化症，共济失调毛细血管扩张症，牛海绵状脑病，克雅二氏病，亨丁顿舞蹈症，小脑萎缩症，多发性硬化症，原发性侧索硬化，脊髓性肌萎缩症。

本发明涉及TMP三氟乙酰肼类化合物，可以一种药学可接受的盐或药物复合物的形式对病人给药。某个复合物需与适当载体或赋形剂混合形成药物组合物从而保证达到有效治疗剂。“有效治疗剂量”是指该种类化物及其衍生物达到治疗效果所必须的剂量。

TMP三氟乙酰肼类化合物可以制成多种剂型，包括固体剂型，半固体剂型，液体制剂和气雾剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company(1995),Philadelphia,PA,19^th ed)。这几类剂型中的具体剂型包括片剂、丸剂、糖锭剂、颗粒剂、凝胶剂、膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂以及喷雾剂。这些剂型既能用于局部或全身给药又能用于速释或缓续给药，此类药物的给药方式有很多种，除了上述方式，还有口腔给药、面颊给药、直肠给药、腹膜给药、腹膜内给药、皮表给药、皮下给药和气管内给药等。

当TMP三氟乙酰肼类化合物注射给药时，可以用水溶性或脂溶性的溶剂将此类化合物配制成溶液剂，悬浊剂和乳剂。脂溶性溶剂具体包括植物油及类似油类，合成脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸酯以及乙二醇酯(proylene glycol)。这类化合物更易溶于Hank’s溶液,Ringer’s溶液或者生理盐水。

当TMP三氟乙酰肼类化合物口服给药时，可以采用常用技术将其与药学可接受的赋形剂制成复合物。这些赋形剂可以将这些化合物制成多种可以被病人剂型，如片剂、丸剂、混悬剂、凝胶剂等。口服制剂的配制有多种方法，如先把化合物和固体赋形剂混匀，充分研磨混合物，添加适当的辅料，加工处理成颗粒。可以用于制成口服剂型的辅料包括：糖类如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素类如玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄薯胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素(hydroxyproylmethyl-cellulose)、羧甲基纤维素纳、聚乙烯吡咯酮等。

本发明涉及TMP三氟乙酰肼类化合物也可以制成喷雾剂，此种剂型是通过一个加压器和一个喷雾器或者一个干粉吸入装置而实现的。可以用作喷射器里合适的喷射剂如二氯二氟甲烷、氟三氯甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳和二甲醚等。气雾剂给药的剂量可以通过喷射器的阀门来调节。

本发明涉及的各种剂型都关系到TMP三氟乙酰肼类化合物及其衍生物的有效治疗剂量。该类化合物的有效治疗剂量取决于接受治疗的病人。在决定适宜的剂量时，病人的体重、病情、服药方式以及处方医师的主观判断因素都要纳入考虑。该类多重作用机制的化合物及其衍生物的治疗有效量应该由有能力和丰富经验的处方医师决定。

尽管TMP三氟乙酰肼类化合物及其衍生物的有效治疗剂量会根据患者情况发生变化，但是通常适当的给药剂量范围是10mg-10g。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：本发明提供了一种全新结构的物质，同时具有多重作用机制，能够抑制谷氨酸受体、提高MEF2活性及强的自由基活性，且对细胞尤其是神经细胞具有较好的保护作用，可以用于制备预防或治疗具有细胞保护作用的药物，用于与谷氨酸受体、MEF2或自由基等相关疾病的治疗，通常是指用于如老年痴呆、帕金森、脑中风等等与神经退行性有关的疾病，以及与自由基相关的疾病包括心脏疾病、糖尿病等。

附图说明

图1.TMP和T-006的化合物结构；

图2.T-006的化学合成路线；

图3.T-006对IAA诱导的PC12细胞损伤的保护作用；

图4.T-006对t-BHP诱导的PC12细胞损伤的保护作用；

图5.T-006对IAA诱导的皮层神经元损伤的保护作用；

图6.T-006对t-BHP诱导的皮层神经元损伤的保护作用；

图7.T-006对glutamate诱导的小脑颗粒损伤的保护作用；

图8.T-006对MPP⁺诱导的小脑颗粒损伤的保护作用；

图9.T-006能提高PC12细胞MEF2活性；

图10A和图10B.T-006能显著改善东莨菪碱诱导小鼠产生的记忆损伤；

图11.T-006促进PC12细胞分化为神经元，突触生成，变长；

图12A至图12D.T-006对自由基的清除作用；

图13A至图13C.T-006减少t-BHP诱导的PC12细胞的凋亡；

图14A至图14D.T-006减少t-BHP诱导的PC12细胞ROS和RNS的升高。

具体实施方式

下面列举有关本发明的一些具体实施方式或实施例。应当理解，这些具体实施方式或实施例只是用来对本发明的内容作进一步的说明，而不是用来限制本发明所要求保护的范围。

实施例1、化合物T-006的合成。(图2)

取2,4-二甲基苯肼盐酸盐(1.72g,10mmol)溶于10mL甲醇中，在N₂保护下，冰浴加入3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲醛(1.50g,12mmol)，搅拌10min后见大量砖红色沉淀析出即结束反应。经抽滤漏斗抽滤，所得砖红色固体转入真空干燥箱干燥后直接投入下一步反应。取该砖红色中间体(3.04g,10mmol)溶于25mL甲醇中，在N₂保护下，冰浴分别加入1.68ml无水三乙胺及1.7ml三氟乙酸酐，反应30min。TLC监控反应，待反应结束后，乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥，减压蒸干溶剂，经硅胶柱分离(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得淡黄色固体T-006，淡黄色固体(3.25g，89.3％)。ESI-MS:[M+H]⁺m/z 365.1.¹H-NMR(CDCl₃,300MHz)δ:2.1(s,3H),2.42(s,3H),2.46(s,3H),2.54(s,3H),2.85(s,3H),7.08(d,j＝7.05Hz,1H),7.24(d,J＝7.21Hz,1H),7.25(s,1H),7.55(s,1H)；Anal.(C₁₈H₁₉F₃N₄O)C,H,C；found C 59.44％,H 5.319％,N 15.23％；requires:C 59.33％,H 5.26％,N 15.38％。

实施例2、T-006对IAA诱导的PC12细胞损伤的保护作用。(图3)

PC12细胞接种在96孔板上，置37℃，5％CO₂培养箱培养24小时，24小时后加入100μl IAA(50μM)诱导2小时。2小时后吸走培养基，加入的各化合物(T-006,TMP,Edaravone)培养24小时。细胞培养24小时后，每孔加入MTT，4小时后用酶标仪于570nm处测定吸光度值。结果如图3所示：T-006对IAA诱导的PC12细胞损伤有显著的保护作用，且远强于母体化合物TMP及Edaravone。与IAA组比较，****P<0.0001。

实施例3、T-006对t-BHP诱导的PC12细胞损伤的保护作用。(图4)

PC12细胞接种在96孔板上，置37℃，5％CO₂培养箱培养24小时。24小时后加入不同浓度梯度的各化合物(T-006,TMP,Edaravone)预孵育2小时。2小时后，吸走培养基，除Control组每孔加入100μl t-BHP(100μM)。然后放于养箱中培养24小时。细胞培养24小时后，每孔加入MTT，4小时后用酶标仪于570nm处测定吸光度值。结果如图4所示：T-006对t-BHP诱导的PC12细胞损伤有显著的保护作用，且远强于母体化合物TMP及Edaravone。与t-BHP组比较，****P<0.0001。

实施例4、T-006对IAA诱导的皮层神经元损伤的保护作用。(图5)

E16-18天SD胎鼠皮层神经元接种在96孔板上，置37℃，5％CO₂培养箱培养至第8天。同时加入50μl不同浓度梯度的各化合物(T-006,TMP,Edaravone)及除Control组每孔50μl IAA(40μM)。然后放于培养箱中培养24小时。细胞培养24小时后，每孔加入MTT，4小时后用酶标仪于570nm处测定吸光度值。结果如图5所示：T-006对IAA诱导的皮层神经元损伤有显著的保护作用，其保护作用远强于母体化合物TMP及Edaravone。与IAA组比较，****P<0.0001。

实施例5、T-006对t-BHP诱导的皮层神经元损伤的保护作用。(图6)

E16-18天SD胎鼠皮层神经元接种在96孔板上，置37℃，5％CO₂培养箱培养至第8天。同时加入50μl不同浓度梯度的各化合物(T-006,TMP,Edaravone)及除Control组每孔50μl t-BHP(50μM)。然后放于培养箱中培养24小时。细胞培养24小时后，每孔加入MTT，4小时后用酶标仪于570nm处测定吸光度值。酶标仪570nm处测定吸光度值。结果如图6所示：T-006对t-BHP诱导的皮层神经元损伤有显著的保护作用，其保护作用远强于母体化合物TMP及Edaravone。与t-BHP组比较，****P<0.0001。

实施例6、T-006对glutamate诱导的小脑颗粒损伤的保护作用。(图7)

原代小脑颗粒细胞提取自7-8天，15-20g的SD乳鼠，置37℃，5％CO₂培养箱培养至第8天。加入90μl不同浓度梯度的各化合物(T-006)置培养箱中孵育2小时，除Control组每孔加入10μl glutamate(终浓度为75μM)。然后放于培养箱中培养24小时。细胞培养24小时后，每孔加入MTT，4小时后用酶标仪于570nm处测定吸光度值。结果如图7所示：T-006对glutamate诱导的小脑颗粒细胞损伤有显著的保护作用，且呈现出较好的浓度依赖性。与glutamate组比较，**P<0.01。

实施例7、T-006对MPP⁺诱导的小脑颗粒损伤的保护作用。(图8)

原代小脑颗粒细胞提取自7-8天，15-20g的SD乳鼠，置37℃，5％CO₂培养箱培养至第8天。加入90μl不同浓度梯度的各化合物(T-006)置培养箱中孵育2小时，除Control组每孔加入10μl MPP⁺(终浓度为35μM)。然后放于培养箱中培养24小时。细胞培养24小时后，每孔加入MTT，4小时后用酶标仪于570nm处测定吸光度值。结果如图8所示：T-006对MPP⁺诱导的小脑颗粒细胞损伤有显著的保护作用，且呈现出较好的浓度依赖性。与MPP⁺组比较，**P<0.01。

实施例8、T-006能激活PC12细胞MEF2转录活性。(图9)

通过克隆MEF2报告基因pGreenFire1TM-MEF2-EF1慢病毒载体(lentivector)转染PC12。稳定转染的PC12细胞按常规方法培养，接种于96孔板，贴壁后加入不同浓度梯度的T-006孵育24h，按萤光素酶报告基因检测试剂盒(Luciferase reporter assay kit,Promega,USA)方法检测活性。结果如图9所示：T-006能显著激活PC12细胞MEF2转录活性。与IAA组比较，**P<0.01。

实施例9、T-006能显著改善东莨菪碱诱导小鼠产生的记忆损伤。(图10A和图10B)

本实验选用昆明小鼠，将其分为正常对照组(control,Ctrl)，东莨菪碱模型组(Scopolamine,Sco)，多奈帕齐治疗组(Sco+3mg/kg donepezil)，1和10mg T-006治疗组(Sco+1mg/kg T-006和Sco+1mg/kg T-006)。连续2周以灌胃的方式给药，最后一次给药24h进行水迷宫实验训练，共4天。训练前30min腹腔注射东莨菪碱(1mg/kg)造模。第5天进行正式第5天为空间搜索实验。数据以Mean±SD表示(每组动物n＝9)。结果如图10A和图10B所示，东莨菪碱诱导小鼠记忆明显受损，第一次达到平台潜伏期显著延长，穿过目标平台的次数减少(与正常对照组比较，##p<0.01)；1和10mg/kg T-006治疗组及3mg/kg多奈帕齐治疗组能显著改善东莨菪诱导的记忆受损(与东莨菪碱模型组比较，**p<0.01)；且10mg/kg T-006的疗效明显优于3mg/kg多奈帕齐(^$p<0.05)。

实施例10、T-006促进PC12细胞分化为神经元，突触生成，变长。(图11)

PC12细胞接种于6孔板，置37℃，5％CO2培养箱培养24小时。Control组培养基不变，NGF对照组：无血清F-12K+50ng/ml NGF,药物处理组用无血清F-12K含不同浓度T-006,孵育72小时后，倒置显微镜下拍照，每孔随机拍5个视野，如细胞突触长度超过2倍胞体大小，视为细胞分化，突触形成。结果如图11所示：T-006和阳性对照NGF均能显著促进PC12细胞分化，突触形成，变长，且呈浓度依赖性。与Control组比较，**P<0.01。

实施例11、化合物对OH^●，O₂^●-，ONOO–，DPPH自由基的清除作用。(图12A至图12D)

羟基自由基(OH^●)：采用邻二氮菲-金属离子-H₂O₂，通过Fenton反应(H₂O₂+Fe²⁺→·OH+H₂O+Fe³⁺)生成羟自由基，促使邻二氮菲-Fe²⁺被氧化为邻二氮菲-Fe³⁺,造成其水溶液在波长440nm处最大消失，来测算其清除率。具体步骤是:在48孔板中加入300μL双蒸水(空白对照)或不同浓度的T-006、TMP、Edaravone(用DMSO溶解配置成10mM储存液，然后用双蒸水稀释成4μM、20μM、80μM、320μM)，加入50μL of 1.0mM邻二氮菲(配置1.0mM溶解于50mM NaCl溶液)，然后分别加入125μL 1.0mM H₂O₂和125μL 2.0mM Fe²⁺混匀，用BioTek Synergy HT酶标仪测定100秒内在440nm波长处吸光值减少百分率。羟基自由基清除率计算公式为：清除率(％)＝[1－(A₀－A₁₀₀)/A₀]×100％，A₀和A₁₀₀分别为在0秒和100秒时的吸光值。

超氧阴离子自由基(O₂^●–)：采用邻苯三酚自氧化法，具体步骤是：在48孔板中分别加入250μL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.2),300μL双蒸水(空白对照组)或不同浓度的T-006、TMP、Edaravone(用DMSO溶解配置成10mM储存液，然后用双蒸水稀释成4μM、20μM、80μM、320μM)。加入50μL 2.0mM邻苯三酚，用漩涡混合器混匀。以空白作对照在320nm波长下，每隔30秒记录1次值，连续30min用BioTek Synergy HT酶标仪测定吸光值，在同样条件下测定样品吸光值，氧化速率是指每分钟吸光度的增值。线性回归方法，以时间(秒)为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，得出吸光度值与时间之间的线性关系，计算邻苯三酚的自氧化率，结果以每秒吸光度值的增量dA/dt表示，即线性回归方程中y＝ax+b，R²中的a值。清除率(％)＝(dA/dt－dAs/dt)/(dA/dt)。dA/dt为无样品存在条件下邻苯三酚的自氧化率，dAs/dt为样品存在条件下的邻苯三酚自氧化率。

过氧亚硝基自由基(ONOO^–):过氧亚硝基自由基(ONOO^–)的测定可以通过SIN-1模拟体内的ONOO^–生成过程，SIN-1在弱碱性条件下(PBS pH 7.4)分解，能够同时产生超氧阴离子自由基(O₂^●–)以及一氧化氮自由基(NO^·)，二者瞬间再产生过氧亚硝基阴离子(ONOO^–)。ONOO^–与鲁米诺反应，使其氧化激发，退激时发射425nm波长的光，测定发光强度就可以判断ONOO^–的产生，抗氧剂(AH)与鲁米诺(L)竞争与ONOO^–反应，减少了ONOO^–与LH^-的反应，降低了发光强度。其发光强度与抗氧剂的抗氧化能力呈负相关，因而可用反应前后发光强度的变化进行定量分析。具体实验步骤为：在3mL圆底光度计管中分别加入300μL0.1M PBS缓冲液(PH 7.4)，50μL 1mM Luminol溶液，100μL PBS或不同浓度的T-006、TMP、Edaravone(用DMSO溶解配置成10mM储存液，然后用双蒸水稀释成4μM、20μM、80μM、320μM)。加入50μL 3mg/mL的SIN-1hydrochloride溶液，用漩涡混合器混匀。以空白作对照将光度计管置于37℃控温条件下，用发光仪每100s记录一次发光值，连续记录2000s，每个浓度至少重复3次取平均值。清除率以下列公式计算：清除率(％)＝(A_ctrl—A_sample)/A_ctrl×100。

1,1-二苯基-2-苯肼自由基(DPPH)：1,1-二苯基-2-苯肼自由基(DPPH)分光测定法的测定原理是依据DPPH在517nm处有一强吸收，其甲醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系。因而可用反应前后吸光度的变化进行定量分析。因而通过检测不同浓度各样品对DPPH的吸光度值变化，由清除率即可表示其清除自由基能力的强弱。具体实验步骤为：在96孔板中分别加入100μL不同浓度的T-006、TMP、Edaravone(用DMSO溶解配置成10mM储存液，然后用双蒸水稀释成4μM、20μM、80μM、320μM)或者100μL甲醇(空白对照组)，然后迅速加入100μL 100μM的DPPH甲醇溶液(终浓度为50μM)，每个样品浓度3-5个复孔，振匀后避光条件下室温放置一个小时，然后在酶标仪上517nm波长下测定吸光度值，清除率以下列公式计算：清除率(％)＝(A_ctrl－A_sample)/A_ctrl×100。

实施例12、T-006减少t-BHP诱导的PC12细胞的凋亡。(图13A至图13C)

PC12细胞接种在96孔板上，置37℃，5％CO₂培养箱培养24小时。加入不同浓度梯度T-006和TMP(100μM)预孵育2小时。2小时后，吸走培养基，除Control组每孔加入100μl t-BHP(100μM)。然后放于培养箱中培养24小时。细胞培养24小时后，加入Hoechst工作液，在荧光显微镜下观察统计PC12细胞凋亡数目。(A)T-006减少t-BHP诱导的PC12细胞凋亡。(B)统计PC12细胞凋亡数目。(C)T-006改善t-BHP诱导的PC12细胞线粒体膜电位紊乱作用。PC12细胞接种在96孔板上，置37℃，5％CO₂培养箱培养24小时。24小时后加入不同浓度梯度T-006和TMP(100μM)预孵育2小时。2小时后，除Control组每孔加入100μl t-BHP(100μM)进行诱导。诱导完成后，每孔加入JC-1工作液，使用流式细胞仪进行线粒体膜电位监测分析。与control组比较，^###p<0.001；与t-BHP比较，*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001。

实施例13、T-006减少t-BHP诱导的PC12细胞ROS和RNS的升高。(图14A至图14D)

PC12细胞接种在96孔板上，置37℃，5％CO₂培养箱培养24小时，加入不同浓度梯度的T-006和TMP(100μM)预孵育2小时。2小时后,吸走培养基，除Control组每孔加入100μl t-BHP(100μM)。然后放于培养箱中培养6小时。细胞培养6小时后，分别加入DCF-DA探针，HFP探针，DAF-FM探针和DHR123探针测定细胞内总ROS，羟基自由基，一氧化氮自由基和过氧亚硝基。(A)DCF-DA探针测定细胞内总ROS。(B)HFP探针测定细胞内羟基自由基。(C)DAF-FM探针测定一氧化氮自由基。(D)DHR123探针测定细胞内过氧亚硝基。与control组比较，^###p<0.001；与t-BHP比较，*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001.

本文对一些具体的实施例进行了详细的描述，然而这只是作为对发明目的实例说明，而不限制下述权利要求书的范围。应当理解，对本文所述具体方案的不同取代、改变和修饰都不偏离本发明权利要求所定义的内涵和外延，从而应当属于本申请所要求保护的发明范围。