对蛋白酶裂解敏感性降低的变体α-淀粉酶及其使用方法与流程

技术领域相关申请的交叉引用本申请要求2013年11月20日提交的USSN61/906,617的优先权权益，所述申请全文以引用方式并入本文。本发明公开了与变体α-淀粉酶相关的组合物和方法，所述变体α-淀粉酶包含能降低其对蛋白水解消化的敏感性并改善其性能的突变。变体α-淀粉酶尤其可用于需要在相同溶液中存在α-淀粉酶和蛋白酶的应用。

背景技术：
淀粉由直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉由α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量(MW)为约60,000至约800,000。支链淀粉为每24-30个葡萄糖单元包含α-1,6分支点的支链聚合物；其MW可高达1亿。α-淀粉酶以随机裂解内部α-1,4-糖苷键的方式水解淀粉、糖原和相关多糖。α-淀粉酶(特别是源自芽孢杆菌(Bacilli))已被用于多种不同目的，包括淀粉液化和糖化、纺织物退浆、造纸和制浆工业中的淀粉改性、酿造、烘焙、食品工业的糖浆制备、发酵工艺的原料制备，以及用于动物饲料中提高可消化性。α-淀粉酶也已被用于在盘碟洗涤和衣物洗涤期间除去淀粉类污垢和污渍。在一些应用中，α-淀粉酶与其它酶(包括蛋白酶)组合使用。虽然一些α-淀粉酶在存在蛋白酶的情况下相对稳定，但其它α-淀粉酶对蛋白水解裂解较敏感，在存在蛋白酶的情况下迅速失活。因此，许多具有优异淀粉水解活性的α-淀粉酶无法在存在蛋白酶的情况下使用。

技术实现要素：
本发明组合物和方法涉及对蛋白水解裂解敏感性降低且性能改善的变体α-淀粉酶及其使用方法。本发明组合物和方法的方面和实施方案汇总于以下单独编号的段落中：1.在第一方面，提供了一种用于降低具有TIM桶状结构的α-淀粉酶对蛋白水解裂解的敏感性的方法，该方法包括将存在于连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环中的非经典、表面暴露的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基，从而产生变体α-淀粉酶，其中与亲本α-淀粉酶相比，变体α-淀粉酶对于由蛋白酶进行的对连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环的裂解具有降低的敏感性，并且其中SEQIDNO:3用于位置编号。2.在段落1的方法的一些实施方案中，非经典、表面暴露的氨基酸残基存在于与亲本α-淀粉酶中的第333位相对应的位置处，其中SEQIDNO:3用于位置编号。3.在一些实施方案中，段落2的方法还包括将存在于与亲本α-淀粉酶中的第335位相对应的位置处的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基，其中SEQIDNO:3用于位置编号。4.在前述段落2或3的方法的一些实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有除甘氨酸或谷氨酰胺之外的氨基酸残基。5.在前述段落2-4中任一段落的方法的一些实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有苏氨酸。6.在前述段落2-5中任一段落的方法的一些实施方案中，在与第333位相对应的位置处的氨基酸残基被置换为甘氨酸。7.在前述段落3-6中任一段落的方法的一些实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第335位相对应的位置处具有除丝氨酸之外的氨基酸残基。8.在前述段落3-7中任一段落的方法的一些实施方案中，在与第335位相对应的位置处的氨基酸残基被置换为丝氨酸。9.在一些实施方案中，前述段落中任一段落的方法还包括在亲本α-淀粉酶中产生以下突变中的一者或多者：(i)在与第177位、第178位、第179位和第180位相对应的位置处缺失一个或多个氨基酸残基；(ii)置换存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基；或(iii)置换存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基；其中与亲本相比，所得的变体在洗涤剂组合物中具有增强的洗涤剂稳定性和/或增强的清洁性能，并且其中SEQIDNO:3用于位置编号。10.在一些实施方案中，前述段落中任一段落的方法还包括在亲本α-淀粉酶中产生以下突变中的一者或多者：(i)在与第177位和第178位相对应的位置处缺失氨基酸残基；(ii)将存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基置换为脯氨酸；(iii)将存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基置换为精氨酸或赖氨酸；其中与亲本相比，所得的变体在洗涤剂组合物中具有增强的洗涤剂稳定性和/或增强的清洁性能，并且其中SEQIDNO:3用于位置编号。11.在一些实施方案中，段落1-10中任一段落的方法还包括在与N125、F152、N205和G473相对应的位置处产生一个或多个突变，其中SEQIDNO:3用于位置编号。12.在段落11的方法的一些实施方案中，变体包含选自如下的突变的组合：(i)N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K；(ii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K；(iii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R；(iv)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K；(v)N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K；(vi)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K；(vii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R；(viii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K；(ix)N125Y+E186P+T333G+G472K；(x)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K；(xi)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R；以及(xii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472K。13.在前述段落中任一段落的方法的一些实施方案中，亲本或变体α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少70％、至少80％或至少90％氨基酸序列同一性。14.在另一方面，提供了一种通过前述段落中任一段落的方法制备的变体α-淀粉酶。15.在另一方面，提供了一种亲本α-淀粉酶的变体，其中变体包含将存在于与亲本α-淀粉酶中的第333位相对应的位置处的氨基酸残基换为不同的氨基酸残基的置换，其中与亲本α-淀粉酶相比，变体α-淀粉酶对于由蛋白酶进行的对连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环的裂解具有降低的敏感性，并且其中SEQIDNO:3用于位置编号。16.在一些实施方案中，段落15的变体还包含将存在于亲本α-淀粉酶中与第335位相对应的位置处的氨基酸残基换为不同的氨基酸残基的置换，以进一步降低对裂解的敏感性，其中SEQIDNO:3用于位置编号。17.在前述段落15或16的变体的一些实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有除甘氨酸或谷氨酰胺之外的氨基酸残基。18.在前述段落15-17中任一段落的变体的一些实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有苏氨酸。19.在前述段落15-18中任一段落的变体的一些实施方案中，变体α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有换为甘氨酸的置换。20.在前述段落15-19中任一段落的变体的一些实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第335位相对应的位置处具有除丝氨酸之外的氨基酸残基。21.在前述段落16-20中任一段落的变体的一些实施方案中，变体α-淀粉酶在与第335位相对应的位置处具有换为丝氨酸的置换。22.在一些实施方案中，前述段落15-21中任一段落的变体包含相对于所述亲本而言以下突变中的一者或多者：(i)在与第177位、第178位、第179位和第180位相对应的位置处缺失一个或多个氨基酸残基；(ii)置换存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基；以及(iii)置换存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基；其中与亲本相比，变体在洗涤剂组合物中具有增强的洗涤剂稳定性和/或增强的清洁性能，并且其中位置编号是指SEQIDNO:3。23.在一些实施方案中，前述段落15-22中任一段落的变体还包含相对于所述亲本而言以下突变中的一者或多者：(i)在与第177位和第178位相对应的位置处缺失氨基酸残基；(ii)将存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基置换为脯氨酸；(iii)将存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基置换为精氨酸或赖氨酸；其中与亲本相比，变体在洗涤剂组合物中具有增强的洗涤剂稳定性和/或增强的清洁性能，并且其中位置编号是指SEQIDNO:3。24.在一些实施方案中，前述段落15-23中任一段落的变体还包含在选自N125、F152、N205和G473的位置处的突变。25.在一些实施方案中，前述段落15-24中任一段落的变体包含在与第177位、第178位、第179位和第180位相对应的位置处一个或多个氨基酸残基的缺失，并且还包含选自如下的突变的组合：(i)N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K；(ii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K；(iii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R；(iv)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K；(v)N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K；(vi)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K；(vii)N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R；(viii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K；(ix)N125Y+E186P+T333G+G472K；(x)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K；(xi)N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R；以及(xii)N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472K。26.在前述段落15-24中任一段落的变体的一些实施方案中，亲本或变体的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少70％、至少80％或至少90％氨基酸序列同一性。27.在另一方面，提供了一种包含段落14-26中任一段落的α-淀粉酶的组合物。28.在一些实施方案中，段落27的组合物还包含表面活性剂。29.在一些实施方案中，段落27或28的组合物为衣物洗涤剂、衣物洗涤剂添加剂、或者手动或自动盘碟洗涤剂。30.在一些实施方案中，段落27-29中任一段落的组合物还包含选自如下的一种或多种附加酶：蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、金属蛋白酶、阿马道里酶以及除PcuAmy1之外的α-淀粉酶、或它们的变体。31.在一些实施方案中，段落27的组合物用于糖化包含淀粉的组合物，用于液化后SSF，或用于直接SSF而不事先液化，或用于制备发酵饮料或经烘焙的食物产品。32.在一些实施方案中，段落27或28的组合物用于纺织物退浆。33.在另一方面，提供了一种编码段落14-26中任一段落的多肽的重组多核苷酸。34.在一些实施方案中，段落33的多核苷酸与SEQIDNO:1的多核苷酸具有至少80％核酸序列同一性，或者在严格条件下杂交于与SEQIDNO:1的多核苷酸互补的多核苷酸。35.在另一方面，提供了一种包含段落33或34的多核苷酸的表达载体。36.在另一方面，提供了一种包含段落35的表达载体的宿主细胞。37.在另一方面，提供了段落16-26中任一段落的α-淀粉酶用于制备包含葡萄糖的组合物、用于制备液化淀粉、用于制备食品或饮料、用于清洁淀粉类污渍、或用于纺织物退浆的用途。38.在另一方面，提供了一种用于从表面除去淀粉类污渍或污垢的方法，该方法包括：使表面与组合物接触，所述组合物包含有效量的段落16-26中任一段落的变体α-淀粉酶和任选的表面活性剂；以及使α-淀粉酶水解存在于淀粉类污渍中的淀粉组分，以产生溶解于水溶液中的淀粉衍生的小分子；从而从表面除去淀粉类污渍；其中组合物还任选地包含选自如下的至少一种附加酶：蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、金属蛋白酶、阿马道里酶以及除PcuAmy1之外的α-淀粉酶、或它们的变体。39.在另一方面，提供了一种用于使纺织物退浆的方法，该方法包括：使上浆的纺织物与有效量的段落14-26中任一段落的变体α-淀粉酶接触；以及使α-淀粉酶水解浆料中的淀粉组分，以产生溶解于水溶液中的淀粉衍生的小分子；从而从纺织物除去浆料。40.在另一方面，提供了一种用于糖化包含淀粉的组合物以产生包含葡萄糖的组合物的方法，该方法包括：使包含淀粉的组合物与有效量的段落14-26中任一段落的变体α-淀粉酶接触；以及糖化包含淀粉的组合物以产生包含葡萄糖的组合物；其中α-淀粉酶催化淀粉溶液糖化为葡萄糖。41.在段落40的方法的一些实施方案中，包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒状淀粉。42.在另一方面，提供了一种用于制备食品或饮料的方法，该方法包括：使包含淀粉的食品或饮料与段落14-26中任一段落的α-淀粉酶接触；以及使α-淀粉酶水解淀粉以产生淀粉衍生的小分子；其中该方法还任选地包括使食品或饮料与葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、普鲁兰酶、β淀粉酶、非所述变体α-淀粉酶的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或它们的组合接触。43.在段落40-42中任一段落的方法的一些实施方案中，α-淀粉酶由宿主细胞表达并分泌。44.在段落43的方法的一些实施方案中，使包含淀粉的组合物与宿主细胞接触。45.在段落43或44的方法的一些实施方案中，宿主细胞还表达并分泌葡糖淀粉酶或其它酶。46.在段落43-45中任一段落的方法的一些实施方案中，宿主细胞能够对组合物进行发酵。根据本说明书和附图，组合物和方法的这些及其它的方面和实施方案将显而易见。附图说明图1A至图1C是描述为用于工业应用的多种α-淀粉酶的氨基酸序列比对。使用采取默认参数的ClustalW来形成该比对。图2是SDS/PAGE凝胶的图像，示出了在存在递增量的GG36蛋白酶的情况下PcuAmy1-v1的裂解。凝胶右侧的字母指示(A)完整的全长PcuAmy1-v1，(B)PcuAmy1-v1的第一裂解产物，(C)GG36蛋白酶，(D)GG36蛋白质制品中的污染物，以及(E)PcuAmy1-v1的第二裂解产物。图3是坐标图，示出了在与GG36蛋白酶一起温育后PcuAmy1和若干种经工程改造的变体的残余α-淀粉酶活性。图4是SDS/PAGE凝胶的图像，示出了在与GG36蛋白酶一起温育后PcuAmy1和若干种经工程改造的变体的蛋白水解裂解。图5是坐标图，示出了在与GG36蛋白酶一起在MIFATotal洗涤剂中于37℃下温育长达14天后PcuAmy1-v1和若干种经工程改造的变体的稳定性。图6是坐标图，示出了在与GG36蛋白酶一起在MIFATotal洗涤剂中于37℃下温育3天或14天后PcuAmy1-v1和若干种经工程改造的变体的稳定性。图7是坐标图，示出了在与GG36蛋白酶一起在UnileverOmo洗涤剂中于37℃下温育长达14天后PcuAmy1-v1和若干种经工程改造的变体的稳定性。图8是坐标图，示出了在与GG36蛋白酶一起在UnileverOmo洗涤剂中于37℃下温育3天或14天后PcuAmy1-v1和若干种经工程改造的变体的稳定性。图9是坐标图，示出了与两种商业基准品相比PcuAmy1-3B和PcuAmy1-3L在PersilUniversalGelGold洗涤剂中的剂量依赖性清洁性能。图10是坐标图，示出了与两种商业基准品相比PcuAmy1-3B和PcuAmy1-3L在PersilUniversalGelGold洗涤剂中的热稳定性。图11是坐标图，示出了在与GG36蛋白酶一起在MIFATotal洗涤剂中于37℃下温育3天或14天后PcuAmy1-v1和若干种经工程改造的变体的稳定性。图12是坐标图，示出了与和ACE-QK相比PcuAmy1变体v1、v6、v8和v16在pH8.0的缓冲液中的相对清洁性能。酶剂量标注在X轴上。图13是坐标图，示出了与相比PcuAmy1变体v1、v6、v8和v16在缓冲液中于所指示的温度下的相对热稳定性。使用了5ppmPcuAmy1变体和10ppm具体实施方式本发明描述了与对蛋白水解裂解敏感性降低的变体α-淀粉酶相关的组合物和方法。变体α-淀粉酶的示例性应用是淀粉液化和糖化，在衣物洗涤和盘碟洗涤中清洁淀粉类污渍，在纺织物加工中脱浆，烘焙和酿造，以及动物饲料，特别是已知存在或疑似存在蛋白酶的情况。下文将详细描述组合物和方法的这些及其它方面。在描述本发明组合物和方法的各个方面和实施方案之前，先介绍以下定义和缩写。1.定义和缩写根据具体实施方式，应用以下缩写和定义。应当注意，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提到“酶”包括多种此类酶，而提到“剂量”包括提到一个或多个剂量以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。本文件被整理成多个部分以方便阅读；然而，读者应当理解，一个部分中所做的陈述可适用于其它部分。这样，用于本公开的不同部分的标题不应理解为限制性的。除非另有定义，否则本文所用的全部科技术语都具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下文提供了以下术语。1.1.缩写和首字母缩写如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定：ABTS2,2-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸AE或AEO醇乙氧基化物AES或AEOS醇乙氧基硫酸盐AkAA白曲霉(Aspergilluskawachii)α-淀粉酶AnGA黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖淀粉酶AOSα-烯烃磺酸盐AS烷基硫酸盐cDNA互补DNACMC羧甲基纤维素DE右旋糖当量DNA脱氧核糖核酸DPn具有n个亚基的糖聚合度ds或DS干固形物DTMPA二亚乙基三胺五乙酸EC酶学委员会EDTA乙二胺四乙酸EO环氧乙烷(聚合物片段)EOF发酵结束GA葡糖淀粉酶GAU/gds葡糖淀粉酶活性单位/克干固形物HFCS高果糖玉米糖浆HgGA灰腐质霉(Humicolagrisea)葡糖淀粉酶IPTG异丙基β-D-硫代半乳糖苷IRS不溶性残余淀粉kDa千道尔顿LAS直链烷基苯磺酸盐LAT,BLA地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶MW分子量MWU改进的Wohlgemuth单位；1.6×10-5mg/MWU＝活性单位NCBI美国国家生物技术信息中心NOBS壬酰羟苯磺酸盐NTA次氨基乙酸OxAmPurastarHPAM5000L(DaniscoUSInc.)PAHBAH对羟基苯甲酸酰肼PEG聚乙二醇pI等电点PI性能指数ppm百万分之一，例如，μg蛋白质/g干固形物PVA聚(乙烯醇)PVP聚(乙烯吡咯烷酮)RCF相对离心/向心力(即，×重力)RNA核糖核酸SAS链烷磺酸盐SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SSF同时糖化和发酵SSU/g固形物可溶性淀粉单位/克干固形物sp.物种TAED四乙酰基乙二胺Tm熔融温度TrGA里氏木霉(Trichodermareesei)葡糖淀粉酶w/v重量/体积w/w重量/重量v/v体积/体积wt％重量％℃摄氏度H2O水dH2O或DI去离子水dIH2O去离子水，Milli-Q过滤g或gm克μg微克mg毫克kg千克μL和μl微升mL和ml毫升mm毫米μm微米M摩尔浓度mM毫摩尔浓度μM微摩尔浓度U单位sec秒min(s)分钟hr(s)小时DO溶解氧Ncm牛顿厘米ETOH乙醇eq.当量N当量浓度MWCO截留分子量SSRL斯坦福同步辐射光源PDB蛋白质数据库CAZy碳水化合物活性酶数据库Tris-HCl三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐HEPES4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸mS/cm毫西门子/厘米CV柱体积1.2.定义术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指除了别的以外能够催化淀粉降解的酶。α-淀粉酶是切割淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。一般来讲，α-淀粉酶(EC3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为内切作用酶，其以随机方式切割淀粉分子中的α-D-(1→4)O-糖苷键，生成包含三个或更多个(1-4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖。相反，外切作用淀粉分解酶诸如β-淀粉酶(EC3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖α-淀粉酶(EC3.2.1.133)从底物的非还原端切割多糖分子。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)及产物特异性淀粉酶如麦芽四糖苷酶(EC3.2.1.60)和麦芽糖己糖苷酶(EC3.2.1.98)能够生成特定长度的麦芽低聚糖或特定麦芽低聚糖的浓缩糖浆。术语“蛋白酶(protease)”和“蛋白酶(proteinase)”是指具有执行“蛋白质水解”或“蛋白水解裂解”的能力的酶蛋白，所述“蛋白质水解”或“蛋白水解裂解”是指肽或形成蛋白质的多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解。作为蛋白质消化酶的蛋白酶的这种活性被称为“蛋白质水解活性”。许多众所周知的方法适用于测量蛋白质水解活性(参见例如Kalisz,“MicrobialProteinases,”In:Fiechter编辑，AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,(1988))。例如，蛋白质水解的活性可通过比较测定法探知，该比较测定法分析了相应蛋白酶水解商业底物的能力。在蛋白酶或蛋白质水解的活性分析中可用的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(SigmaC-9801)、牛胶原(SigmaC-9879)、牛弹性蛋白(SigmaE-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical902111)。利用这些底物的比色测定法是本领域所熟知的(参见例如，WO99/34011和美国专利6,376,450，这两份专利均以引用方式并入本文)。pNA测定法(参见例如DelMar等人，Anal.Biochem.99:316-320)也可用于测定在梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定法测量了随着酶水解可溶性合成肽底物(诸如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA))而释放对硝基苯胺的速率，并且裂解发生在C端氨基酸(苯丙氨酸)和p-NA之间，从而导致从水解反应中产生黄色，所述黄色在分光光度计上在410nm处进行测量并且与活性酶浓度成比例。对颜色变化的测量使得对反应速率的计算成为可能。此外，可使用在280纳米(nm)处的吸光度测量值来测定总蛋白质浓度。在使用参考标准时，通过活性酶/总蛋白质比率得出酶纯度。术语“丝氨酸蛋白酶”是指裂解蛋白质中肽键的酶，在所述酶中丝氨酸充当酶活性位点处的亲核氨基酸。丝氨酸蛋白酶基于其结构分成两大类：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)或枯草杆菌蛋白酶样。在衣物洗涤剂和盘碟洗涤剂中最常用的是丝氨酸蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶。术语“TIM桶状结构”是指包括沿肽主链交替分布的8个α-螺旋和8个平行的β-链的三维多肽结构。就多肽中的氨基酸残基而言，术语“表面暴露的”是指在多肽完整并且正确折叠(即非变性或片段化)时，位于多肽外表面的残基。就α-淀粉酶而言，这种结构称之为TIM桶状结构。就多肽中的氨基酸残基而言，术语“非经典的”(non-canonical)是指基于使用采取默认参数的ClustalW进行的类似分子的氨基酸序列比对，通常不会存在于给定位置的残基。在一些情况下，特定残基存在于10个类似分子中的仅一个的给定位置处、20个类似分子中的一个的给定位置处、30个类似分子中的一个的给定位置处、50个类似分子中的一个的给定位置处、或甚至100个类似分子中的一个的给定位置处。本文中“酶单位”是指在指定的测定条件下，每单位时间形成的产物的量。例如，“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)被定义为在60℃、pH4.2下，每小时从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1g葡萄糖的酶量。“可溶性淀粉单位”(SSU)是在pH4.5、50℃下，每分钟从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1mg葡萄糖的酶量。DS是指“干固形物”。术语“淀粉”是指由植物的络合多糖碳水化合物构成的任何材料、由具有式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉构成的任何材料，其中x可为任何数目。该术语包括基于植物的材料，诸如谷粒、谷物、草、块茎和根，以及更具体地讲得自小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸皮、木薯(cassava)、粟、蜀黍、马铃薯、甘薯和木薯淀粉(tapioca)的材料。术语“淀粉”包括颗粒状的淀粉。术语“颗粒状的淀粉”是指生淀粉，即，未煮过的淀粉，例如未经糊化的淀粉。就多肽而言，术语“野生型”、“亲本的”或“参考的”是指天然存在的多肽，所述多肽不包括在一个或多个氨基酸位置处的人为置换、插入或缺失。相似地，就多核苷酸而言，术语“野生型”、“亲本的”或“参考的”是指天然存在的多核苷酸，所述多核苷酸不包含人为的核苷改变。然而，应当注意，编码野生型、亲本的或参考的多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本的或参考的多肽的任何多核苷酸。提及的野生型多肽应理解为包括所述多肽的成熟形式。“成熟的”多肽或其变体是不存在信号序列的多肽，例如，在该多肽的表达过程中或之后信号序列从该多肽的未成熟形式裂解。就多肽而言，术语“变体”是指多肽与指定的野生型、亲本的或参考的多肽不同之处在于，其包括一个或多个人为的氨基酸的置换、插入或缺失。该野生型、亲本的或参考的多肽或多核苷酸的种类在上下文中将是显而易见的。突变由标准命名法指示，例如，X1NX2，其中X1为初始的氨基酸残基，N为氨基酸位置编号，并且X2为最终的氨基酸残基。缺失由“del”或Δ后跟一个或多个氨基酸位置编号来表示。单一α-淀粉酶多肽中的突变组合(如“组合变体”的情况)可通过如下方式指示：用短划线(-)分隔各个突变，用加号(+)分隔各个突变，用斜杠(/)分隔各个突变，或用适当文本语境指示，而不作区分。就本发明的α-淀粉酶而言，“活性”是指α-淀粉酶活性，可以按照本文所述进行测量。在结合对象细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组的”表明所述对象已从其天然状态经过修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因，或者以不同于天然水平的水平或在不同于天然存在的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列有一个或多个核苷酸不同并且/或者重组核酸有效连接至异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白可以与天然序列有一个或多个氨基酸不同并且/或者重组蛋白与异源序列融合。包含编码淀粉酶的核酸的载体是重组载体。术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指从天然存在的与之天然伴随的至少一种其它材料或组分移出的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其它指定材料或组分。其“分离的”多肽包括但不限于包含异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养液。术语“经纯化的”是指处于相对纯净状态，例如，至少约90％纯的、至少约95％纯的、至少约98％纯的、或甚至至少约99％纯的材料(例如分离的多肽或多核苷酸)。术语“富集的”是指约50％纯的、至少约60％纯的、至少约70％纯的、或甚至至少约70％纯的材料(例如分离的多肽或多核苷酸)。关于酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶暴露于升高的温度后保持活性的能力。通过以分钟、小时或天给出的酶半衰期(t1/2)测量酶(诸如淀粉酶)的热稳定性，在所述酶半衰期期间半数的酶活性在限定条件下丧失。可通过在暴露于升高的温度(即，通过升高的温度攻击)后测量残余的α-淀粉酶活性来计算半衰期。关于酶的“pH范围”是指在其中酶表现出催化活性的pH值的范围。关于酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及酶在宽泛的pH值范围内、在预定时段内(例如15分钟、30分钟、1小时)保持活性的能力。术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为“酶”。使用了氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，以标准的氨基至羧基末端取向(即，N→C)呈现氨基酸序列。术语“核酸”涵盖了DNA、RNA、异源双链体以及能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，并且可被化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码具有简并性，可使用一种以上的密码子来编码特定氨基酸，本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另外指明，否则核酸序列以5′至3′取向呈现。“杂交”是指在印迹杂交技术和PCR技术中发生的一条核酸链与互补链形成双链(即与互补链碱基配对)的过程。严格杂交条件通过在下列条件下的杂交举例说明：65℃和0.1XSSC(其中1XSSC＝0.15MNaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH7.0)。杂交的双链核酸通过熔融温度(Tm)来表征，在所述温度下杂交的核酸的一半与互补链未配对。在双链内错配的核苷酸降低了Tm。“合成的”分子是通过体外化学合成或酶法合成而非通过生物体制备的。结合细胞使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”是指细胞包含非天然的(例如异源的)核酸序列，所述非天然核酸序列整合进细胞基因组中或作为附加体携带，在经历多个世代后仍得以保留。在将核酸序列插入细胞中的上下文中，术语“引入的”是指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其它DNA构建体(包括编码所关注的多肽(例如淀粉酶)的多核苷酸)的生物体。示例性宿主菌株是能够表达所关注的多肽和/或发酵糖类的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞生成的原生质体。关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源性的”是指并非在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源性的”是指在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。“选择标记”或“选择性标记”是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于选择携带该基因的宿主细胞。选择性标记的示例包括但不限于抗微生物物质(例如，潮霉素、博莱霉素或氯霉素)和/或赋予代谢优势(诸如对宿主细胞的营养优势)的基因。“载体”是指这样的多核苷酸序列，其被设计用于将核酸引入一个或多个细胞类型中。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。“表达载体”是指包含编码所关注的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列有效连接至合适的控制序列，所述控制序列能够影响DNA在合适宿主中的表达。此类控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码在mRNA上的合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。术语“有效连接”是指指定的组分处于一种允许它们以预期方式发挥功能的关系(包括但不限于毗邻)。例如，调控序列有效连接至编码序列，使得编码序列的表达受到调控序列的控制。“信号序列”是连接至蛋白质的N端部分的氨基酸序列，其有利于蛋白质分泌至细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式不含信号序列，它在分泌过程中被切除。“生物活性”是指序列具有指定的生物活性，诸如酶活性。术语“比活性”是指在特定条件下，每单位时间能通过酶或酶制剂转化为产物的底物摩尔数。比活性通常表示为单位(U)/mg蛋白质。如本文所用，“水硬度”是水中存在的矿物质(例如钙和镁)的量度。如本文所用，“有效量的淀粉酶”或类似表述是指足以在特定应用中产生可见的或以其它方式可测量的淀粉水解量的淀粉酶量。淀粉水解可产生例如织物或餐具的可见清洁度，降低淀粉浆料或醪液的粘度，等等。“样本”是一块具有施加于其上的污渍的材料(诸如织物)。该材料可为例如由棉花、聚酯、或天然纤维和合成纤维的混合物制成的织物。样本还可为纸，诸如滤纸或硝化纤维素，或一块硬的材料，诸如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，所述污渍是基于淀粉的，但可包括血液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、鸡蛋、奶酪、粘土、颜料、油、或这些化合物的混合物。“较小的样本”是已被单孔打孔装置切割下来的或已被定制生产的96孔打孔装置切割下来的样本的部分，其中多孔打孔的模式与标准96孔微量滴定板相匹配，或者该部分已以其它方式从样本中脱离下来。样本可为纺织物、纸、金属或其它合适的材料。该较小的样本置于24孔、48孔或96孔微量滴定板的孔中之前或之后，可具有附着于其上的污渍。也可通过在小块材料上施加污渍来制成该较小的样本。例如，该较小的样本可为具有5/8″或0.25″直径的脏污织物块。定制生产的打孔器以一定方式设计，使得其能同时将96个样本递送至96孔板的所有孔中。该装置允许通过简单填充同一96孔板多次来在每孔递送一个以上的样本。可想到多孔打孔装置同时递送样本至任何格式的板，包括但不限于24孔板、48孔板和96孔板。在另一个可想到的方法中，污垢测试平台可为涂覆有污垢基底的、由金属、塑料、玻璃、陶瓷或其它合适的材料制成的小珠。然后将一个或多个经涂覆的小珠置于96孔板、48孔板或24孔板或更大格式的板的孔中，其中包含合适的缓冲液和酶。“包含淀粉酶的培养的细胞材料”或类似的语言是指包含淀粉酶作为组分的细胞裂解液或上清液(包括培养基)。所述细胞材料可来源于出于制备淀粉酶的目的生长在培养基中的异源宿主。“百分比序列同一性”是指在使用采取默认参数的CLUSTALW算法进行比对时，特定序列具有至少一定百分比的氨基酸残基与指定的参考序列的那些氨基酸残基相同。参见Thompson等人，(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680。CLUSTALW算法的默认参数是：与参考序列相比，将缺失作为非相同残基计数。发生在任一末端的缺失也包括在内。例如，C端缺失五个氨基酸残基的变体500-氨基酸残基多肽相对于亲本多肽将具有99％的序列同一性百分比(495/500的相同残基×100)。这种变体将被用语“与亲本具有至少99％序列同一性的变体”所涵盖。“融合的”多肽序列通过两个对象多肽序列之间的肽键连接，即，有效地连接。术语“丝状真菌”是指真菌亚门的所有丝状形式，特别是盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。术语“聚合度”(DP)是指在给定糖类中无水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的示例是单糖葡萄糖和果糖。DP2的示例是二糖麦芽糖和蔗糖。术语“DE”或“右旋糖当量”被定义为在糖浆中作为总碳水化合物一部分的还原糖(即，D-葡萄糖)的百分比。术语“干固形物含量”(ds)是指以干重百分比计的浆料总固形物。术语“浆料”是指包含不溶性固形物的含水混合物。短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指一种制备生化制品的工艺，其中在同一工艺步骤期间存在微生物体(诸如产乙醇微生物)和至少一种酶(诸如淀粉酶)。SSF包括在同一反应容器中同时水解淀粉底物(颗粒状的、液化的或溶解的)成糖类(包括葡萄糖)并且将所述糖类发酵成醇或其它生化制品或生物材料。“产乙醇微生物”是指具有将糖或低聚糖转化为乙醇的能力的微生物。术语“发酵饮料”是指通过包括发酵过程(诸如微生物发酵，例如细菌和/或真菌发酵)的方法制备的任何饮料。“啤酒”是这种发酵饮料的示例，并且术语“啤酒”意在包括通过含淀粉植物材料的发酵/酿造制备的任何发酵麦芽汁。通常，啤酒是专门由麦芽或辅料、或者麦芽和辅料的任何组合制备的。术语“麦芽”是指任何发芽的谷类谷粒，诸如发芽的大麦或小麦。术语“辅料”是指任何非麦芽(诸如大麦麦芽或小麦麦芽)的含淀粉和/或糖的植物材料。辅料的示例包括常见的玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙的谷物、谷物片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯淀粉、木薯和糖浆，诸如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖糖浆、大麦和/或小麦糖浆等等。术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料诸如粗麦芽粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其它辅料或它们的组合的含水浆料，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化过程中对谷粉进行提取后未发酵的液体流出物(run-off)。“碘试验阳性淀粉”或“IPS”是指(1)在液化和糖化过程后未水解的直链淀粉，或(2)回生的淀粉聚合物。当用碘测试经糖化的淀粉或糖液时，高DPn的直链淀粉或回生的淀粉聚合物与碘结合并生成特征性的蓝色。因此该糖液被称为“碘试验阳性糖”、“蓝色糖类”或“蓝糖”。术语“回生的淀粉”或“淀粉回生”是指在老化过程中淀粉糊或凝胶自发产生的变化。术语“约”是指在参考值基础上±15％。2.对蛋白酶敏感性降低的变体α-淀粉酶本发明的组合物和方法的一个方面涉及与其来源亲本α-淀粉酶相比对蛋白水解裂解敏感性降低的变体α-淀粉酶。不受理论约束，据信某些α-淀粉酶在对蛋白水解裂解较敏感的表面暴露的环中包含氨基酸序列。此类序列可能逐步形成，目的是使α-淀粉酶在存在蛋白酶的情况下变得不稳定，例如，以调控α-淀粉酶在某些条件下的活性。作为另外一种选择，此类序列可能因亲本α-淀粉酶通常不暴露于存在蛋白酶的环境而逐步形成，在这种情况下，没有促进对蛋白酶的抗性的选择性压力。不论此类序列因何种原因而存在，已观察到一些在工业应用中表现出优异的淀粉水解活性和性能的α-淀粉酶却没有商业价值，原因仅仅是它们对蛋白酶很敏感。本发明组合物和方法允许此类α-淀粉酶用于已知存在或预计存在蛋白酶的应用中。如所附实施例中详述，来自解凝乳类芽孢杆菌(Paenibacilluscurdlanolyticus)的α-淀粉酶(PcuAmy1)显示具有较高水平的淀粉水解活性，并且在清洁测定法中，经工程改造的变体优于商业基准品。然而，已证实，亲本α-淀粉酶及其初始变体对蛋白酶高度敏感，这使得它们不适合与蛋白酶组合使用，而高效衣物和盘碟洗涤剂几乎必定包含蛋白酶诸如枯草杆菌蛋白酶，因此它们不适合在这些洗涤剂中使用。在存在迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentis)枯草杆菌蛋白酶(GG36，DuPontIndustrialBiosciences,PaloAlto,CA,USA)的情况下温育之后，反应产物的质谱分析符合PcuAmy1在残基Q334与L336之间发生水解。图1A至图1C示出了使用ClustalW(默认参数)对之前所述用于商业应用的若干种α-淀粉酶进行的氨基酸序列比对，所述α-淀粉酶包括来自芽孢杆菌属(Bacillus)物种707的α-淀粉酶(SEQIDNO:54)、来自芽孢杆菌属物种AA560的α-淀粉酶(SEQIDNO:55)、来自芽孢杆菌属物种7-7的α-淀粉酶(SEQIDNO:56)、来自芽孢杆菌属物种SP722的α-淀粉酶(SEQIDNO:57)、来自地衣芽孢杆菌(Bacillusliecheniformis)的α-淀粉酶[LAT(SEQIDNO:48)；BLA(SEQIDNO:49)]、来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquifaciens)的α-淀粉酶(BAA；SEQIDNO:50)、来自噬细胞菌属(Cytophaga)物种的α-淀粉酶(SEQIDNO:51)、来自芽孢杆菌属物种DSM90的α-淀粉酶(SEQIDNO:52)、来自芽孢杆菌属物种SG-1的α-淀粉酶(SEQIDNO:53)、来自芽孢杆菌属物种TS-23的α-淀粉酶(SEQIDNO:58)、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillussterothermophilus)的α-淀粉酶(BSG；SEQIDNO:59)以及PcuAmy1(SEQIDNO:3)。LAT和BLA均为地衣芽孢杆菌(B.liecheniformis)α-淀粉酶，但在一些位置处氨基酸序列有差别。除非另行指出，否则在图1A至图1C及通篇中使用的氨基酸编号均参照PcuAmy1(SEQIDNO:3)。残基333、335、337、338和251在PcuAmy1中以粗体显示。第322位与第355位之间的一级氨基酸序列在各α-淀粉酶中高度保守，其中这些序列形成如下的一部分：β-桶状结构的第7条链、第7个螺旋以及在该分子的TIM桶状结构中连接这些结构的环。残基333和335位于上述环的表面暴露部分中。第333位处的残基通常为甘氨酸，但有时为谷氨酸。第337位处的残基通常为丝氨酸或丙氨酸。在解凝乳类芽孢杆菌(P.curdlanolyticus)α-淀粉酶中，占据这些位置的残基分别是苏氨酸和丙氨酸。第333位处苏氨酸的存在在α-淀粉酶内特别罕见。如所附实施例中所述，解凝乳类芽孢杆菌α-淀粉酶第333位处存在的苏氨酸置换为经典甘氨酸，会显著降低α-淀粉酶对蛋白水解裂解的敏感性。第335位处存在的丙氨酸的进一步置换会进一步降低α-淀粉酶对蛋白水解裂解的敏感性，但第333位处的置换明显最重要。降低解凝乳类芽孢杆菌α-淀粉酶对蛋白水解裂解的敏感性这一能力，允许该α-淀粉酶的变体用于已知存在或疑似存在蛋白酶的商业应用中。虽然使用特定α-淀粉酶来鉴定造成蛋白酶敏感性降低的突变，但本发明突变和方法也可应用于其它蛋白酶敏感型α-淀粉酶，所述α-淀粉酶在TIM桶状结构中的连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环中包含非经典、表面暴露的残基。此类α-淀粉酶可通过氨基酸序列比对来鉴定，如图1A至图1C所示。连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环的精确起点和终点对于不同α-淀粉酶而言可能略有差异，但可基于常用工业α-淀粉酶的结构对蛋白酶敏感型α-淀粉酶进行建模，从而准确地确定环的精确起点和终点，所述常用工业α-淀粉酶诸如为来自地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶，它们的结构可经由结构生物信息学研究联合会(ResearchCollaboratoryforStructuralBioinformatics(RCSB))蛋白质数据库(ProteinDataBank(PDB))获取。环中的表面暴露的残基可通过相同方式鉴定。鉴于所述发现，本发明组合物和方法的一方面是一种通过如下方式降低α-淀粉酶对蛋白水解裂解敏感性的方法：将亲本α-淀粉酶TIM桶状结构中的连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环中非经典、表面暴露的残基置换为不同的氨基酸残基，从而产生变体α-淀粉酶，其中与亲本α-淀粉酶相比，变体α-淀粉酶对于由蛋白酶进行的对连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环的裂解具有降低的敏感性。在一些实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有除甘氨酸或谷氨酰胺之外的氨基酸残基。在特定实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第333位相对应的位置处具有苏氨酸。在一些实施方案中，在与第333位相对应的位置处的氨基酸残基被置换为甘氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，所述方法还包括将存在于与亲本α-淀粉酶中的第335位相对应的位置处的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基。在一些实施方案中，亲本α-淀粉酶在与第335位相对应的位置处具有除丝氨酸之外的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述置换是换为丝氨酸。在一些实施方案中，α-淀粉酶对其较敏感的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在特定实施方案中，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶，包括所述用于衣物和盘碟洗涤组合物的众多变体中的任何一种，包括具有改善的冷水清洁性能的变体。本发明组合物和方法的另一方面是通过上述方法制备的变体α-淀粉酶。此类变体可基于任何CAZy家族13α-淀粉酶，这些α-淀粉酶对蛋白水解裂解较敏感，原因在于在TIM桶状结构中的连接β-桶状结构的第7条链和第7个螺旋的环中，在表面暴露的残基处具有非经典的氨基酸残基。在一些实施方案中，变体α-淀粉酶与解凝乳类芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQIDNO:3)具有限定程度的氨基酸序列同一性，例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶源自亲本淀粉酶，所述亲本淀粉酶与解凝乳类芽孢杆菌α-淀粉酶具有限定程度的氨基酸序列同一性，例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体α-淀粉酶包含相对于亲本α-淀粉酶而言一个或若干个氨基酸残基的保守置换。示例性保守氨基酸置换列于表1中。一些保守突变可通过遗传操纵产生，而其它保守突变通过以其它方式将合成氨基酸引入多肽中而产生。表1.保守氨基酸置换在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶包含相对于亲本α-淀粉酶的氨基酸序列而言一个或一些氨基酸残基的缺失、置换、插入或添加。示例性缺失、置换和插入对应于CAZy家族13α-淀粉酶中产生的那些。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶源自亲本α-淀粉酶的氨基酸序列，具体方式是相对于亲本α-淀粉酶的氨基酸序列而言一个或一些氨基酸残基的缺失、置换、插入或添加。在所有情况下，表述“一个或一些氨基酸残基”是指10个或更少氨基酸残基，即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述变体包含这样的突变，所述突变能进一步改善其性能或稳定性，例如，热稳定性、洗涤剂稳定性、氧化稳定性、淀粉水解活性、低温性能、表达、溶解度等等。示例性突变是针对其它CAZy家族13α-淀粉酶所述的那些突变。在一些实施方案中，所述突变是在与第177位、第178位、第179位和第180位相对应的位置处缺失一个或多个氨基酸残基。在特定实施方案中，所述突变是在第177位和第178位处或者在第179位和第180位处成对缺失残基。在一些实施方案中，所述突变是将存在于与第186位相对应的位置处的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基。在特定实施方案中，所述突变等同于E186P。在一些实施方案中，所述突变是将存在于与第472位相对应的位置处的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基。在特定实施方案中，所述突变是G472K或G472R。在一些实施方案中，性能突变位于位置N125、F152、N205和G473中的一个或多个位置处。突变的示例性组合如下所示：N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K；N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K；N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R；N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K；N125Y+E186P+T333G+A335S+G472K；N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472K；N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+G472R+G473R；N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+G472K；N125Y+E186P+T333G+G472K；N125Y+F152W+E186P+T333G+G472K；N125Y+F152W+E186P+T333G+G472R+G473R；以及N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+G472K。突变的这些组合可与上述缺失组合。本发明变体α-淀粉酶可为“前体”、“未成熟的”或“全长的”，在这种情况下其包含信号序列，或者本发明变体α-淀粉酶可为“成熟的”，在这种情况下其不含信号序列。多肽的成熟形式一般最有用。除非另有说明，否则本文所用的氨基酸残基编号是指相应淀粉酶多肽的成熟形式。本发明淀粉酶多肽也可被截短而去除N端或C端，只要所得多肽保持淀粉酶活性即可。本发明淀粉酶可为“嵌合”或“杂合”多肽，其中包含第一淀粉酶多肽的至少一部分和第二淀粉酶多肽的至少一部分(此类嵌合淀粉酶最近被“重新发现”为结构域交换的淀粉酶)。本发明淀粉酶还可包含异源信号序列、表位以允许追踪或纯化等等。示例性异源信号序列来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(AmyE或AprE)和链霉菌(Streptomyces)CelA。在另一方面，提供了编码α-淀粉酶多肽的核酸。在一些实施方案中，所述核酸在严格或非常严格条件下杂交于与编码PcuAmy1α-淀粉酶的核酸诸如SEQIDNO:1互补的核酸。核酸可编码“全长”(“fl”或“FL”)淀粉酶(包含信号序列)、仅淀粉酶的成熟形式(不含信号序列)、或淀粉酶的截短形式(不含成熟形式的N端或C端)。优选地，所述核酸具有编码活性淀粉酶的足够长度。在所有情况下，所述核酸编码这样的α-淀粉酶，其包含与本文所述的那些突变相对应的突变，并且与对应的亲本α-淀粉酶相比，对蛋白酶的敏感性降低。编码α-淀粉酶的核酸能够有效连接至适于在宿主细胞中表达α-淀粉酶的载体中的各种启动子和调控子。示例性启动子来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(AmyE或AprE)和链霉菌CelA。这种核酸也能连接至其它编码序列，例如，用以编码嵌合多肽。3.α-淀粉酶的制备本发明α-淀粉酶可以在宿主细胞中，例如通过分泌或细胞内表达来制备。在α-淀粉酶分泌至细胞培养基中后，可获得包含α-淀粉酶的培养细胞材料(例如，全细胞培养液)。任选地，α-淀粉酶可分离自宿主细胞、或甚至分离自细胞培养液，具体取决于最终α-淀粉酶的所需纯度。可根据本领域所熟知的方法克隆和表达编码α-淀粉酶的基因。合适的宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。尤其可用的宿主细胞包括黑曲霉、米曲霉(Aspergillusoryzae)或里氏木霉。其它宿主细胞包括细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，以及链霉菌。宿主细胞还可表达编码同源或异源的葡糖淀粉酶(即，与该宿主细胞不属同一物种的葡糖淀粉酶)或一种或多种其它酶的核酸。葡糖淀粉酶可为变体葡糖淀粉酶，诸如在例如美国专利8,058,033(DaniscoUSInc.)中公开的葡糖淀粉酶变体之一。另外，宿主可表达一种或多种辅助的酶、蛋白质、肽。这些可有益于液化、糖化、发酵、SSF等工艺。此外，除了用于消化各种原料的酶之外，宿主细胞还可产生生化制品。此类宿主细胞可用于发酵或同时糖化和发酵工艺以降低或消除添加酶的需要。3.1.载体可构建包含编码α-淀粉酶的核酸的DNA构建体以在宿主细胞中表达。由于熟知的遗传密码简并性，能够以常规技能设计和制备编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸。本领域中同样熟知的是优化对于特定宿主细胞的密码子使用。可将编码α-淀粉酶的核酸掺入到载体中。可使用熟知的转化技术(诸如下面公开的那些)将载体转移至宿主细胞。载体可为能被转化到宿主细胞中并且在宿主细胞内复制的任何载体。例如，可将包含编码α-淀粉酶的核酸的载体在细菌宿主细胞中转化并复制，作为繁殖和扩增载体的方法。也可将载体转化到表达宿主中，使得编码核酸可表达为有功能的淀粉酶。充当表达宿主的宿主细胞可包括例如丝状真菌。真菌基因种源中心(FungalGeneticsStockCenter，FGSC)的菌株目录列出了适用于在真菌宿主细胞中表达的载体。请登录www.fgsc.net，查看FGSC，菌株目录，密苏里大学(UniversityofMissouri)(最后修改于2007年1月17日)。代表性的载体是pJG153，这是一种可在细菌宿主中复制的无启动子的Cre表达载体。参见Harrison等人，(2011)AppliedEnviron.Microbiol.77:3916-22。可用常规技能修饰pJG153以包含和表达编码淀粉酶变体的核酸。编码α-淀粉酶的核酸可有效连接至合适的启动子，其允许在宿主细胞中转录。启动子可以是在所选的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，并且可来源于编码与所述宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码α-淀粉酶的DNA序列的转录(尤其是在细菌宿主中)的示例性启动子是大肠杆菌(E.coli)的lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，可用的启动子的示例是来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉(A.niger)酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂酶、米曲霉(A.oryzae)碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。当编码淀粉酶的基因在细菌物种诸如大肠杆菌中表达时，合适的启动子可选自例如包含T7启动子和噬菌体λ启动子的细菌噬菌体启动子。用于在酵母物种中表达的合适启动子的示例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Gal1和Gal10启动子，以及巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的AOX1或AOX2启动子。cbh1是来自里氏木霉(T.reesei)的内源性的、诱导型启动子。参见Liu等人，(2008)“ImprovedheterologousgeneexpressioninTrichodermareeseibycellobiohydrolaseIgene(cbh1)promoteroptimization,”ActaBiochim.Biophys.Sin(Shanghai)40(2):158-65。所述编码序列可有效连接至信号序列。编码信号序列的DNA可以是与待表达的淀粉酶基因天然相关联的、或来自不同属或种的DNA序列。构成DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列可被引入到真菌宿主细胞中，并可源自相同来源。例如，信号序列为有效连接至cbh1启动子的cbh1信号序列。表达载体也可包含合适的转录终止子以及在真核生物中的多腺苷酸化序列，其有效连接至编码α-淀粉酶的DNA序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适当地源自与启动子相同的来源。所述载体还可包含使得该载体在宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的示例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。所述载体还可包含选择性标记，例如，其产物补偿了分离的宿主细胞中的缺陷的基因(诸如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因)或赋予抗生素抗性(诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，所述载体可包含曲霉(Aspergillus)选择标记，诸如amdS、argB、niaD和xxsC，生成潮霉素抗性的标记，或通过诸如本领域已知的共转化完成选择。参见例如，国际PCT专利申请WO91/17243。细胞内表达在一些方面可能是有利的，例如，在使用某些细菌或真菌作为宿主细胞以制备大量淀粉酶用于后续富集或纯化时。也可利用淀粉酶向培养基中的细胞外分泌以制备包含所述分离的淀粉酶的培养细胞材料。表达载体通常包含克隆载体的组分，诸如允许载体在所选择的宿主生物中自主复制的元件和一个或多个用于选择目的的表型上可检测的标记。所述表达载体通常包含控制核苷酸序列，诸如启动子、操纵子、核糖体结合位点、转录起始信号和任选地阻遏蛋白基因或一个或多个激活因子基因。另外，表达载体可包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将淀粉酶靶向至宿主细胞的细胞器(诸如过氧化物酶体)或靶向至特定宿主细胞隔室。这种靶向序列包括但不限于序列SKL。为了在控制序列的指导下表达，淀粉酶的核酸序列以相对于表达而言正确的方式有效连接至控制序列。用于分别连接编码淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其它元件，以及将其插入到合适的包含复制所需信息的载体的方法是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor,1989以及第三版，2001。3.2.宿主细胞的转化和培养包含DNA构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组制备淀粉酶过程中的宿主细胞。可用编码所述酶的DNA构建体，方便地通过将DNA构建体(一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中来转化所述细胞。这种整合一般认为是有利的，因为所述DNA序列更可能稳定地保持在细胞中。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组，将DNA构建体整合到宿主染色体中。作为另外一种选择，可用如上所述与不同类型宿主细胞相关的表达载体转化细胞。合适的细菌宿主生物的示例为革兰氏阳性菌物种，诸如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、短小芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(以前的嗜热脂肪芽孢杆菌)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；链霉菌物种，诸如鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属(Lactococcus)物种，诸如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)；乳杆菌属(Lactobacillus)物种，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；明串珠菌属(Leuconostoc)物种；片球菌属(Pediococcus)物种；以及链球菌属(Streptococcus)物种。作为另外一种选择，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株可被选作宿主生物。合适的酵母宿主生物可选自生物技术相关的酵母物种，诸如但不限于酵母物种诸如毕赤酵母属(Pichia)物种、汉逊酵母属(Hansenula)物种、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种；或酵母菌属(Saccharomyces)的物种(包括酿酒酵母)，或属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种，诸如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种的一个菌株，巴斯德毕赤酵母，可用作宿主生物。作为另外一种选择，宿主生物可为汉逊酵母属物种。在丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉的物种，例如，黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。作为另外一种选择，镰孢属(Fusarium)物种的菌株(例如，尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum))或根毛霉属(Rhizomucor)物种的菌株(诸如米黑根毛霉)可用作宿主生物。其它合适的菌株包括嗜热真菌属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor)物种。此外，木霉属(Trichoderma)物种可用作宿主。用于转化曲霉属宿主细胞的合适方法包括例如EP238023中所述的方法。由真菌宿主细胞表达的淀粉酶可为糖基化的，即，将包含糖基部分。该糖基化模式可与野生型淀粉酶中存在的糖基化模式相同或不同。糖基化的类型和/或程度可赋予酶和/或生化特性的变化。在可通过转化的表达载体修复基因缺陷的情况下，从表达宿主缺失基因是有利的。可使用已知的方法获得具有一个或多个失活的基因的真菌宿主细胞。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过任何其它使得基因对于其预期用途失去功能的方法来实现基因失活，以便阻止该基因表达有功能的蛋白质。可缺失任何来自木霉属物种或其它丝状真菌宿主的被克隆的基因，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。可采用本领域已知的方法，通过将期望失活的基因的一种形式插入到质粒中来实现基因缺失。将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括诸如以下的技术：转化；电穿孔；细胞核显微注射；转导；转染，例如微脂粒感染介导的和DEAE-糊精介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀一起温育；用DNA包被的微粒子弹进行高速轰击；以及原生质体融合。常规转化技术在本领域中是已知的。参见例如Sambrook等人(2001)，同上文。例如在美国专利6,022,725中描述了在木霉中表达异源蛋白质。也可参见Cao等人，(2000)Science9:991-1001，了解曲霉菌株的转化。可用载体系统构建遗传上稳定的转化体，由此编码淀粉酶的核酸稳定地整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术选择和纯化转化体。用于转化的木霉属物种的制备例如可涉及由真菌菌丝制备原生质体。参见Campbell等人，(1989)Curr.Genet.16:53-56。可从萌发的营养性孢子获得菌丝。用消化细胞壁的酶处理菌丝，得到原生质体。原生质体受到悬浮培养基中存在的渗透性稳定剂的保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等等。通常这些稳定剂的浓度在介于0.8M和1.2M之间变化，例如，在悬浮培养基中可使用1.2M的山梨醇溶液。宿主木霉属物种菌株中DNA的摄入取决于钙离子浓度。一般来讲，在摄入溶液中使用的浓度在约10-50mMCaCl2之间。另外的合适的化合物包括缓冲体系，诸如TE缓冲液(10mMTris，pH7.4；1mMEDTA)或10mMMOPS(pH6.0)和聚乙二醇。据信聚乙二醇会使细胞膜融合，因此允许培养基的内容物递送到木霉属物种菌株的细胞质中。在很多情况下，这种融合使得多个拷贝的质粒DNA整合到宿主染色体中。通常木霉属物种的转化使用已经过渗透性处理的原生质体或细胞，通常密度为105至107/mL，尤其是2×106/mL。可将100μL体积的在适当溶液(例如，1.2M山梨醇和50mMCaCl2)中的这些原生质体或细胞与期望的DNA混合。一般来讲，摄入溶液中添加了高浓度PEG。可将0.1至1体积的25％PEG4000添加到原生质体悬浮液中；然而，可用的是将约0.25体积添加到原生质体悬浮液中。也可将添加剂诸如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等等添加到摄入溶液以有利于转化。类似的方法可用于其它真菌宿主细胞。参见例如美国专利6,022,725。3.3.表达制备淀粉酶的方法可包括在有利于制备所述酶的条件下培养如上所述的宿主细胞并从细胞和/或培养基回收酶。用于培养细胞的培养基可以是任何适用于培养所考虑的宿主细胞并获得淀粉酶的表达的常规培养基。合适的培养基和培养基组分可得自商业供应商或可根据已出版的配方来制备(例如，如美国典型培养物保藏中心的目录所述)。由宿主细胞分泌的酶可用于全培养液制品。在本发明的方法中，可使用本领域已知的任何培养方法实现重组微生物的耗尽全发酵液的制备，从而得到α-淀粉酶的表达。因此，发酵可理解为包括摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续式、分批式、分批补料式或固态发酵)，其在合适的培养基中和允许淀粉酶表达或被分离的条件下进行。术语“耗尽的全发酵液”在本文中被定义为发酵材料的未分级内容物，其包括培养基、细胞外蛋白(例如，酶)和细胞生物质。应当理解术语“耗尽的全发酵液”也涵盖已采用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。可通过熟知的方法从培养基中便利地回收宿主细胞所分泌的酶，包括通过离心或过滤从培养基分离细胞，以及通过盐(诸如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，随后使用层析方法诸如离子交换层析、亲和层析等等。载体中编码淀粉酶的多核苷酸可以有效连接至控制序列，该控制序列能够通过宿主细胞提供编码序列的表达，即，载体是表达载体。控制序列可经过修饰，例如通过添加另外的转录调控元件，以使控制序列指导的转录水平更易响应于转录调节因子。控制序列可特别包含启动子。宿主细胞可在允许淀粉酶表达的合适条件下培养。酶的表达可为组成型的，使得其持续产生，或为诱导型的，从而需要刺激以引发表达。就诱导型表达而言，在需要时，例如向培养基中添加诱导剂物质(例如地塞米松或IPTG或槐糖)，可引发蛋白质生成。在体外无细胞体系中，诸如TnTTM(Promega)兔网织红细胞体系中，也可重组地生成多肽。表达宿主还可以在好氧条件下，在对于宿主适当的培养基中培养。可提供摇动或者搅拌和通气的组合，并在对于该宿主适当的温度下进行制备，例如，约25℃至约75℃(例如，30℃至45℃)，具体取决于宿主和制备期望的α-淀粉酶的需要。培养可进行约12至约100小时或更长(以及之间的任何小时值，例如，24至72小时)。通常，培养液的pH为约4.0至约8.0，同样取决于宿主相对于淀粉酶制备所需的培养条件。3.4.淀粉酶活性的鉴定为了评估宿主细胞中淀粉酶的表达，测定法可测量所表达的蛋白质、相应的mRNA或α-淀粉酶活性。例如，合适的测定法包括RNA印迹、逆转录酶聚合酶链反应和采用适当标记的杂交探针的原位杂交。合适的测定法还包括测量样品中的淀粉酶活性，例如，通过直接测量培养基中的还原糖(诸如葡萄糖)的测定法。例如，可使用葡萄糖试剂盒No.15-UV(SigmaChemicalCo.)或仪器诸如TechniconAutoanalyzer测定葡萄糖浓度。也可通过任何已知方法测量α-淀粉酶活性，诸如下面所述的PAHBAH或ABTS测定法。3.5.富集和纯化α-淀粉酶的方法发酵、分离和浓缩技术是本领域所熟知的，可使用常规方法来制备包含α-淀粉酶多肽的浓缩溶液。在发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括残余发酵原料)以获得淀粉酶溶液。一般使用过滤、离心、微量过滤、旋转式真空鼓过滤、超滤、离心之后进行超滤、提取或层析法等等。希望浓缩含α-淀粉酶多肽的溶液以优化回收。使用未浓缩的溶液需要增加温育时间以收集富集的或纯化的酶沉淀物。使用常规浓缩技术浓缩所述含酶的溶液直至获得期望的酶水平。可通过本文所讨论的技术中的任一种来实现所述含酶的溶液的浓缩。示例性的富集和纯化方法包括但不限于旋转式真空过滤和/或超滤。将酶溶液浓缩成浓缩酶溶液直至含α-淀粉酶多肽的浓缩溶液的酶活性处于期望水平。可例如使用沉淀剂，诸如金属卤化物沉淀剂，来进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物、以及这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。示例性金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾、以及这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可用作防腐剂。金属卤化物沉淀剂以能有效地使淀粉酶沉淀的量使用。在常规测试后，能有效引起酶沉淀的金属卤化物的至少有效量和最佳用量、以及实现最大回收的沉淀的条件(包括温育时间、pH、温度和酶浓度)的选择对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。一般来讲，向浓缩酶溶液中添加至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，通常为至少8％w/v。一般来讲，向浓缩酶溶液中添加不超过约25％w/v的金属卤化物，通常为不超过约20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最佳浓度将取决于(除了别的以外)特定的α-淀粉酶多肽的性质和其在浓缩酶溶液中的浓度。沉淀酶的另一替代方式是使用有机化合物。示例性有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。添加有机化合物沉淀剂可在添加金属卤化物沉淀剂之前、同时或之后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加可按顺序进行或同时进行。一般来讲，有机沉淀剂选自：4-羟基苯甲酸的碱金属盐，诸如钠盐和钾盐；和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中烷基基团包含1至12个碳原子；以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂可为例如4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中烷基基团包含1至10个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。示例性有机化合物是4-羟基苯甲酸的直链烷基酯，其中烷基基团包含1至6个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。也可使用4-羟基苯甲酸的甲酯、4-羟基苯甲酸的丙酯、4-羟基苯甲酸的丁酯、4-羟基苯甲酸的乙酯、以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。另外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(称为甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为丙基PARABEN)，两者同时也是淀粉酶防腐剂。有关进一步的描述，参见例如美国专利5,281,526。有机化合物沉淀剂的添加提供了pH、温度、α-淀粉酶浓度、沉淀剂浓度和温育时间方面的沉淀条件的高灵活性的优点。有机化合物沉淀剂以一定量使用，所述量能有效地改善依靠金属卤化物沉淀剂使酶发生的沉淀。根据本公开，在常规测试后，有机化合物沉淀剂的至少有效量和最佳用量、以及实现最大回收的沉淀条件(包括温育时间、pH、温度和酶浓度)的选择对于本领域普通技术人员将是显而易见的。一般来讲，向浓缩酶溶液中添加至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，通常为至少约0.02％w/v。一般来讲，向浓缩酶溶液中添加不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，通常为不超过约0.2％w/v。可将包含金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩多肽溶液调节至某一pH值，其将必然取决于待富集或纯化的酶。一般来讲，pH被调节至接近淀粉酶等电点的水平。pH可在从低于等电点(pI)约2.5pH单位至高于等电点约2.5pH单位的pH范围内调节。获得富集的或纯化的酶沉淀物所需的温育时间取决于特定酶的性质、酶的浓度、特定沉淀剂及其浓度。一般来讲，有效沉淀酶的时间介于约1至约30小时之间；通常不会超过约25小时。在存在有机化合物沉淀剂的情况下，温育时间还可减少到少于约10小时，并且在大多数情况下甚至为约6小时。一般来讲，在温育过程中温度介于约4℃和约50℃之间。通常，方法是在介于约10℃和约45℃之间(例如，介于约20℃和约40℃之间)的温度下进行。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件以及所用的酶或沉淀剂而变化。通过搅拌包含酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液提高了经富集或纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的执行效率。在添加金属卤化物和有机化合物的过程中、以及在后续温育期间均进行搅拌步骤。合适的搅拌方法包括机械搅动或摇动、剧烈通气或任何类似技术。在温育期后，通过常规分离技术，诸如过滤、离心、微滤、旋转真空过滤、超滤、加压过滤、跨膜微滤、错流膜微滤等等将经富集或纯化的酶与解离的色素和其它杂质分离并收集。可通过用水洗涤沉淀物来获得酶沉淀物的进一步富集或纯化。例如，用含金属卤化物沉淀剂的水或用含金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水洗涤经富集或纯化的酶沉淀物。在发酵过程中，培养液中积聚了α-淀粉酶多肽。为了分离、富集或纯化期望的α-淀粉酶，将培养液离心或过滤以去除细胞，并将所得的无细胞液体用于酶富集或纯化。在一个实施方案中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞培养液进行盐析；然后将70％饱和度沉淀级分溶解在缓冲液中，上样至柱(诸如SephadexG-100柱)，然后洗脱以回收具有酶活性的级分。为了进一步富集或纯化，可使用常规方法诸如离子交换层析。经富集或纯化的酶可用于衣物洗涤和清洁应用，例如，可用于衣物洗涤剂和除斑剂中。这种酶可制成为液体(溶液、浆料)或固体(颗粒状、粉末状)的最终产品。富集或纯化的更具体示例在Sumitani等人，(2000)“Newtypeofstarch-bindingdomain:thedirectrepeatmotifintheC-terminalregionofBacillussp.195α-amylasecontributestostarchbindingandrawstarchdegrading,”Biochem.J.350:477-484中有所描述，并在此进行了简要汇总。将从4升浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)TK24培养上清液获得的酶用80％饱和度的(NH4)2SO4处理。通过离心(10,000×g，20min，4℃)回收沉淀物并将其重新溶解在含5mMCaCl2的20mMTris/HCl缓冲液(pH7.0)中。然后将溶解的沉淀物用相同缓冲液透析。将经透析的样品上样至先前用20mMTris/HCl缓冲液(pH7.0)、5mMCaCl2平衡过的SephacrylS-200柱，并用相同的缓冲液以7mL/h的线性流速洗脱。收集来自柱的级分并通过酶测定法和SDS-PAGE判断来评估活性。如下进一步纯化蛋白质。用含5mMCaCl2和1.5M(NH4)2SO4的20mMTris/HCl缓冲液(pH7.0)平衡ToyopearlHW55柱(TosohBioscience,Montgomeryville,PA；目录号19812)。用溶于含5mMCaCl2、pH7.0的20mMTris/HCL缓冲液中的1.5至0M(NH4)2SO4的线性梯度洗脱酶。收集活性级分，用80％饱和度的(NH4)2SO4沉淀酶。如上所述对沉淀物进行回收、重新溶解和透析。然后将经透析的样品上样至先前平衡过的MonoQHR5/5柱(AmershamPharmacia；目录号17-5167-01)，平衡使用了含5mMCaCl2的20mMTris/HCl缓冲液(pH7.0)，流速为60mL/h。收集活性级分，并且添加到1.5M(NH4)2SO4溶液中。如前所述将活性酶级分在ToyopearlHW55柱上重新进行层析分析，以产生如通过SDS-PAGE确定的均质酶。参见Sumitani等人，(2000)Biochem.J.350:477-484，了解有关所述方法和变化的一般讨论。对于生产规模的回收，一般如上所述可通过用聚合物絮凝去除细胞来富集或部分纯化α-淀粉酶多肽。作为另外一种选择，可通过微量过滤之后进行浓缩(通过使用可用的膜和设备进行超滤)来富集或纯化酶。然而，对于某些应用，不需要富集或纯化酶，可裂解全培养液培养物并且无需进一步处理即可使用。然后可对所述酶进行处理，例如处理成颗粒剂。4.α-淀粉酶的组成和用途本发明的α-淀粉酶可用于多种工业应用。例如，α-淀粉酶可用于淀粉转化工艺，特别是用于已发生液化的淀粉的糖化工艺。所期望的终产物可以是可通过淀粉底物的酶转化生成的任何产物。例如，所期望的产物可为富含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，其可用于其它工艺，诸如HFCS的制备；或其可被转化成多种其它可用的产物，诸如抗坏血酸中间体(例如，葡糖酸盐、2-酮-L-古洛糖酸、5-酮-葡糖酸盐和2,5-二酮葡糖酸盐)、1,3-丙二醇、芳族氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)、有机酸(例如，乳酸、丙酮酸、琥珀酸、异柠檬酸和草酰乙酸)、氨基酸(例如，丝氨酸和甘氨酸)、抗生素、抗微生物剂、酶、维生素和激素。淀粉转化工艺可在设计以制备用于燃料或饮用的醇(即，饮用酒精)的发酵工艺之前或同时进行。本领域技术人员了解可用于制备这些终产物的各种发酵条件。α-淀粉酶也可用于食品制备的组合物和方法中。下面更详细地描述了α-淀粉酶的这些各种用途。4.1.淀粉底物的制备本领域的一般技术人员熟知可用于制备用于本文所公开的工艺的淀粉底物的可用方法。例如，可用的淀粉底物可得自块茎、根、茎、豆类、谷物或整谷粒。更具体地讲，颗粒状的淀粉可得自玉米、玉米棒、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、蜀黍、西米、粟、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、高粱、稻、豌豆、菜豆、香蕉或马铃薯。玉米含约60％-68％的淀粉；大麦含约55％-65％的淀粉；粟含约75％-80％的淀粉；小麦含约60％-65％的淀粉；并且精米含70％-72％的淀粉。具体设想的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是碾碎的或完整的，包括玉米固体，诸如籽粒、麸皮和/或玉米棒。淀粉也可以是高度精炼的原料淀粉或来自淀粉精炼工艺的原料。也可商购获得各种淀粉。例如，玉米淀粉可得自Cerestar、Sigma和KatayamaChemicalIndustryCo.(Japan)；小麦淀粉可得自Sigma；甘薯淀粉可得自WakoPureChemicalIndustryCo.(Japan)；并且马铃薯淀粉可得自NakaariChemicalPharmaceuticalCo.(Japan)。淀粉底物可为由整谷粒研磨而成的粗制淀粉，其包含非淀粉级分，例如胚芽残余物和纤维。研磨可包括湿磨或干磨或碾磨。在湿磨中，将整谷粒浸泡在水或稀酸中以将谷粒分离成其组成部分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、籽粒纤维。湿磨有效地分离胚芽和粗粉(即，淀粉颗粒和蛋白质)，并且尤其适用于制备糖浆。在干磨或碾磨中，整个籽粒被碾磨成细粉并且通常加工时未将谷粒分成其组成部分。在一些情况下，回收来自籽粒的油。因此除淀粉之外，干碾过的谷粒还将包含显著量的非淀粉碳水化合物。淀粉底物的干碾可用于制备乙醇和其它生化制品。待加工的淀粉可为高度精制的淀粉品质，例如，至少90％、至少95％、至少97％、或至少99.5％纯的。4.2.淀粉的糊化和液化如本文所用，术语“液化作用”或“液化”是指将淀粉转化为低粘性和更短链的糊精的过程。一般来讲，该过程涉及淀粉糊化同时或之后进行α-淀粉酶的添加，但任选地可添加另外的诱导液化的酶。在一些实施方案中，用水将如上所述制备的淀粉底物制成浆料。淀粉浆料包含的淀粉的干固形物重量百分比可为约10％-55％、约20％-45％、约30％-45％、约30％-40％、或约30％-35％。可使用例如计量泵将α-淀粉酶(EC3.2.1.1)添加到浆料中。通常用于该应用的α-淀粉酶是热稳定的细菌α-淀粉酶，诸如嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶。通常以例如每千克淀粉干物质约1500单位来提供α-淀粉酶。为了优化α-淀粉酶的稳定性和活性，通常将浆料的pH值调节至约pH5.5-6.5，也可添加约1mM的钙(约40ppm游离钙离子)。嗜热脂肪地芽孢杆菌变体或其它α-淀粉酶可能需要不同的条件。在液化之后浆料中保留的细菌α-淀粉酶可通过多种方法灭活，包括在后续反应步骤中降低pH或去除浆料中的钙(在酶依赖于钙的情况下)。淀粉浆料加上α-淀粉酶可通过蒸汽加热至105℃的喷射式蒸煮锅连续泵送。在这些条件下糊化快速发生，并且酶活性加上显著的剪切力使淀粉底物开始水解。在喷射式蒸煮锅中的停留时间很短。可使部分糊化的淀粉通过一系列的保持在105-110℃的保温管，保持5-8分钟以完成糊化过程(“初级液化”)。水解至所需DE是在贮槽中于85-95℃或更高温度下处理约1至2小时完成的(“二次液化”)。这些槽可包含导流板以阻止逆向混合。如本文所用，术语“二次液化分钟数”是指从二次液化开始到测量右旋糖当量(DE)时所经历的时间。然后使浆料冷却至室温。该冷却步骤可为30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。液化的淀粉通常呈浆料的形式，具有约10％-50％、约10％-45％、约15％-40％、约20％-40％、约25％-40％或约25-35％的干固形物含量(w/w)。采用α-淀粉酶的液化作用可有利地在低pH下进行，无需将pH调节至约pH5.5-6.5。α-淀粉酶可用于2至7的pH范围下的液化作用，例如pH3.0-7.5、pH4.0-6.0、或pH4.5-5.8。α-淀粉酶可在约85℃-95℃的温度范围内保持液化活性，例如85℃、90℃或95℃。例如，可在25％DS玉米淀粉的溶液中用800μg淀粉酶在例如pH5.8和85℃下、或pH4.5和95℃下进行10分钟液化。可使用多种本领域已知的粘度测定法中的任一种来测定液化活性。在使用本发明的α-淀粉酶的特定实施方案中，淀粉液化在90℃-115℃的温度范围内进行，目的是制备高纯度的葡萄糖糖浆、HFCS、麦芽糖糊精等。4.3.糖化使用α-淀粉酶，任选地在存在其它酶的情况下，可将液化的淀粉糖化为富含更低DP(例如，DP1+DP2)糖类的糖浆。糖化产物的确切组成取决于所用酶的组合，以及所加工的颗粒状淀粉的类型。有利地，使用所提供的α-淀粉酶可获得的糖浆所包含的DP2占糖化的淀粉中全部低聚糖的重量百分比可超过30％，例如45％-65％或55％-65％。在糖化的淀粉中(DP1+DP2)的重量百分比可超过约70％，例如75％–85％或80％–85％。本发明的淀粉酶也产生相对高收率的葡萄糖，例如，在糖浆产物中DP1>20％。液化一般是以连续工艺进行的，而糖化通常是以分批工艺进行的。通常在约60℃-65℃的温度和约4.0-4.5的pH(例如pH4.3)下糖化是最有效的，因此有必要将液化的淀粉冷却并调节pH。糖化可在例如约40℃、约50℃、或约55℃至约60℃或约65℃的温度下进行。通常在搅拌槽中进行糖化，这可能需要若干小时来填充或排空。通常在槽已填充时以固定比率将酶添加至干燥的固形物，或在填充阶段的开始以单剂量添加酶。生成糖浆的糖化反应通常在约24-72小时内运行，例如，24-48小时。当获得最大或所需的DE时，通过例如加热至85℃持续5分钟来终止反应。进一步温育会导致更低的DE，最终至约90DE，因为积聚的葡萄糖通过酶促逆反应和/或以热力学平衡的方法重新聚合成异麦芽糖和/或其它逆产物。使用淀粉酶时，糖化最佳地在约30℃至约75℃的温度范围内进行，例如45℃–75℃或47℃-74℃。糖化可在约pH3至约pH7的pH范围内进行，例如，pH3.0-pH7.5、pH3.5-pH5.5、pH3.5、pH3.8或pH4.5。淀粉酶可以组合物的形式添加到浆料中。向颗粒状淀粉底物的浆料中添加的淀粉酶的量可为约0.6-10ppmds，例如，2ppmds。淀粉酶可以全培养液、澄清的、富集的、部分纯化的或纯化的酶形式添加。淀粉酶的比活性可为例如以PAHBAH测定法测得的约300U/mg酶。淀粉酶也可以全培养液产物的形式添加。淀粉酶可以分离的酶溶液的形式添加至浆料。例如，淀粉酶可以由表达淀粉酶的宿主细胞产生的经培养的细胞材料形式添加。在发酵或SSF工艺期间，淀粉酶还可由宿主细胞分泌至反应培养基中，使得向反应中持续提供酶。产生和分泌淀粉酶的宿主细胞也可表达另外的酶，诸如葡糖淀粉酶。例如，美国专利5,422,267公开了酵母中的葡糖淀粉酶用于制备含酒精饮料的用途。例如，宿主细胞(如，里氏木霉或黑曲霉)可经工程改造以在糖化过程中共表达淀粉酶和葡糖淀粉酶，例如HgGA、TrGA或TrGA变体。宿主细胞可经基因修饰以便不表达其内源性葡糖淀粉酶和/或其它酶、蛋白质或其它物质。宿主细胞可经工程改造以表达广谱的各种糖解酶。例如，重组酵母宿主细胞可包含编码葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、利用戊糖的酶、α-淀粉酶、普鲁兰酶、异淀粉酶和/或异普鲁兰酶的核酸。参见例如WO2011/153516A2。4.4.异构化通过用淀粉酶处理而制备的可溶性淀粉水解产物可转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，诸如高果糖玉米糖浆(HFCS)。可使用葡萄糖异构酶实现这种转化，特别是固定在固体载体上的葡萄糖异构酶。pH增大到约6.0至约8.0，例如pH7.5(取决于异构酶)，并且通过离子交换去除Ca2+。合适的异构酶包括IT(NovozymesA/S)；IMGI、G-G993、G993、G993液体以及IGI。在异构化后，混合物通常包含约40％-45％的果糖，例如，42％的果糖。4.5.发酵可溶性淀粉水解产物，特别是富含葡萄糖的糖浆，可通过将淀粉水解产物与发酵生物体接触来发酵，通常在32℃左右的温度下发酵，诸如对于产酒精酵母为30℃至35℃。发酵的温度和pH将取决于发酵生物体。EOF产物包括代谢物，诸如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、衣康酸和其它羧酸、葡萄糖酸δ内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸和其它氨基酸、ω-3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1,3-丙二醇和其它生物材料。产乙醇微生物包括酵母诸如酿酒酵母，和细菌例如运动发酵单胞菌(Zymomonasmoblis)，其表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。所述产乙醇微生物可表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，其将木糖转化为木酮糖。例如能够耐受较高温度的产乙醇微生物的改良菌株在本领域是已知的并且能够使用。参见Liu等人，(2011)ShengWuGongChengXueBao27:1049-56。酵母的商业来源包括ETHANOL(LeSaffre)、(Lallemand)、RED(RedStar)、(DSMSpecialties)和(Alltech)。通过发酵产生其它代谢物(诸如柠檬酸和乳酸)的微生物也是本领域中已知的。参见例如Papagianni(2007)Biotechnol.Adv.25:244-63；John等人，(2009)Biotechnol.Adv.27:145-52。所述糖化和发酵工艺可作为SSF工艺进行。发酵可包括例如后续的富集、纯化和乙醇回收。在发酵过程中，培养液或“啤酒”的乙醇含量可达到约8％-18％v/v，例如14％-15％v/v。可蒸馏培养液以制备富集的(例如96％纯的)乙醇溶液。另外，通过发酵生成的CO2可用CO2洗涤器收集、压缩并出售用于其它用途，例如碳酸饮料或干冰制备。来自发酵工艺的固体废物可用作富含蛋白质的产品，例如家畜饲料。如上所述，可使用在SSF全程持续表达和分泌淀粉酶的真菌细胞进行SSF工艺。表达淀粉酶的真菌细胞也可以是发酵微生物，例如产乙醇微生物。因此可使用表达足够量淀粉酶的真菌细胞进行乙醇制备，使得少添加或无需添加外源的酶。真菌宿主细胞可来自经适当工程改造的真菌菌株。也可使用除了淀粉酶之外还表达和分泌其它酶的真菌宿主细胞。此类细胞可表达葡糖淀粉酶和/或普鲁兰酶、植酸酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、其它半纤维素酶、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶或其它酶。该工艺的变型是“分批补料发酵”系统，其中随着发酵的进行，以增量方式添加底物。在分解代谢物阻遏可抑制细胞代谢并且希望限制培养基中底物的量的情况下，分批补料系统是有用的。通过可测量因素(诸如pH、溶解氧和废气诸如CO2的分压)的变化，来估计分批补料系统中的实际底物浓度。分批发酵和分批补料发酵是常见的并且是本领域所熟知的。连续发酵是一种开放系统，其中将限定的发酵培养基连续添加至生物反应器，并且同时取出等量的条件培养基用于处理。连续发酵一般会将培养物保持处于恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵允许调节细胞生长和/或产物浓度。例如，限制性营养物质诸如碳源或氮源保持在固定速率，而所有其它参数适中。因为生长保持在稳态，由于培养基被抽出导致的细胞损耗应与发酵中的细胞生长速率保持平衡。优化连续发酵工艺以及使产物形成速率最大化的方法是工业微生物学领域所熟知的。4.6.包含α-淀粉酶的组合物α-淀粉酶可与葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)例如木霉葡糖淀粉酶或其变体相组合。示例性的葡糖淀粉酶是具有优异的比活性和热稳定性的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)及其变体。参见美国已公布的专利申请2006/0094080、2007/0004018和2007/0015266(DaniscoUSInc.)。TrGA的合适变体包括具有葡糖淀粉酶活性并且与野生型TrGA具有至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的那些。α-淀粉酶有利地增加了在由TrGA催化的糖化过程中产生的葡萄糖的收率。作为另外一种选择，葡糖淀粉酶可以是另一种来源于植物(包括藻类)、真菌或细菌的葡糖淀粉酶。例如，葡糖淀粉酶可以是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶或其变体(例如，Boel等人，(1984)EMBOJ.3:1097-1102；WO92/00381；WO00/04136(NovoNordiskA/S))；以及泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(例如，WO84/02921(CetusCorp.))。其它设想的曲霉葡糖淀粉酶包括具有增强的热稳定性的变体，例如，G137A和G139A(Chen等人，(1996)Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人，(1995)Prot.Eng.8:575-582)；N182(Chen等人，(1994)Biochem.J.301:275-281)；A246C(Fierobe等人，(1996)Biochemistry,35:8698-8704)；以及在位置A435和S436中具有Pro残基的变体(Li等人，(1997)ProteinEng.10:1199-1204)。其它设想的葡糖淀粉酶包括篮状菌(Talaromyces)葡糖淀粉酶，尤其是来源于埃默森篮状菌(T.emersonii)(例如，WO99/28448(NovoNordiskA/S))、莱色篮状菌(T.leycettanus)(例如，美国专利RE32,153(CPCInternational,Inc.))、杜邦篮状菌(T.duponti)、或嗜热篮状菌(T.thermophilus)(例如，美国专利4,587,215)的葡糖淀粉酶。设想的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，尤其是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(例如，EP135138(CPCInternational,Inc.))和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(例如，WO86/01831(MichiganBiotechnologyInstitute))。合适的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，诸如WO00/04136(NovoNordiskA/S)中SEQIDNO:2所示的葡糖淀粉酶。另外合适的是商用葡糖淀粉酶，诸如AMG200L；AMG300L；SANTMSUPER和AMGTME(Novozymes)；300和OPTIDEXL-400(DaniscoUSInc.)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(DSM)；G900(EnzymeBio-Systems)；以及G990ZR(低蛋白酶含量的黑曲霉葡糖淀粉酶)。其它合适的葡糖淀粉酶包括烟曲霉(Aspergillusfumigatus)葡糖淀粉酶、篮状菌葡糖淀粉酶、草根霉(Thielavia)葡糖淀粉酶、栓菌(Trametes)葡糖淀粉酶、嗜热真菌葡糖淀粉酶、阿太氏菌(Athelia)葡糖淀粉酶、或腐质霉(Humicola)葡糖淀粉酶(例如，HgGA)。通常葡糖淀粉酶以约0.1-2葡糖淀粉酶单位(GAU)/gds的量添加，例如约0.16GAU/gds、0.23GAU/gds或0.33GAU/gds。可与淀粉酶一起使用的其它合适的酶包括植酸酶、蛋白酶、普鲁兰酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、不同的α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、其它半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、氧化还原酶或它们的组合。例如，可添加本领域的技术人员所熟知的有效量的脱支酶，诸如异淀粉酶(EC3.2.1.68)。普鲁兰酶(EC3.2.1.41)例如也是合适的。普鲁兰酶通常以100U/kgds添加。另外合适的酶包括蛋白酶，诸如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括得自如下的那些：曲霉，诸如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉(例如，米黑毛霉(M.miehei))；根霉(Rhizopus)；以及木霉。β-淀粉酶(EC3.2.1.2)是外部作用的产麦芽糖淀粉酶，其催化1,4-α-糖苷键水解为支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物，从而释放麦芽糖。已经从各种植物和微生物分离出β-淀粉酶。参见Fogarty等人，(1979)inPROGRESSININDUSTRIALMICROBIOLOGY，第15卷，第112-115页。这些β-淀粉酶的最佳温度范围是40℃至65℃，最佳pH范围是约4.5至约7.0。设想的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦的β-淀粉酶BBA1500、DBA、OPTIMALTTMME、OPTIMALTTMBBA(DaniscoUSInc.)；以及NOVOZYMTMWBA(NovozymesA/S)。包含本发明的淀粉酶的组合物可为含水的或不含水的制剂、颗粒剂、粉末、凝胶、浆料、糊剂等，其还可包含本文列出的另外的酶中的任何一者或多者，连同缓冲液、盐、防腐剂、水、助溶剂、表面活性剂等等。此类组合物可与已经存在于浆料、水浴、洗衣机、食品或饮料产品等中的内源性酶或其它成分结合起作用，例如，内源性植物(包括藻类)酶、在先前加工步骤中残余的酶等等。5.用于烘焙和食品制备的组合物和方法本发明还涉及“食品组合物”、用于制备这种食品组合物的方法或其用途，所述食品组合物包括但不限于包含淀粉酶的食物产品、动物饲料和/或食品/饲料添加剂，所述方法包括将α-淀粉酶与一种或多种食品成分混合。此外，本发明涉及淀粉酶在制备食品组合物中的用途，其中所述食品组合物在添加本发明的多肽后进行烘焙。如本文所用，术语“烘焙组合物”是指在提供烘焙的食物产品的过程中制备的任何组合物和/或添加剂，包括但不限于高筋面粉、生面团、烘焙添加剂和/或烘焙产品。食品组合物或添加剂可为液体或固体。如本文所用，术语“面粉”是指已研磨或碾磨的谷粒。术语“面粉”也指已被碾磨或捣碎的西米或块茎产品。在一些实施方案中，除了已研磨或捣碎的谷物或植物物质之外，面粉还可包含多种组分。附加组分的示例(但并非旨在限制)是膨松剂。谷粒包括小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产品包括木薯淀粉(tapiocaflour)、木薯粉(cassavaflour)和吉士粉(custardpowder)。术语“面粉”也包括碾磨的玉米面、玉米粗粉、米粉(riceflour)、全面粉、自发粉、木薯淀粉(tapiocaflour)、木薯粉(cassavaflour)、米粉(groundrice)、富强粉和吉士粉。对于用于烘焙和食品生产的商用和家用面粉，在面粉中保持适当的α-淀粉酶活性水平是很重要的。过高的活性水平可导致产品变粘和/或变糊，从而滞销。α-淀粉酶活性不足的面粉可能不含对于正常酵母功能足够的糖类，从而导致面包或烘焙产品干燥、易碎。因此，淀粉酶可单独添加到面粉中或与其它α-淀粉酶组合添加到面粉中，以增强面粉中内源α-淀粉酶活性的水平。淀粉酶可进一步单独添加或与其它淀粉酶组合添加，以阻止或延迟老化，即烘焙产品屑粒硬化。抗老化淀粉酶的量的范围通常为0.01-10mg酶蛋白/kg面粉，例如，0.5mg/kgds。可与淀粉酶组合使用的另外的抗老化淀粉酶包括内切淀粉酶，例如，来源于芽孢杆菌的细菌内切淀粉酶。另外的淀粉酶可为另一种产麦芽糖α-淀粉酶(EC3.2.1.133)，例如，来源于芽孢杆菌。是来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的示例性产麦芽糖α-淀粉酶，并且在Christophersen等人，(1997)Starch50:39-45中有所描述。抗老化内切淀粉酶的其它示例包括来源于芽孢杆菌(诸如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌)的细菌α-淀粉酶。抗老化淀粉酶可以是例如来自植物来源(诸如大豆)的或来自微生物来源(诸如芽孢杆菌)的内切淀粉酶(诸如β-淀粉酶)。包含淀粉酶的烘焙组合物还可包含磷脂酶或具有磷脂酶活性的酶。具有磷脂酶活性的酶具有可按脂肪酶单位(LU)测量的活性。磷脂酶可具有A1或A2活性以从磷脂去除脂肪酸，形成溶血磷脂。它可能具有或者可能不具有脂肪酶活性，即对三甘油酯底物的活性。通常磷脂酶的最佳温度在30℃-90℃的范围内，例如，30℃-70℃。添加的磷脂酶可为动物来源的，例如来自胰腺，例如牛或猪的胰腺、蛇毒或蜂毒。作为另外一种选择，磷脂酶可为微生物来源的，例如，来自丝状真菌、酵母或细菌。在烘焙后起始阶段期间(特别是最初24小时)以提高面包的柔软度的量添加磷脂酶。磷脂酶的量通常将在每kg面粉0.01-10mg酶蛋白的范围内，例如，0.1-5mg/kg。也就是说，磷脂酶活性通常将在20-1000LU/kg面粉的范围内，其中脂肪酶单位被定义为在30℃、pH7.0下，以阿拉伯树胶作为乳化剂并以甘油三丁酸酯作为底物时，每分钟释放1μmol丁酸所需的酶量。生面团组合物一般包含小麦粗粉或小麦粉和/或其它类型粗粉、面粉或淀粉，诸如玉米粉、玉米淀粉、黑麦粗粉、黑麦粉、燕麦粉、燕麦粗粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、马铃薯粗粉、马铃薯粉或马铃薯淀粉。生面团可为新鲜、冷冻或半烘烤的。生面团可为发酵过的生面团或将要进行发酵的生面团。生面团可以各种方式发酵，诸如通过添加化学膨松剂(例如，碳酸氢钠)或通过添加发酵剂，即，发酵的生面团。生面团还可通过添加合适的酵母培养物来发酵，诸如酿酒酵母(面包酵母)的培养物，例如，可商购获得的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。生面团还可包含其它常规的生面团成分，例如，蛋白质，诸如奶粉、谷蛋白和大豆；鸡蛋(例如，全蛋、蛋黄或蛋清)；抗氧化剂，诸如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸，诸如L-半胱氨酸；糖；或盐，诸如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。生面团还可包含脂肪，例如三甘油酯，诸如颗粒状脂肪或起酥油。生面团还可包含乳化剂，诸如单甘油酯或二甘油酯、单甘油酯或二甘油酯的二乙酰基酒石酸酯、脂肪酸的糖脂、脂肪酸的聚甘油酯、单甘油酯的乳酸酯、单甘油酯的乙酸酯、硬脂酸聚氧乙烯酯或溶血卵磷脂。具体地讲，制备生面团可不加乳化剂。生面团产品可为任何经处理的生面团产品，包括煎、炸、烤、烘焙、蒸和煮过的生面团，诸如馒头和米糕。在一个实施方案中，食物产品是烘焙产品。典型的烘焙(烤过)产品包括面包诸如大面包、面包卷、小圆面包、百吉饼、比萨饼底等糕饼、椒盐脆饼、玉米粉圆饼、蛋糕、曲奇、饼干、薄脆饼干等。任选地，另外的酶可与抗老化淀粉酶和磷脂酶一起使用。另外的酶可为第二淀粉酶，诸如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡糖基转移酶，或者另外的酶可为肽酶，尤其是外肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、蛋白二硫键异构酶(例如WO95/00636中公开的蛋白二硫键异构酶)，例如，糖基转移酶、分支酶(1,4-α-葡聚糖分支酶)、4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或氧化还原酶，例如，过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、阿马道里酶、金属蛋白酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧化酶、L-氨基酸氧化酶或碳水化合物氧化酶。另外的酶可为任何来源的，包括哺乳动物来源和植物来源，以及尤其是微生物(细菌、酵母或真菌)来源的，并且可通过本领域常规使用的技术获得。木聚糖酶通常是微生物来源的，例如来源于细菌或真菌，诸如曲霉菌株。木聚糖酶包括例如和NOVOZYM其为可商购获得的由里氏木霉制备的木聚糖酶制剂。淀粉葡糖苷酶可为黑曲霉淀粉葡糖苷酶(诸如)。其它可用的淀粉酶产品包括A1000或A5000(GrindstedProducts,Denmark)以及AMYLASEHTM或AMYLASEPTM(DSM)。葡萄糖氧化酶可为真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(诸如)。示例性蛋白酶是所述工艺可用于由生面团制备的任何种类的烘培产品，这些产品呈柔软的或松脆的特性，为白色、浅色或深色类型。示例为面包，尤其是白色、全麦粉或全黑麦面包，通常为大面包或面包卷形式，诸如但不限于法式长棍型面包、皮塔饼、玉米粉圆饼、蛋糕、薄烤饼、饼干、曲奇、馅饼皮、脆面包、馒头、比萨饼等等。淀粉酶可用于预混物，其包含面粉以及抗老化淀粉酶、磷脂酶和/或磷脂。预混物可包含其它生面团改良和/或面包改良添加剂，例如包括以上提到的酶的添加剂中的任一种。淀粉酶可为用作烘焙添加剂的酶制剂(包含抗老化淀粉酶和磷脂酶)的组分。酶制剂任选地为颗粒或凝聚粉末的形式。该制剂可具有窄粒度分布，超过95％(按重量计)的颗粒在25μm至500μm的范围内。颗粒和凝聚粉末可通过常规方法制备，例如，通过将淀粉酶喷洒在流化床制粒机的载体上。载体可由具有合适粒度的粒状芯组成。载体可为可溶性的或不溶性的，例如，盐(诸如氯化钠或硫酸钠)、糖类(诸如蔗糖或乳糖)、糖醇(诸如山梨醇)、淀粉、稻、玉米糁或大豆。包膜颗粒(即α-淀粉酶颗粒)可包含淀粉酶。为制备包膜α-淀粉酶颗粒，将酶与食品级脂质接触，所述脂质的量足以悬浮所有α-淀粉酶颗粒。如本文所用，食品级脂质可为任何天然的有机化合物，其不溶于水，但可溶于非极性有机溶剂，诸如烃或乙醚。合适的食品级脂质包括但不限于脂肪或油(饱和或不饱和)形式的三甘油酯。构成饱和三甘油酯的脂肪酸以及它们的组合的示例包括但不限于丁酸(来源于乳脂肪)、棕榈酸(来源于动物和植物脂肪)和/或硬脂酸(来源于动物和植物脂肪)。构成不饱和三甘油酯的脂肪酸以及它们的组合的示例包括但不限于棕榈油酸(来源于动物和植物脂肪)、油酸(来源于动物和植物脂肪)、亚油酸(来源于植物油)和/或亚麻酸(来源于亚麻籽油)。其它合适的食品级脂质包括但不限于来源于以上讨论的三甘油酯的单甘油酯和二甘油酯、磷脂和糖脂。将食品级脂质(特别是液体形式)与粉末形式的α-淀粉酶颗粒接触，其接触方式使得脂质材料覆盖了至少大多数(例如100％)α-淀粉酶颗粒的表面的至少一部分。因此，每个α-淀粉酶颗粒单独包膜在脂质中。例如，所有或基本上所有的α-淀粉酶颗粒具有一个薄的、连续的包被脂质膜。这可通过以下方式实现：首先将一定量的脂质倾倒到容器中，然后制成α-淀粉酶颗粒的浆料，使得脂质完全润湿每个α-淀粉酶颗粒的表面。在短时间段的搅拌后，回收表面上携带大量脂质的包膜α-淀粉酶颗粒。可通过选择所用的脂质类型来控制如此施加至α-淀粉酶颗粒的涂层厚度，并且在需要的时候通过重复这种操作以构建更厚的膜。可通过封装混合物的方式实现加载递送载体的存储、处理和掺入。封装混合物可包含包膜α-淀粉酶。然而，根据制造商或面包师的需要，封装混合物还可包含另外的成分。在将包膜α-淀粉酶掺入到生面团中后，面包师继续该产品的正常制备过程。包膜α-淀粉酶颗粒的优点是双重的。第一，对于那些热不稳定的酶，所述食品级脂质在烘焙过程中保护酶免于热变性。结果是，尽管在发酵和烘焙阶段期间α-淀粉酶被稳定和得到保护，但是在最终烘焙好的食物产品中它从保护性涂层释放出来，在那里水解聚葡萄糖中的糖苷键。加载递送载体还将活性酶缓释到烘焙食品中。也就是说，在烘焙过程后，活性α-淀粉酶从保护性涂层持续释放，其速率反作用于老化机制的速率并因此降低了老化机制的速率。一般来讲，根据脂质的性质、施加至α-淀粉酶颗粒的方式、待处理的生面团混合物的组成以及涉及的生面团混合操作的激烈程度，施加至α-淀粉酶颗粒的脂质的量可以从α-淀粉酶总重量的几个百分点变化至其重量的许多倍。将有效量的加载递送载体(即脂质包膜的酶)添加至用于制备烘焙食品的成分以延长所述烘焙食品的储存寿命。面包师计算如上所述制备的包膜α-淀粉酶量，这将是实现期望的抗老化效果所必需的。基于被包膜的酶的浓度和α-淀粉酶与指定面粉的比例来计算所需的包膜α-淀粉酶量。已经发现宽泛的浓度范围是有效的，尽管如上所述，在抗老化方面的明显改善与α-淀粉酶浓度并不符合线性关系，而是在某些最小水平之上，α-淀粉酶浓度的大幅增加产生很少的额外改善。在特定烘焙制备中实际使用的α-淀粉酶浓度可比最小必需量高得多，以向面包师提供一些针对面包师无心测量误差的保险。酶浓度的下限是由面包师希望实现的最小抗老化效果来确定的。制备烘焙食品的方法可包括：a)制备脂质涂覆的α-淀粉酶颗粒，其中基本上所有的α-淀粉酶颗粒都经过涂覆；b)混合包含面粉的生面团；c)在混合完成前添加脂质涂覆的α-淀粉酶至生面团，并且在从α-淀粉酶去除脂质涂层前终止混合；d)醒发生面团；以及e)烘焙生面团以得到烘焙好的食品，其中所述α-淀粉酶在混合、醒发和烘焙阶段期间是无活性的，而在烘焙好的食品中是有活性的。包膜α-淀粉酶可在混合循环期间(例如接近混合循环结束时)添加至生面团。在混合阶段的某一时间点添加包膜α-淀粉酶，使包膜α-淀粉酶充分分布在整个生面团中；然而，在保护性涂层从α-淀粉酶颗粒脱落前终止混合阶段。根据生面团的类型和体积、以及混合器操作和速度，可能需要1分钟至6分钟或更长的时间以将包膜α-淀粉酶混合到生面团中，但平均是二至四分钟。因此，若干变量可决定具体的程序。第一，包膜α-淀粉酶的量应具有足以使包膜α-淀粉酶遍布在整个生面团混合物中的总体积。如果包膜α-淀粉酶的制剂是高度富集的，可能需要在将包膜α-淀粉酶添加到生面团之前将另外的油添加到预混物中。配方和生产过程可能需要特定的修改；然而，如果将面包生面团配方中指定的25％的油取出生面团并在接近混合循环结束之时添加的时候用作富集的包膜α-淀粉酶的载体，一般能实现良好的结果。在面包或其它烘焙食品中，特别是具有低脂肪含量的那些(例如法式面包)，占干面粉重量大约1％的包膜α-淀粉酶混合物足以将包膜α-淀粉酶与生面团恰当地掺和。合适的百分比范围是宽泛的，具体取决于配方、成品及各个面包师的生产工艺要求。第二，为了与生面团完全混合，应将包膜α-淀粉酶悬浮液添加到混合物中保持足够长的时间，但时间不能使得过度的机械动作将保护性脂质涂层从包膜α-淀粉酶颗粒剥离。在本发明的另外一个方面，食品组合物是包含淀粉酶的油、肉、猪油组合物。在上下文中，术语“油、肉、猪油组合物”是指分别基于油、肉或猪油的、分别由油、肉或猪油制成的和/或分别包含油、肉或猪油的任何组合物。本发明的另一方面涉及制备包含淀粉酶的油或肉或猪油组合物和/或添加剂的方法，该方法包括将本发明的多肽与油/肉/猪油组合物和/或添加剂成分混合。在本发明的另外一个方面，食品组合物是包含淀粉酶及其变体的动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品。本发明还涉及用于制备这种动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将淀粉酶及其变体与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分混合。此外，本发明涉及淀粉酶在制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品中的用途。术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在一个特定实施方案中，动物是非反刍动物，诸如马和单胃动物。单胃动物的示例包括但不限于猪(pig)和猪(swine)，诸如小猪、生长猪、母猪；家禽，诸如火鸡、鸭、小鸡、肉鸡、蛋鸡；鱼类，诸如大麻哈鱼、鲑鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，诸如小虾和对虾。在另外一个实施方案中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛犊、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和蓝牛羚。在本发明的上下文中，术语“宠物食品”旨在理解为家庭动物的食物，所述家庭动物诸如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美洲栗鼠、奇珍鼠、豚鼠；禽宠物，诸如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行类宠物，诸如乌龟、蜥蜴和蛇；和水生宠物，诸如热带鱼和青蛙。术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“草料”可互换使用，并且可包含一种或多种选自以下的饲料材料：a)谷类，诸如小粒谷物(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物诸如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产品，诸如玉米蛋白粉、蒸馏器干酒糟可溶物(DDGS)(特别是基于玉米的蒸馏器干酒糟可溶物(cDDGS))、小麦麸、小麦粉头、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自如下来源的蛋白质：诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。6.纺织物退浆组合物及用途还设想了使用淀粉酶处理织物(例如，使纺织物退浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域所熟知的(参见例如美国专利6,077,316)。例如，可通过包括使织物与在溶液中的淀粉酶接触的方法，来改善织物的触感和外观。可在压力下用溶液处理织物。可在纺织物的编织过程中或之后、或在退浆阶段中、或在一个或多个其它的织物加工步骤中施加淀粉酶。在纺织物的编织过程中，线暴露于相当大的机械应力。在机械织机上编织前，经纱经常涂有上浆的淀粉或淀粉衍生物，以增加其拉伸强度，防止断裂。可在编织过程中或之后施加淀粉酶以去除这些上浆的淀粉或淀粉衍生物。编织后，在进一步加工织物前可使用淀粉酶去除上浆涂层，以确保均质和耐洗的结果。淀粉酶作为洗涤剂添加剂，例如含水组合物的形式，可单独地或与其它退浆化学试剂和/或退浆酶结合地用来退浆织物(包括含棉织物)。在用于在靛蓝染色牛仔布和服装上产生石磨外观的组合物和方法中也可使用淀粉酶。对于制造衣服，织物可以裁剪和缝制成衣服或服装，之后进行整理。特别是，对牛仔裤的生产，已经开发出不同的酶促整理方法。牛仔服装的整理通常是由酶促退浆步骤起始的，在此期间服装经受淀粉分解酶的作用以向织物提供柔软性并使棉花在后续酶促整理步骤中更易处理。淀粉酶可用于牛仔服装整理(例如，“生物打磨工艺”)、酶促退浆、以及向织物提供柔软性和/或整理过程的方法中。7.清洁组合物本发明的组合物和方法的一个方面是包括淀粉酶作为组分的清洁组合物。淀粉酶多肽可用作适合手洗、衣物洗涤、盘碟洗涤和其它硬质表面清洁的洗涤剂组合物中的组分。7.1.概述优选地，以洗涤剂中常规使用的淀粉酶浓度或接近的浓度将淀粉酶掺入到洗涤剂中。例如，可以对应于每升洗涤/盘碟洗涤液体0.00001–1mg(以纯酶蛋白计)淀粉酶的量添加淀粉酶多肽。本文提供了示例性配方，举例说明如下：淀粉酶多肽可为洗涤剂组合物的组分，作为唯一的酶或与其它酶(包括其它淀粉分解酶)一起。因此，它可以无尘颗粒、稳定的液体、或受保护的酶的形式包含在洗涤剂组合物中。无尘颗粒可以例如按照美国专利4,106,991和4,661,452中所公开的那样来制备，并且可任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质涂层材料的示例为平均摩尔量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及单甘油脂肪酸酯、二甘油脂肪酸酯和三甘油脂肪酸酯。适于用流化床技术施加的形成膜的涂层材料的示例在例如GB1483591中给出。例如，可以根据制定的方法通过添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸使液体酶制剂稳定。其它酶稳定剂是本领域已知的。可根据在例如EP238216中所公开的方法制备受保护的酶。多元醇早已被公认为蛋白质的稳定剂，以及改善蛋白质的溶解度。洗涤剂组合物可为任何可用的形式，例如粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可为含水的，其通常包含最多约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。它也可为仅含约30％水的致密凝胶类型的形式。洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其中的每种可为阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂通常将包含0％至约50％的阴离子表面活性剂，诸如直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲烷基磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、或皂。所述组合物还可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，诸如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或聚羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如WO92/06154中所述)。洗涤剂组合物可另外包含一种或多种其它酶，诸如任意组合的下列酶：蛋白酶、另一种淀粉分解酶、角质酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酸裂合酶、过水解酶、木聚糖酶、过氧化物酶和/或漆酶。洗涤剂可包含约1％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，诸如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、柠檬酸、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如得自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可为未复配的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。酶可用于与酶的稳定性相容的任何组合物中。一般来讲，酶可通过已知的封装形式来免于受到有害组分的影响，例如，通过制粒或在水凝胶中隔离。酶，特别是具有或不具有淀粉结合结构域的淀粉酶，可用于多种组合物(包括衣物洗涤和盘碟洗涤应用、表面清洁剂)中，以及用于由淀粉或生物质制备乙醇的组合物中。洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。示例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯(诸如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)。洗涤剂可以包含漂白体系，其可以包含可与形成过酸的漂白活化剂(如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰氧苯磺酸盐(NOBS))结合的H2O2源(如过硼酸盐或过碳酸盐)。作为另外一种选择，漂白体系可以包含过氧酸(例如，酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸)。漂白体系也可为酶漂白体系，例如过水解酶，诸如在国际PCT申请WO2005/056783中所述的那些。可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，所述常规稳定剂例如为多元醇，诸如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯；并且所述组合物可按照例如WO92/19709和WO92/19708中所述的方法配制。洗涤剂还可包含其它常规的洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或香料。pH(在使用浓度下的水溶液中测得)通常为中性或碱性，例如，pH为约7.0至约11.0。用于包含本发明的α-淀粉酶的洗涤剂组合物的具体形式描述如下。7.2.重垢液体(HDL)衣物洗涤剂组合物示例性HDL衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂(10％-40％wt/wt)，去污表面活性剂包括阴离子去污表面活性剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或它们的混合物)，和任选的非离子表面活性剂(选自直链或支链或无规链的、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基酚烷氧基化物)，其中阴离子去污表面活性剂(亲水指数(HIc)为6.0至9)与非离子去污表面活性剂的重量比大于1:1。合适的去污表面活性剂也包括阳离子去污表面活性剂(选自烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基叔锍化合物和/或它们的混合物)；两性离子和/或两性去污表面活性剂(选自烷醇胺硫代甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂以及它们的混合物。所述组合物可任选地包含表面活性增强聚合物，其由两亲性的烷氧基化油脂清洁聚合物(选自具有亲水性和疏水性支链的烷氧基化聚合物，诸如在0.05重量％-10重量％范围内的烷氧基化聚亚烷基亚胺)和/或无规接枝聚合物(通常包含亲水性主链，其包含选自下列的单体：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和多元醇诸如甘油、以及它们的混合物；以及疏水侧链，其选自：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和C1-C6单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯、以及它们的混合物。所述组合物可包含另外的聚合物诸如去垢性聚合物(包括阴离子封端的聚酯，例如SRP1，包含选自糖类、二元羧酸、多元醇以及它们的组合的至少一种单体单元的无规或嵌段构型的聚合物，无规或嵌段构型的基于对苯二甲酸乙二酯的聚合物和它们的共聚物，例如Repel-o-texSF、SF-2和SRP6、TexcareSRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325、MarloquestSL)，抗再沉积聚合物(0.1重量％至10重量％，包括羧酸酯聚合物，诸如包含选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、延胡索酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸以及它们的任何混合物的至少一种单体的聚合物，乙烯基吡咯烷酮均聚物，和/或聚乙二醇，分子量在500至100,000Da的范围内)；纤维素聚合物(包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧烷基纤维素、烷基羧烷基纤维素，示例包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物)和聚羧酸盐(诸如马来酸/丙烯酸无规共聚物或聚丙烯酸盐均聚物)。所述组合物还可包含饱和或不饱和的脂肪酸，优选地饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0重量％至10重量％)；沉积助剂(其示例包括多糖，优选地为纤维素聚合物，聚二烯丙基二甲基铵卤化物(DADMAC)，和无规或嵌段构型的DADMAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物的共聚物以及它们的混合物，阳离子瓜尔胶，阳离子纤维素诸如阳离子羟乙基纤维素、阳离子淀粉、阳离子聚丙烯酰胺、以及它们的混合物。所述组合物还可包含染料转移抑制剂，其示例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或它们的混合物；螯合剂，其示例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨酸四钠盐(GLDA))、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸以及它们的任何盐、N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三乙四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)、以及它们的衍生物。所述组合物优选地包含酶(一般约0.01重量％的活性酶至0.03重量％的活性酶)，其选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、以及它们的任何混合物。所述组合物可包含酶稳定剂(其示例包括多元醇诸如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、可逆的蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物诸如4-甲酰基苯基硼酸)。所述组合物任选地包含硅酮或基于脂肪酸的抑泡剂；调色染料，钙阳离子和镁阳离子，可视信号成分，消泡剂(0.001重量％至约4.0重量％)和/或结构剂/增稠剂(0.01重量％至5重量％，选自二甘油酯和三甘油酯、乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、以及它们的混合物)。所述组合物可为任何液体形式，例如液体或凝胶形式、或它们的任何组合。所述组合物可为任何单位剂型，例如小袋。7.3.重垢干性/固体(HDD)衣物洗涤剂组合物示例性HDD衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂，其包括阴离子去污表面活性剂(例如，直链或支链的或无规链的、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)，非离子去污表面活性剂(例如，直链或支链的或无规链的、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物，和/或C6-C12烷基酚烷氧基化物)，阳离子去污表面活性剂(例如，烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基叔锍化合物、以及它们的混合物)，两性离子和/或两性去污表面活性剂(例如，链烷醇胺磺基甜菜碱)，两性表面活性剂，半极性非离子表面活性剂，以及它们的混合物；助洗剂，其包括无磷助洗剂(例如沸石助洗剂，示例包括在0重量％至小于10重量％的范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)、磷酸盐助洗剂(例如在0重量％至小于10重量％的范围内的三磷酸钠)、柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸、硅酸盐(例如在0重量％至小于10重量％的范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠，或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(例如在0重量％至小于80重量％的范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂，其包括光漂白剂(例如磺化酞菁锌、磺化铝酞菁、呫吨染料，以及它们的混合物)，疏水性或亲水性漂白活化剂(例如，十二烷酰基苯酚磺酸酯、癸酰基苯酚磺酸酯、癸酰基羟苯甲酸或它们的盐、3,5,5-三甲基己酰苯酚磺酸酯、四乙酰乙二胺-TAED、壬酰基苯酚磺酸酯-NOBS、腈季铵化合物，以及它们的混合物)，过氧化氢源(例如无机过氧化氢合物盐，其示例包括过硼酸、过碳酸、过硫酸、过磷酸或过硅酸的单或四水合钠盐)，预先形成的亲水性和/或疏水性过酸(例如，过羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚胺酸和盐、过氧单硫酸和盐，以及它们的混合物)，和/或漂白催化剂(例如，亚胺漂白增效剂(其示例包括亚胺阳离子和聚离子)、亚胺两性离子、改性胺、改性胺氧化物、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮，以及它们的混合物，和含金属漂白催化剂(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子连同辅助金属阳离子诸如锌或铝，及螯合剂(sequestrate)诸如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐)。所述组合物优选地包含酶，例如，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、以及它们的任何混合物。所述组合物可任选地包含另外的洗涤剂成分，包括香料微胶囊、淀粉包封的香料谐香剂、调色剂、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔软剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。7.4.自动盘碟洗涤(ADW)洗涤剂组合物示例性ADW洗涤剂组合物包含非离子表面活性剂，包括以0重量％至10重量％的量存在的乙氧基化的非离子表面活性剂、醇烷氧基化的表面活性剂、环氧封端的聚(烷氧基化)醇、或氧化胺表面活性剂；在5-60％范围内的助洗剂，包括磷酸盐助洗剂(例如，单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐、其它低聚多磷酸盐、三聚磷酸钠-STPP)和无磷助洗剂(例如，基于氨基酸的化合物，包括甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧甲基菊粉及其盐和衍生物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)和它们的盐、聚羧酸的均聚物和共聚物及它们的部分或完全中和盐，在0.5重量％至50重量％的范围内的单体聚羧酸和羟基羧酸及其盐；在约0.1重量％至约50重量％的范围内提供尺寸稳定性的磺化/羧基化聚合物；在约0.1重量％至约10重量％的范围内的助干剂(例如，聚酯，尤其是阴离子聚酯，任选地连同另外的具有3至6个官能度(通常为有利于缩聚的酸、醇或酯官能度)的单体，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或它们的前体化合物，尤其是反应性环状碳酸酯和脲型)；在约1重量％至约20重量％的范围内的硅酸盐(包括硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐)；无机漂白剂(例如过氧化氢合物盐诸如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如，有机过氧酸，包括二酰基过氧化物和四酰基过氧化物，尤其是双过氧化十二烷二酸、双过氧化十四烷二酸和双过氧化十六烷二酸)；漂白活化剂(即，在约0.1重量％至约10重量％的范围内的有机过酸前体)；漂白催化剂(例如，锰三氮杂环壬烷和相关复合体，Co、Cu、Mn和Fe二吡啶胺及相关复合物，以及戊胺乙酸钴(III)和相关复合物)；在约0.1重量％至5重量％的范围内的金属护理剂(例如，苯并三唑、金属盐和复合物、和/或硅酸盐)；在每克自动盘碟洗涤剂组合物约0.01至5.0mg活性酶范围内的酶(例如，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶，以及它们的混合物)；以及酶稳定剂组分(例如，低聚糖、多糖和无机二价金属盐)。7.5.另外的洗涤剂组合物下文的编号段落中描述了可向其中添加本发明的淀粉酶的另外的示例性洗涤剂配方。1)配制成堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：约7％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C12-18醇，1-2个环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如，C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C14-15醇，7个EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约2％至约6％的可溶硅酸盐(例如，Na2O,2SiO2)；约15％至约22％的沸石(例如，NaA1SiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如，C6H5Na3O7/C6H8O7)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如，NaBO3H2O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001％-0.1％蛋白的酶(以纯酶计)；以及0％-5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料、光学增白剂、光漂白剂)。2)配制成堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：约6％至约11％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C12-18醇，1-2个EO)或烷基硫酸盐(例如，C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C14-15醇，7个EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(例如，Na2O,2SiO2)；约24％至约34％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如，C6H5Na3O7/C6H8O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1％-6％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；0％-5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料)。3)配制成堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：约5％至约9％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7个EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如，C16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na2CO3)；约3％至约9％的可溶硅酸盐(例如，Na2O,2SiO2)；约23％至约33％的沸石(如NaA1SiO4)；0％至约4％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如，NaBO3H2O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如，EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；0％-5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料、光学增白剂)。4)配制成堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：约8％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7个EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na2CO3)；约1％至约5％的可溶硅酸盐(例如，Na2O,2SiO2)；约25％至约35％的沸石(例如，NaA1SiO4)；0％至约10％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1％-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料)。5)水性液体洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7个EO，或者C12-15醇，5个EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如，油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如，PVP、PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，分散剂、抑泡剂、香料、光学增白剂)。6)水性结构化液体洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；3％-9％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7个EO，或者C12-15醇，5个EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如，油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaA1SiO4)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，PEG、PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(例如，甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比为25:1，MW3800)；0％至约5％的甘油；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，分散剂、抑泡剂、香料、光学增白剂)。7)配制成堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(例如，Na2O,2SiO2)；约20％至约40％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约2％至约8％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如，NaBO3H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，光学增白剂、抑泡剂、香料)。8)配制成颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含约8％至约14％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(Na2O,2SiO2)；约30％至约50％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约3％至约11％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如，C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如，PVP、马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料)。9)配制成颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含约6％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约18％至约32％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约5％至约20％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如，C6H5Na3O7)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如，NaBO3H2O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如，NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸酯或PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，光学增白剂、香料)。10)水性液体洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含约15％至约23％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C12-15醇，2-3个EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7个EO，或者C12-15醇，5个EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如，月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的水溶助长剂(例如，甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，聚合物、分散剂、香料、光学增白剂)。11)水性液体洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含约20％至约32％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；6％-12％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7个EO，或者C12-15醇，5个EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，水溶助长剂、分散剂、香料、光学增白剂)。12)配制成堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：约25％至约40％的阴离子表面活性剂(直链烷基苯磺酸盐，烷基硫酸盐，α-烯烃磺酸盐，α-磺基脂肪酸甲酯，链烷磺酸盐，皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约5％至约15％的可溶硅酸盐(例如，Na2O,2SiO2)；0％至约5％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约15％至约28％的沸石(NaA1SiO4)；0％至约20％的过硼酸钠(例如，NaBO3.4H2O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；0％-3％的微量成分(例如，香料、光学增白剂)。13)如在上述组合物1)-12)中所述的洗涤剂组合物，其中所有或部分的直链烷基苯磺酸盐由(C12-C18)烷基硫酸盐替代。14)配制成堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约10％至约20％的层状二硅酸盐(例如，SK56，购自Hoechst)；约3％至约12％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；0％至约6％的可溶硅酸盐(例如，Na2O,2SiO2)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸酯和PVP)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-5％的微量成分(例如，光学增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。15)配制成堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na2CO3)；0％至约4％的可溶硅酸盐(例如，Na2O,2SiO2)；约13％至约22％的过碳酸钠；1％-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，聚羧酸酯和PVP)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；以及0％-3％的微量成分(例如，光学增白剂、膦酸盐、香料)。16)如上文在1)-15)中所述的洗涤剂配方，该洗涤剂配方包含：稳定的或包封的过酸，该过酸为附加组分或者为已指定的漂白体系的替代物。17)如上文在1)、3)、7)、9)和12)中所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐由过碳酸盐替代。18)如上文在1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物另外含有锰催化剂。该锰催化剂例如为在“Efficientmanganesecatalystsforlow-temperaturebleaching,”Nature369:637-639(1994)中所述的化合物之一。19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：液体非离子表面活性剂如直链烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如，磷酸盐)、酶，以及碱。洗涤剂还可包含阴离子表面活性剂和/或漂白体系。如上所述，本发明的淀粉酶多肽可以在洗涤剂中常规采用的浓度掺入。目前可预期，在该洗涤剂组合物中，可以对应于每升洗涤液体0.00001mg-1.0mg(以纯酶蛋白计)淀粉酶多肽的量加入酶。该洗涤剂组合物还可包含其它常规洗涤剂成分，例如抗絮凝剂材料、填充材料、消泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂，以及香料。可将该洗涤剂组合物配制成包括适于预处理有污渍织物的衣物洗涤添加剂组合物和漂洗时添加的织物软化剂组合物的手工(手动)或机器(自动化)衣物洗涤剂组合物，或配制成通常用于家用硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制成用于手动或自动化盘碟洗涤操作。本文所述的任意清洁组合物可包括任意数目的附加酶。通常，酶应与所选择的洗涤剂相容(例如，就最佳pH、与其它酶和非酶成分的相容性等而言)，并且酶应以有效量存在。提供以下酶作为示例。蛋白酶：合适的蛋白酶包括源自动物、植物或微生物的那些。包括化学改性的或蛋白质工程化的突变体，以及天然加工的蛋白质。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶，或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的示例为枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属(Bacillus)的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见，例如WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的示例为胰蛋白酶(例如，如源自猪或牛的胰蛋白酶)和镰刀菌(Fusarium)蛋白酶(参见，例如WO89/06270和WO94/25583)。可用的蛋白酶的示例还包括但不限于WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所述的变体。可商购获得的蛋白酶包括但不限于：PRIMASETM、DURALASETM、KANNASETM和BLAZETM(NovoNordiskA/S和NovozymesA/S)；MAXACALTM、MAXAPEMTM、PURAFECTOXPTM、FN2TM和FN3TM(DaniscoUSInc.)。其它示例性蛋白酶包括：来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquifaciens)的NprE和来自纤维单胞菌(Cellulomonassp.)菌株69B4的ASP。脂肪酶：合适的脂肪酶包括源自细菌或真菌的那些。包括化学改性的、蛋白质水解改性的、或蛋白质工程化的突变体。可用的脂肪酶的示例包括但不限于：来自腐质霉属(Humicola)(同义词嗜热真菌(Thermomyces))，例如来自绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)(嗜热棉毛菌(T.lanuginosus))(参见例如，EP258068和EP305216)，来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如，WO96/13580)的脂肪酶；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(参见例如，EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如，EP331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如，GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属SD705菌株(参见例如，WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(参见例如，WO96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(参见例如，Dartois等人，BiochemicaetBiophysicaActa，1131:253-360(1993))、嗜热芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(参见例如，JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如，WO91/16422)的脂肪酶。预期用于配方的另外的脂肪酶变体包括(例如)以下专利中所述的那些：WO92/05249、WO94/01541、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079、WO97/07202、EP407225和EP260105。一些可商购获得的脂肪酶包括和LIPOLASEULTRATM(NovoNordiskA/S和NovozymesA/S)。聚酯酶：组合物中可包括合适的聚酯酶，诸如在例如WO01/34899、WO01/14629和US6933140中描述的那些。淀粉酶：该组合物可与其它淀粉酶如非生产增强型淀粉酶相结合。这些淀粉酶可包括可商购获得的淀粉酶，诸如但不限于和BANTM(NovoNordiskA/S和NovozymesA/S)；和(购自DaniscoUSInc.)。纤维素酶：可将纤维素酶添加到组合物中。合适的纤维素酶包括源自细菌或真菌的那些。包括化学改性的或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来源于芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属(Thielavia)、支顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如特异腐质霉(Humicolainsolens)、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)产生的真菌纤维素酶，例如美国专利4,435,307、5,648,263、5,691,178、5,776,757、以及WO89/09259中所公开的纤维素酶。预期使用的示例性纤维素酶为对纺织物具有颜色护理有益效果的那些纤维素酶。此类纤维素酶的示例为在例如EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397和WO98/08940中描述的纤维素酶。其它示例为纤维素酶变体，如WO94/07998、WO98/12307；WO95/24471；PCT/DK98/00299、EP531315、美国专利5,457,046、5,686,593，和5,763,254中所述的那些。可商购获得的纤维素酶包括和(NovoNordiskA/S和NovozymesA/S)、和(DaniscoUSInc.)，以及KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。过氧化物酶/氧化酶：预期用于组合物的合适的过氧化物酶/氧化酶包括来源于植物、细菌或真菌的那些。包括化学改性的或蛋白质工程化的突变体。可用的过氧化物酶的示例包括来源于鬼伞属(Coprinus)(例如，来源于灰色鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶，以及它们的变体，如WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所述的那些。可商购获得的过氧化物酶包括例如GUARDZYMETM(NovoNordiskA/S和NovozymesA/S)。洗涤剂组合物还可包括2,6-β-D-果聚糖水解酶，其可有效用于除去/清洁家庭和/或工业纺织物/衣物上存在的生物膜。可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。可将洗涤添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，配制为例如颗粒、液体、浆液等。示例性的洗涤添加剂配方包括但不限于颗粒尤其是无尘颗粒、液体尤其是稳定化的液体或浆液。无尘颗粒可以例如按照美国专利4,106,991和4,661,452中所公开的那样来制备，并且可任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质涂层材料的示例为平均摩尔量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产品(例如，聚乙二醇、PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基苯酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及单甘油脂肪酸酯、二甘油脂肪酸酯和三甘油脂肪酸酯。适于用流化床技术施加的形成膜的涂层材料的示例在例如GB1483591中给出。例如，可以根据制定的方法通过添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸使液体酶制剂稳定。可以根据EP238,216中所公开的方法制备受保护的酶。洗涤剂组合物可以呈任何便利的形式，例如，条状、片状、粉末状、颗粒状、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常包含最多约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。还可以想到含有约30％或更少水的致密洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可任选地包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的(包括半极性)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子的。表面活性剂的存在量可以很宽泛，可为从约0.1重量％至约60重量％。当包含在其中时，洗涤剂通常包含约1％至约40％的阴离子表面活性剂，诸如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂。当包含在其中时，洗涤剂通常包含约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，诸如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。洗涤剂可含有0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或层状硅酸盐(例如，购自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。示例性的聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(例如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物)和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物的酶，该稳定剂为例如多元醇(例如，丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯)或苯基硼酸衍生物(例如，4-甲酰基苯基硼酸)。可按照WO92/19709和WO92/19708中所述的方法配制所述组合物。预期在洗涤剂组合物中，尤其是酶变体可以对应于每升洗涤液体约0.01mg至约100mg酶蛋白(例如，每升洗涤液体约0.05mg至约5.0mg酶蛋白或每升洗涤液体0.1mg至约1.0mg酶蛋白)的量添加。可向其中添加本发明的淀粉酶的另外的示例性洗涤剂配方在以下参考文献中有所描述：例如WO2010065455、WO2011072099、WO2011130222、WO2011140364、WO2011156297、WO2011156298、WO2011130076、WO2011133381、WO2011156297、WO2011156298、EP1794295B1、US20110195481、US20110212876、US20110257063、WO2010039958、WO2011072117、WO2011098531、WO2011100410、WO2011130076、WO2011133381、WO2011140316、US20070215184、US20070251545、US20090075857、US20090137444、US20090143271、US20100011513、US20100093588、US20110201536、US20110232004、US20110237482、US20110312868、US20120003326、US20120004155、WO2011131585、EP707628B1、US5719115、EP736084B1、US5783545、EP767830B1、US5972668、EP746599B1、US5798328、EP662117B1、US5898025、US6380140、EP898613B1、US3975280、US6191092、US6329333、US6530386、EP1307547B1、US7153818、EP1421169B1、US6979669、EP1529101B1、US7375070、EP1385943B1、US7888104、EP1414977B1、US5855625、EP1921147B1、EP1921148B1、EP701605B1、EP1633469B1、EP1633470B1、EP1794293B1、EP171007B1、US4692260、US7569226、EP1165737B1、US6391838、US6060441、US2009017074、US7320887、EP1737952B1、US7691618、US20070256251、US20050261156、US20050261158、US20100234267、US20110136720、US20110201536、US7811076、US5929017、US5156773、EP2343310A1、WO2011083114、EP214761B1、US4876024、EP675944B1、US5763383、EP517761B1、US6624129、EP1054956B1、US6939702、US6964944、EP832174B1、US20060205628、US20070179076、US20080023031、US20110015110、US20110028372、US4973417、US5447649、US5840677、US5965503、US5972873、US5998344、US6071356、WO9009428、EP1661978A1、EP1698689A1、EP1726636A1、EP1867707A1、EP1876226A1、EP1876227A1、EP0205208A2、EP0206390A2、EP0271152、EP0271154、EP0341999、EP0346136、EP2135934、US20120208734、WO2011127102、WO2012142087、WO2012145062、EP1790713B1、US8066818B2、US8163686B2、US8283300B2、US8354366B2、US20120125374、US3929678和US5898025。7.6.评估洗涤剂组合物中的淀粉酶活性的方法许多α-淀粉酶清洁测定法是本领域已知的，包括样本测定法和微样本测定法。所附的实施例仅描述了几种此类测定法。为了进一步说明组合物和方法以及它们的优点，给出了以下具体实施例，应当理解它们是示例性的而非限制性的。8.酿造组合物本发明的α-淀粉酶可以是酿造工艺(即，制备发酵的麦芽饮料)中使用的酿造组合物中的组分。不可发酵的碳水化合物会形成最终啤酒中所溶解的固形物的大部分。这种残余物的存留是因为麦芽淀粉酶不能够水解淀粉的α-1,6-键。不可发酵的碳水化合物贡献约50卡路里/12盎司啤酒。淀粉酶与葡糖淀粉酶和任选的普鲁兰酶和/或异淀粉酶相结合，有助于将淀粉转化为糊精和可发酵糖，从而减少最终啤酒中残余的不可发酵的碳水化合物。制备这些饮料所使用的主要原材料为水、啤酒花和麦芽。此外，诸如以下的辅料可被用作淀粉的来源：常见的玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙的谷物、谷物片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯淀粉和糖浆(如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖糖浆、大麦和/或小麦糖浆)等。出于数种原因，麦芽(其主要从选定的大麦品种生产)对啤酒的总体特征和质量具有最大的影响。第一，麦芽是啤酒中主要的风味剂。第二，麦芽提供可发酵糖的主要部分。第三，麦芽提供蛋白质，其将促成啤酒的酒体和泡沫特征。第四，麦芽提供淀粉糖化期间必需的酶活性。啤酒花也对啤酒的品质(包括风味)有很大贡献。具体地讲，啤酒花(或啤酒花成分)给啤酒中加入想要的苦味化物质。此外，啤酒花起到蛋白质沉淀剂的作用、成为防腐剂并帮助泡沫形成和稳定化。谷物(如大麦、燕麦、小麦)以及植物组分(诸如玉米、啤酒花和稻)也用于酿造，工业和家庭酿造两者。用于酿造的组分可以是未发芽的或者可以是发芽的，即部分萌发的，该组分导致包括α-淀粉酶在内的酶水平提高。要实现成功酿造，需要足够水平的α-淀粉酶活性来确保有适当水平的糖被发酵。因此，可将淀粉酶本身或与另外的α-淀粉酶相结合添加至用于酿造的组分中。如本文所用的术语“原料”意指被压碎或者破碎的谷物和植物组分。例如，用于啤酒生产的大麦是已经过粗研磨或者压碎以产生适于生产发酵用醪液的稠度的谷物。如本文所用，术语“原料”包括任何前述类型的呈压碎或者粗磨形式的植物和谷物。本文所述的方法可用于测定面粉和原料中的α-淀粉酶活性水平。用于制备啤酒的工艺是本领域中所熟知的。参见例如，WolfgangKunze(2004)“TechnologyBrewingandMalting,”ResearchandTeachingInstituteofBrewing，Berlin(VLB)，第3版。简而言之，该工艺涉及：(a)制备醪液，(b)过滤醪液以制备麦芽汁，以及(c)使麦芽汁发酵以获得发酵饮料如啤酒。通常，将研磨或压碎的麦芽与水相混合并在受控的温度下保持一段时间，使麦芽中存在的酶将麦芽中存在的淀粉转化为可发酵糖。然后将醪液转移到醪液过滤器，在醪液过滤器中将液体与谷物残余物分离。这种甜的液体被称为“麦芽汁”而剩下的谷物残余物被称作“麦糟”。通常对醪液进行提取，这包括向醪液添加水以从麦糟回收残留的可溶性提取物。然后将麦芽汁剧烈煮沸，将麦芽汁灭菌并帮助产生颜色、风味和气味。在煮沸过程中的某个时刻加入啤酒花。将麦芽汁冷却并转移到发酵罐。然后使麦芽汁在发酵罐中与酵母接触。可将发酵罐冷却以终止发酵。除去酵母絮凝物。最后，将啤酒冷却并储存一段时间，在该时间段中，啤酒变澄清且产生出风味，并且任何可能损害啤酒的外观、风味和货架期的物质都沉淀出来。啤酒通常含有约2％至约10％v/v的酒精，不过也可以获得更高酒精含量(例如，18％v/v)的啤酒。在包装之前，对啤酒充二氧化碳气体并任选地将其过滤并巴氏灭菌。可将酿造组合物(包含淀粉酶，其与葡糖淀粉酶和任选的普鲁兰酶和/或异淀粉酶相组合)添加到上述步骤(a)(即，在醪液制备期间)的醪液中。作为另外一种选择或除此之外，可将酿造组合物添加到上述步骤(b)(即，在醪液过滤期间)的醪液中。作为另外一种选择或除此之外，可将酿造组合物添加到上述步骤(c)(即，在麦芽汁发酵期间)的麦芽汁中。发酵饮料如啤酒可通过上述方法中的一种来制备。发酵饮料可以是啤酒，如全麦芽啤酒、按“纯净法”(“Reinheitsgebot”)酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒(IPA)、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，但也可以是备选的谷物和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒，等等。9.碘阳性淀粉的减少当α-淀粉酶用于液化和/或糖化方法中时可减少碘阳性淀粉(IPS)。IPS的一个来源是来自于逃脱水解的直链淀粉和/或来自于回生淀粉聚合物。因为淀粉分子倾向于相互结合之后结晶度增加，因此在老化时，淀粉糊或者凝胶中会自发出现淀粉回生。由于淀粉分子逐渐缔合成更大的粒子，低浓度的溶液会变得愈加浑浊。发生自发沉淀后，所沉淀的淀粉会看似回复至其初始的冷水不溶性状态。较高浓度的淀粉糊在冷却时会凝固成凝胶，由于淀粉分子的缔合程度递增，老化的凝胶逐步变得更坚实。该现象是由于相邻淀粉分子的羟基之间有较强的氢键形成趋势而引起的。参见J.A.Radley编辑，StarchanditsDerivatives194-201(ChapmanandHall,London(1968))。糖液中存在IPS会不利地影响最终产品质量，并且代表下游加工的一个主要问题。IPS会堵塞或减缓过滤系统，并淤塞用于纯化的炭柱。当IPS达到充分高的水平时，其可能渗漏出炭柱而降低生产效率。另外，在储存时其可能会导致最终产品浑浊，这对最终产品的品质而言是不可接受的。IPS的量可通过隔离糖化罐并将内容物回混来减少。然而，IPS将尤其积聚在炭柱和过滤系统中。预期使用α-淀粉酶可通过减少IPS的量来改善整体工艺性能。本文中所引用的所有参考文献出于所有目的全文以引用方式并入本文中。为了进一步说明组合物和方法以及它们的优点，给出了以下具体实施例，应当理解它们是示例性的而非限制性的。实施例实施例1PcuAmy1的克隆和表达PcuAmy1(NCBI登录号：ZP_07385374.1)是来源于细菌菌株解凝乳类芽孢杆菌的α-淀粉酶。制备表达质粒以评估其在枯草芽孢杆菌中的表达。表达构建体是由GeneRayBiotechCo.,Ltd(Shanghai,China)合成的，所述表达构建体含有：aprE启动子；用于指导枯草芽孢杆菌中的靶蛋白分泌的aprE信号序列；编码肽Ala-Gly-Lys以促进靶蛋白分泌的寡核苷酸，名称为AGK-proAprE；以及PcuAmy1的优化序列(SEQIDNO:1)。将所述合成构建体用XhoI和EcoRI消化，并连接到用相同限制性酶消化的基于p2JM的载体，以获得表达质粒p2JM706。按照制造商的方案，使用连接混合物来化学转化感受态的大肠杆菌TOP10细胞(InvitrogenCorp.)。将经转化的细胞接种在补充有50ppm氨苄青霉素的Luria琼脂平板上并在37℃下温育过夜。从平板上挑取三个转化体并接种到补充有50ppm氨苄青霉素的5mlLuria肉汤中。使培养物在37℃下生长过夜。提取质粒并通过DNA测序来确定PcuAmy1基因的序列。然后将p2JM706质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞(degUHy32，ΔscoC)中并将经转化的细胞涂布到补充有5ppm氯霉素和1％淀粉的Luria琼脂平板上。选择在平板上具有清晰的最大晕圈的菌落并使其在含有GrantII培养基的250ml摇瓶中进行发酵。质粒p2JM706中PcuAmy1基因的经密码子优化的核苷酸序列示出为SEQIDNO:1：GCCGACAACGGCACAATCATGCAGTATTTCGAGTGGTACCTGCCGAACGACGGAGCGCACTGGAACAGACTTAATAACGACGCACAAAACCTGAAAAATGTGGGCATCACGGCAGTGTGGATTCCTCCGGCATACAAGGGCGGCAGCTCAGCAGATGTTGGCTACGGAGTTTACGATACATACGACCTGGGCGAGTTCAATCAGAAAGGCACGGTCAGAACAAAGTACGGAACGAAGAGCGAACTGATTTCAGCGGTCAACAATCTTCACGCAAAGGGCATTGCGGTTTACGGCGACGTGGTCCTGAACCATAGAATGAATGCGGATGCAACGGAGCTTGTGGATGCGGTTGAGGTGGATCCGAACAACAGAAACGTCGAGACGACAAGCACGTATCAGATCCAGGCATGGACGCAATACGATTTCCCGGGCAGAGGCAACACGTACAGCAGCTTTAAATGGAGATGGTATCACTTCGACGGCGTCGACTGGGACCAGAGCAGAGGCCTGAACAGAATCTATAAGCTGAGAGGCGATGGCAAGGATTGGGACTGGGAGGTCGACAGCGAGTACGGCAACTACGATTACCTGATGGGAGCGGACCTGGACTTCAACCACCCGGATGTGGTTAACGAAACAAAGACATGGGGCAAATGGTTTGTGAACACGGTGAACCTGGATGGCGTCAGACTGGACGCGGTTAAGCACATCAAGTTCGACTTCATGAGAGACTGGGTGAACAACGTGAGAAGCACGACGGGCAAGAACCTTTTCGCAGTTGGCGAGTATTGGCACTACGACGTGAACAAACTGAACAGCTACATCACGAAGACGAATGGCACGATGAGCCTGTTCGACGTGCCGCTGCACTTTAGATTTTATGATGCAAGCAACGGCGGAGGCGGCTACGACATGAGAAACCTGCTGAATAACACGCTGATGAGCAGCAACCCGATGAAGGCGGTTACATTCGTTGAGAACCATGACACACAACCGACGCAGGCCCTGCAATCAACGGTCCAAAGCTGGTTTAAGCCGCTTGCGTATGCTACAATCCTGACGAGAGAGCAAGGCTACCCGTGCGTTTTCTACGGCGACTATTATGGAACAAGCGACGGCAAAATTAGCAGCTACAAGCCGATCATGGATAAGCTTCTTAACGCGAGAAAGGTGTACGCCTACGGCACGCAGAGAGATTACTTCGATCATCCGGACATCGTTGGCTGGACAAGAGAAGGCGATGCAGCACATGCTGGCTCAGGACTGGCAACGCTTATCACAGATGGCCCTGGCGGAAGCAAGTGGATGTATGTTGGAACGTCAAAGGCAGGCCAGGTCTGGACGGATAAAACAGGAAACAGAAGCGGAACGGTGACGATTGATGCCAATGGCTGGGGAAACTTTTGGGTTAATGGCGGATCAGTTAGCGTTTGGGCAAAATAAPcuAmy1前体多肽的氨基酸序列示出为SEQIDNO:2。信号肽以粗斜体示出。MFSIDFMKSRKRLISYMVVFAFLAGLVFQPLGATKASAADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLRGDGKDWDWEVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNGGSVSVWAK成熟形式的PcuAmy1的氨基酸序列示出为SEQIDNO:3：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLRGDGKDWDWEVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNGGSVSVWAK实施例2PcuAmy1变体PcuAmy1-v1的克隆和表达将具有Arg-177和Gly-178缺失(即，del(R177,G178)，ΔR177-ΔG178，或ΔRG；Suzuki,Y.etal.(1989)J.Biol.Chem.264:18933-38)的PcuAmy1变体(PcuAmy1-v1)构建于表达质粒中，以评估其在枯草芽孢杆菌中的表达。基于SEQIDNO:1设计具有经工程改造的限制性位点和重叠区域的四个引物。首先，通过PCR分别获得Arg-177和Gly-178之前的前部分片段及Arg-177和Gly-178之后的后部分序列。然后，通过组合这两种片段来进行重叠延伸PCR，以获得全长PcuAmy1-v1基因。将重叠延伸PCR产物用BssHII和XhoI消化并连接到用相同限制性酶消化的p2JM载体中，以获得表达质粒p2JM754。按照制造商的方案，使用连接混合物来转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(InvitrogenCorp.)。将经转化的细胞接种在补充有50ppm氨苄青霉素的Luria琼脂平板上并在37℃下温育过夜。从平板上挑取三个转化体并接种到补充有50ppm氨苄青霉素的5mlLuria肉汤中。使培养物在37℃下生长过夜，提取质粒DNA，并且通过DNA测序来确定PcuAmy1-v1基因的正确序列。然后将p2JM754质粒转化到枯草芽孢杆菌细胞中并将经转化的细胞涂布到补充有5ppm氯霉素和1％淀粉的Luria琼脂平板上。选择在平板上具有清晰的最大晕圈的菌落并使其在含有GrantII培养基的250ml摇瓶中进行发酵。质粒p2JM754中PcuAmy1-v1基因的核苷酸序列示出为SEQIDNO:4：GCCGACAACGGCACAATCATGCAGTATTTCGAGTGGTACCTGCCGAACGACGGAGCGCACTGGAACAGACTTAATAACGACGCACAAAACCTGAAAAATGTGGGCATCACGGCAGTGTGGATTCCTCCGGCATACAAGGGCGGCAGCTCAGCAGATGTTGGCTACGGAGTTTACGATACATACGACCTGGGCGAGTTCAATCAGAAAGGCACGGTCAGAACAAAGTACGGAACGAAGAGCGAACTGATTTCAGCGGTCAACAATCTTCACGCAAAGGGCATTGCGGTTTACGGCGACGTGGTCCTGAACCATAGAATGAATGCGGATGCAACGGAGCTTGTGGATGCGGTTGAGGTGGATCCGAACAACAGAAACGTCGAGACGACAAGCACGTATCAGATCCAGGCATGGACGCAATACGATTTCCCGGGCAGAGGCAACACGTACAGCAGCTTTAAATGGAGATGGTATCACTTCGACGGCGTCGACTGGGACCAGAGCAGAGGCCTGAACAGAATCTATAAGCTGGATGGCAAGGATTGGGACTGGGAGGTCGACAGCGAGTACGGCAACTACGATTACCTGATGGGAGCGGACCTGGACTTCAACCACCCGGATGTGGTTAACGAAACAAAGACATGGGGCAAATGGTTTGTGAACACGGTGAACCTGGATGGCGTCAGACTGGACGCGGTTAAGCACATCAAGTTCGACTTCATGAGAGACTGGGTGAACAACGTGAGAAGCACGACGGGCAAGAACCTTTTCGCAGTTGGCGAGTATTGGCACTACGACGTGAACAAACTGAACAGCTACATCACGAAGACGAATGGCACGATGAGCCTGTTCGACGTGCCGCTGCACTTTAGATTTTATGATGCAAGCAACGGCGGAGGCGGCTACGACATGAGAAACCTGCTGAATAACACGCTGATGAGCAGCAACCCGATGAAGGCGGTTACATTCGTTGAGAACCATGACACACAACCGACGCAGGCCCTGCAATCAACGGTCCAAAGCTGGTTTAAGCCGCTTGCGTATGCTACAATCCTGACGAGAGAGCAAGGCTACCCGTGCGTTTTCTACGGCGACTATTATGGAACAAGCGACGGCAAAATTAGCAGCTACAAGCCGATCATGGATAAGCTTCTTAACGCGAGAAAGGTGTACGCCTACGGCACGCAGAGAGATTACTTCGATCATCCGGACATCGTTGGCTGGACAAGAGAAGGCGATGCAGCACATGCTGGCTCAGGACTGGCAACGCTTATCACAGATGGCCCTGGCGGAAGCAAGTGGATGTATGTTGGAACGTCAAAGGCAGGCCAGGTCTGGACGGATAAAACAGGAAACAGAAGCGGAACGGTGACGATTGATGCCAATGGCTGGGGAAACTTTTGGGTTAATGGCGGATCAGTTAGCGTTTGGGCAAAATAA成熟形式的PcuAmy1-v1的氨基酸序列示出为SEQIDNO:5：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWEVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNGGSVSVWAK实施例3PcuAmy1及其变体的蛋白水解裂解野生型PcuAmy1淀粉酶或PcuAmy-v1变体与枯草杆菌蛋白酶一起温育导致了蛋白裂解，如当反应产物经受SDS/PAGE电泳时所观测到的。图2是SDS/PAGE凝胶的图像，示出了在存在递增量的GG36蛋白酶(从0至40μg，如在凝胶上所显示的)的情况下20μgPcuAmy1-v1的裂解。凝胶右侧的字母指示(A)完整的全长PcuAmy1-v1，(B)PcuAmy1-v1的第一裂解产物，(C)GG36蛋白酶，(D)GG36蛋白质制品中的污染物，以及(E)PcuAmy1-v1的第二裂解产物。在PcuAmy-v1淀粉酶与枯草杆菌蛋白酶一起温育后观测到的主要降解产物具有约38kDa和16kDa的分子量(分别为B和E)。蛋白质降解的量取决于所使用的蛋白酶的浓度。这使得PcuAmy1淀粉酶不适宜包含在含有常用枯草杆菌蛋白酶的酶洗涤剂配方中。将PcuAmy-v1蛋白质的样品与GG36蛋白酶(迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)一起温育，并通过质谱来分析反应产物。结果符合在残基Q334和L336(未示出)之间发生的水解。实施例4耐受蛋白水解裂解的PcuAmy1变体在此实施例中描述了枯草芽孢杆菌菌株表达的PcuAmy1-v3和其它变体3A至3L的构建。PcuAmy1-v3是PcuAmy1的变体，其具有突变E186P、G472K并且缺失R177和G178。置换E186P及在R177和G178处的缺失增加了PcuAmy1的洗涤剂稳定性。置换G472K改善了清洁性能。这些突变对蛋白酶敏感性没有任何影响(数据未示出)。因此，在制备用于探究其它突变对蛋白酶稳定性影响的变体中包括这些突变不会对结果产生干扰。为了表达PcuAmy1-v3，使用引物PSV_FW(SEQIDNO:6)和PSV3_RV(SEQIDNO:7)对pHP024T02-PcuAmy1-v1质粒DNA(如上所述)进行PCR。引物PSV_FW(SEQIDNO:6)：ACCCCCCTCGAGGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGGAATATTTATACAATATCATATGACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCAGCCGACAACGGCACAATCATGC引物PSV3_RV(SEQIDNO:7)：CTCGATGCGGCCGCAGCTGTTTTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGCTTAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTTATTTTGCCCAAACGCTAACTGATCCTTTATTAACCCAAAAGTTTCCCCAGCC根据由供应商提供的方案，使用PlatinumTaq高保真DNA聚合酶(Invitrogen,LifeTechnologies)进行PCR。将PCR片段纯化，用XhoI–NotI消化，连接至载体pICatH并转化到枯草芽孢杆菌细胞中，如US7968691中所述。在盛有心浸液琼脂(Difco)和10mg/L硫酸新霉素以及5mg/L氯霉素的琼脂平板上选择枯草芽孢杆菌转化体。选择一个具有淀粉水解活性的转化体，并且通过DNA测序(BaseClear,TheNetherlands)对淀粉酶基因进行序列验证。此枯草芽孢杆菌克隆体含有质粒pICatH-PcuAmy1-v3并且表达PcuAmy1-v3淀粉酶。PcuAmy1-v3基因(编码成熟形式的PcuAmy1-v3)的DNA序列以SEQIDNO:8示出。PcuAmy1-v3的蛋白质序列以SEQIDNO:9示出。编码PcuAmy1-v3的核酸序列(SEQIDNO:8)：GCCGACAACGGCACAATCATGCAGTATTTCGAGTGGTACCTGCCGAACGACGGAGCGCACTGGAACAGACTTAATAACGACGCACAAAACCTGAAAAATGTGGGCATCACGGCAGTGTGGATTCCTCCGGCATACAAGGGCGGCAGCTCAGCAGATGTTGGCTACGGAGTTTACGATACATACGACCTGGGCGAGTTCAATCAGAAAGGCACGGTCAGAACAAAGTACGGAACGAAGAGCGAACTGATTTCAGCGGTCAACAATCTTCACGCAAAGGGCATTGCGGTTTACGGCGACGTGGTCCTGAACCATAGAATGAATGCGGATGCAACGGAGCTTGTGGATGCGGTTGAGGTGGATCCGAACAACAGAAACGTCGAGACGACAAGCACGTATCAGATCCAGGCATGGACGCAATACGATTTCCCGGGCAGAGGCAACACGTACAGCAGCTTTAAATGGAGATGGTATCACTTCGACGGCGTCGACTGGGACCAGAGCAGAGGCCTGAACAGAATCTATAAGCTGGATGGCAAGGATTGGGACTGGCCGGTCGACAGCGAGTACGGCAACTACGATTACCTGATGGGAGCGGACCTGGACTTCAACCACCCGGATGTGGTTAACGAAACAAAGACATGGGGCAAATGGTTTGTGAACACGGTGAACCTGGATGGCGTCAGACTGGACGCGGTTAAGCACATCAAGTTCGACTTCATGAGAGACTGGGTGAACAACGTGAGAAGCACGACGGGCAAGAACCTTTTCGCAGTTGGCGAGTATTGGCACTACGACGTGAACAAACTGAACAGCTACATCACGAAGACGAATGGCACGATGAGCCTGTTCGACGTGCCGCTGCACTTTAGATTTTATGATGCAAGCAACGGCGGAGGCGGCTACGACATGAGAAACCTGCTGAATAACACGCTGATGAGCAGCAACCCGATGAAGGCGGTTACATTCGTTGAGAACCATGACACACAACCGACGCAGGCCCTGCAATCAACGGTCCAAAGCTGGTTTAAGCCGCTTGCGTATGCTACAATCCTGACGAGAGAGCAAGGCTACCCGTGCGTTTTCTACGGCGACTATTATGGAACAAGCGACGGCAAAATTAGCAGCTACAAGCCGATCATGGATAAACTGCTTAACGCGAGAAAGGTGTACGCCTACGGCACGCAGAGAGATTACTTCGATCATCCGGACATCGTTGGCTGGACAAGAGAAGGCGATGCAGCACATGCTGGCTCAGGACTGGCAACGCTTATCACAGATGGCCCTGGCGGAAGCAAGTGGATGTATGTTGGAACGTCAAAGGCAGGCCAGGTCTGGACGGATAAAACAGGAAACAGAAGCGGAACGGTGACGATTGATGCCAATGGCTGGGGAAACTTTTGGGTTAATAAAGGATCAGTTAGCGTTTGGGCAAAATAA成熟形式的PcuAmy1-v3(SEQIDNO:9)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK为了确定PcuAmy1蛋白酶敏感性的原因，将PcuAmy1的氨基酸序列与显示出蛋白酶抗性的其它CAZy家族GH-13淀粉酶的氨基酸序列进行比较，所述其它CAZy家族GH-13淀粉酶诸如ST(地衣芽孢杆菌淀粉酶或AmyL)、XTRA(嗜热脂肪地芽孢杆菌淀粉酶或AmyS)、ACE-QK(WO2010/115021)和(Novozymes)。基于观测到的序列差异，设计了PcuAmy1变体PcuAmy1-v3A至PcuAmy1-v3L(即，3A-3L)并测试其蛋白酶抗性。表2中列出了每个变体中存在的突变。将它们引入PcuAmy1-v3(SEQIDNO:9)中，如上文所述。表2.被引入PcuAmy1-v3中产生变体3A至3L的突变的列表位置野生型3A3B3C3D3E3F3G3H3I3J3K3L319MT333TGGGGGG335ASSSSSS337QEEEEE339TW341QE342SPPPPT351TFFW为了产生PcuAmy1-v3变体3A至3L(即，PcuAmy1-v3A至PcuAmy1-v3L)，使用质粒pICatH-PcuAmy1-v3以及表3中示出的引物来进行融合PCR。如上所述，使用Taq高保真DNA聚合酶来进行PCR。在第一轮PCR中，使用引物PSTI_FW，以及引物3A_RV至3L-RV中的一者(对于3A至3L分别为12个单独的反应)。在第二轮PCR中，使用引物ECORV_RV，以及引物3A_FW至3L_FW中的一者(对于3A至3L同样分别为12个单独的反应)。将通过第一轮PCR和第二轮PCR获得的PCR片段在第三轮PCR(对于3A至3L为12个反应)中使用引物PSTI_FW和ECORV_RV进行融合。纯化12个PCR融合产物，用PstI和EcoRV消化，并分别连接到载体pHPLT中(Solingenetal.(2001)Extremophiles5:333-341，美国专利申请20100021587)，并转化到枯草芽孢杆菌中。在含有心浸液琼脂和10mg/L硫酸新霉素以及淀粉天青(starchazure)(Sigma)的琼脂平板上选择转化体。对于每种变体，选择一个晕圈阳性克隆体，并验证淀粉酶基因的序列。使含pHPLT-淀粉酶表达质粒的枯草芽孢杆菌转化体在含有MBD培养基(基于MOPS的限定培养基)、5mMCaCl2和10mg/L新霉素的摇瓶中进行选择性生长。基本上如本领域中已知的那样制备MBD培养基(参见，Neidhardtetal.(1974)J.Bacteriol.,119:736-747)，不同的是从所述基础培养基中去除NH4Cl2、FeSO4和CaCl2，并且使用3mMK2HPO4，而且所述基础培养基补充有60mM尿素、75g/L葡萄糖和1％大豆蛋白胨。将所述微量营养素制成100X原液，一升所述原液中含有400mgFeSO47H2O、100mgMnSO4.H2O、100mgZnSO47H2O、50mgCuCl22H2O、100mgCoCl26H2O、100mgNaMoO42H2O、100mgNa2B4O710H2O、10ml1MCaCl2，以及10ml0.5M柠檬酸钠。生长导致产生分泌的淀粉酶，针对所有12种变体(3A至3L)的所分泌淀粉酶均具有淀粉水解活性。表3.用于构建PcuAmy1变体3A至3L的DNA引物PcuAmy1-v3变体3A至3L的氨基酸序列如下示出为SEQIDNO:36-47。成熟PcuAmy1-v3A的氨基酸序列(SEQIDNO:36)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQALQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3B的氨基酸序列(SEQIDNO:37)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3C的氨基酸序列(SEQIDNO:38)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3D的氨基酸序列(SEQIDNO:39)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3E的氨基酸序列(SEQIDNO:40)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYAFILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3F的氨基酸序列(SEQIDNO:41)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQSLQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3G的氨基酸序列(SEQIDNO:42)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALESTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3H的氨基酸序列(SEQIDNO:43)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQPWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3I的氨基酸序列(SEQIDNO:44)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPTKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3J的氨基酸序列(SEQIDNO:45)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYAWILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3K的氨基酸序列(SEQIDNO:46)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v3L的氨基酸序列(SEQIDNO:47)：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK所述12种PcuAmy1变体表达于如上所述的枯草芽孢杆菌中。将来自各PcuAmy1变体培养液的40μL经过滤的上清液与100μgGG36蛋白酶在室温下一起温育6小时，随后使用MegazymeCeralpha底物测定法(MegazymeInternationalIreland,Co.Wicklow,Ireland)来分析剩余淀粉酶活性。将蛋白酶温育后的残余活性和与单独的缓冲液一起温育后的各样品的淀粉酶活性作比较。结果示于图3中。还通过SDS-PAGE(图4)，使用蛋白质标准品Plus2(Invitrogen)分析了样品的子组。包括可商购获得的淀粉酶以供比较。在与GG36蛋白酶一起温育后，PcuAmy1变体3A、3B、3C、3D和3L保持>80％的其自身酶活。在与GG36蛋白酶一起温育后，PcuAmy1变体3J和3K保持>75％的其自身酶活。PcuAmy1变体3E、3F、3G、3H和3I相较于野生型酶并未表现出稳定性的明显提高。3B、3C、3D和3L温育的样品通过SDS/PAGE进行分析，并且当与GG36蛋白酶一起温育时表现出降解产物显著减少，从而确认残余淀粉酶活性的提高是由于蛋白水解裂解减少。该小规模实验的这些结果指示：在位置T333处引入突变显著减少了对PcuAmy1的蛋白水解裂解，并且在A335、Q337和S342处的额外突变进一步减少了蛋白水解裂解。T351W突变而非T351F突变，也看似减少了对PcuAmy1的蛋白水解裂解。实施例5对单独突变和组合突变的影响的进一步分类在实施例4中描述的小规模实验的结果表明：在位置T333处的突变显著减少了对PcuAmy1的蛋白水解裂解，并且通过在A335、Q337和S342处的突变获得了进一步的有益效果。T351W突变也减少了对PcuAmy1的蛋白水解裂解。为了更好地表征这些突变对蛋白酶抗性的相对贡献，以与实施例4中所描述的方式类似的方式制备了以下额外变体：PcuAmy1-v10：ΔR177-ΔG178-E186P-T333G-Q337E-G472KPcuAmy1-v11：ΔR177-ΔG178-E186P-T333G-A335S-G472KPcuAmy1-v12：ΔR177-ΔG178-E186P-A335S-Q337E-G472KPcuAmy1-v13：ΔR177-ΔG178-E186P-T333G-A335S-Q337E-T351W-G472K变体PcuAmy1-v10、PcuAmy1-v11和PcuAmy1-v12包括在位置T333、A335和Q337处的突变的成对组合。PcuAmy1-v3-v13包括在所有前述位置处的突变并且包括额外突变T351W。在大规模洗涤剂稳定性测定法中将这些变体与实施例4中的以下变体作比较：PcuAmy1-v3B：ΔR177-ΔG178-E186P-T333G-A335S-Q337E-G472KPcuAmy1-v3L：ΔR177-ΔG178-E186P-T333G-A335S-Q337E-S342T-G472K将商购洗涤剂TotalColor(MIFAAgFrenkendorf,Switzerland)和Omo(Unilever,London,UK)在95℃下加热灭活3小时以消除现有的酶活性。使用分别用于测量蛋白酶活性和淀粉酶活性的Suc-AAPF-pNA测定法和Ceralpha测定法来测量经加热灭活的洗涤剂中的酶活性。为制备稳定性样品，向每种洗涤剂样品中添加2％w/w的蛋白酶(Prime4000L,DaniscoUSInc.)和0.5％w/w的淀粉酶并将其混合。将样品在37℃下的CO2培养箱(Sanyo)中储存14天。在不同时间点从每个反应样品取等分试样，用加入1％BSA的50mMMOPS(pH为7.15)缓冲液稀释，并使用Ceralpha底物(Megazyme,Inc)测量α-淀粉酶活性。使用经校准的标准品，并采用Arena20XT光度分析仪(ThermoScientific)测定每个样品的活性。将在每个时间点的剩余活性记录为时间零点处测定的总活性的百分比(％)。图5至图8示出了在MIFATotal(MifaAgFrenkendorf,Switzerland)和UnileverOMO(Unilever,London,UK)中进行的洗涤剂稳定性测定的结果。图5和图7分别示出了在补充有FNA蛋白酶的MIFATotal和UnileverOmo中，PcuAmy1变体随时间推移的残余活性。图6和图8汇总了3天和14天时间点的数据。包括T333突变的PcuAmy1变体(即，3B、3L、v10、v13，以及较低程度的v11)是最稳定的。不包括T333突变的变体(即v1和v12)是最不稳定的。如v10和v11所证实的那样，Q337E处突变的存在进一步改善了稳定性。实施例6PcuAmy1变体的清洁性能在微样本清洁测定中分析了经纯化的PcuAmy1-v3B和PcuAmy1-v3L的清洁性能。将其上有CFTCS-28稻米淀粉的棉布样本(CenterforTestmaterials,BV,Vlaardingen,Netherlands)打孔以形成直径为5.5mm的圆片，其中所述棉布样本含有结合至淀粉的指示染料。将两个圆片置于三个平底的非结合性96孔测定板的每一孔中。将这两种酶和两种商购淀粉酶产品：ST(来源于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶；DuPontIndustrialBiosciences,PaloAlto,California,USA)和(Novozymes,Copenhagen,Denmark)都用稀释缓冲液(50mMMOPS,pH7.2,0.005％Tween)稀释至0.5mg/mL，然后在微量滴定板中进一步稀释至2ppm。将200μL的这些样品转移到三个样本板中每一个的第一行中。然后将100μLHEPES缓冲液(25mMHEPES，pH8.0，含有2mMCaCl2和0.005％Tween-80)加入到样本板接下来五行的每一孔中，然后进行连续稀释以使最终酶浓度为2、1、0.5、0.25和0.125ppm，以及一行每孔200μL的空白孔(仅含缓冲液)中。将板在25℃下以1150rpm搅拌温育15分钟。将洗涤液体转移至新的微量滴定板中，并且通过释放到洗涤液体中的颜色量来判断酶性能。用分光光度法在488nm处对颜色释放进行定量分析，将三次读数减去空白并取平均值。结果示于图9中。PcuAmy1-v3B和PcuAmy1-v3L两者均表现出了极佳的清洁性能。实施例7PcuAmy1变体在液体洗涤剂中的热稳定性将商购洗涤剂PersilUniversalGelGold(Henkel,Düsseldorf,Germany)在95℃下加热灭活3小时，以消除现有的酶活性。在灭活后，分别使用基于Suc-AAPF-pNA底物的测定法和Ceralpha测定法(Megazyme,Wicklow,Ireland)来测量经加热灭活的洗涤剂中的酶活性，以确保已经分别消除了任何蛋白酶和淀粉酶的活性。然后用水制备10％的洗涤剂溶液。将100μL的每种酶原液(为0.5mg/mL)加入400μL的10％洗涤剂溶液中。所测试的酶为Purastar、PcuAmy1-v3B和PcuAmy-v3L。将50μL的酶原液加入PCR管中并在60℃、70℃、80℃或90℃下温育15分钟。在温育前，取出10μL并在整个实验的持续过程期间在室温下温育，以充当“非胁迫”样品。在温育后，用稀释缓冲液制备每一样品的额外1:10稀释液。然后将样品一式三份地转移到微量滴定板中，并且使用Ceralpha测定法测量所有非胁迫样品和胁迫样品中的α-淀粉酶活性。通过将热胁迫后的每种淀粉酶的活性除以非胁迫的淀粉酶的活性来计算残余活性。结果示于图10中。PcuAmy1-v3B和PcuAmy-v3L表现出与相比类似的热稳定性，以及相较于明显更好的稳定性。实施例8具有改善性能的组合PcuAmy1变体在已经产生耐受蛋白水解裂解的PcuAmy1变体后，探究使性能提高的突变的影响。组合在位置N125、F152、E186、N205、G472和G473处的突变，并与在位置R177和G178处的缺失组合(使用SEQIDNO:3进行编号)。所测试的变体在表4中示出。表4.PcuAmy1淀粉酶的组合变体成熟PcuAmy1-v1A多肽的氨基酸序列如下示出为SEQIDNO:60：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRYVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v6多肽的氨基酸序列如下示出为SEQIDNO:61：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRYVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSWKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK成熟PcuAmy1-v8多肽的氨基酸序列如下示出为SEQIDNO:62：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRYVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSWKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNRRSVSVWAK成熟PcuAmy1-v16多肽的氨基酸序列如下示出为SEQIDNO:63：ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVEVDPNNRYVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSWKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFDHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK使用在实施例6中进行的微样本测定法来测定PcuAmy1-v1、PcuAmy1-v6和PcuAmy1-v16相较于和ACE-QK的清洁性能。结果示于图12的曲线图中。PcuAmy1-v6和PcuAmy1-v16在低剂量(例如，0.1ppm的酶或更低的剂量)时的性能优于PcuAmy1-v1和使用在实施例7中描述的、进行了略微改动的测定法来测定PcuAmy1-v1、PcuAmy1-v6和PcuAmy1-v16相较于的热稳定性。结果示于图13的曲线图中。测定是在较高温度(75℃至95℃)下进行的，这是因为在使用相同的洗涤剂和酶剂量的情况下，PcuAmy1-v1、PcuAmy1-v6和PcuAmy1v16相较于其它测试分子热稳定性更强。尽管为了清楚的理解，已通过示例和实施例更详细地描述了上述组合物和方法，但对于本领域技术人员将显而易见的是，可作出某些改变和修改。因而，所述描述不应理解为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书描述。本文引用的全部出版物、专利以及专利申请特此全文以引用方式并入以用于所有目的、且达到与犹如每个单独的专利公开、专利或专利申请被特别和单独地指出以便如此以引用方式并入相同的程度。