嵌合抗原受体及制备方法与流程

文档序号:11141478阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种组合物,其包含:

(a)编码一个或多个独特的抗原结合结构域的多个第一载体;

(b)编码一个或多个独特的铰链结构域的多个第二载体;和

(c)编码一个或多个独特的膜内结构域的多个第三载体;

其中所述第一、第二和第三载体中的至少两种包括多个分别编码独特的抗原结合结构域、铰链结构域和/或膜内结构域的两种或更多种载体,并且进一步其中所述载体包含用于同源重组的位点以允许编码嵌合抗原受体(CAR)的第四载体的产生。

2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述多个第一载体编码多个独特的抗原结合结构域,所述多个第二载体编码一个铰链结构域,并且所述多个第三载体编码多个独特的膜内结构域。

3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述多个第一载体编码多个独特的抗原结合结构域,所述多个第二载体编码多个独特的铰链结构域,并且所述多个第三载体编码多个独特的膜内结构域。

4.根据权利要求1所述的组合物,其中所述多个第一载体编码多个独特的抗原结合结构域,所述多个第二载体编码多个独特的铰链结构域,并且所述多个第三载体编码一个膜内结构域。

5.根据权利要求1所述的组合物,其中所述多个第一载体编码一个抗原结合结构域,所述多个第二载体编码多个独特的铰链结构域,并且所述多个第三载体编码多个独特的膜内结构域。

6.根据权利要求1-5所述的组合物,其中所述抗原结合结构域包含scFv或由scFv组成。

7.根据权利要求1-5所述的组合物,其中所述第三载体编码跨膜结构域。

8.根据权利要求1-5所述的组合物,其中所述第二载体编码跨膜结构域。

9.根据权利要求1-8所述的组合物,其中所述组合物进一步包含编码一个或多个跨膜结构域的多个第五载体;其中所述第一载体、所述第二载体、所述第三载体、和所述第五载体包含用于同源重组的位点以产生编码嵌合抗原受体(CAR)的第四载体。

10.根据权利要求1-9所述的组合物,其中所述第一载体包含同源重组的第一序列和第二位点。

11.根据权利要求1-10所述的组合物,其中所述第二载体包含同源重组的所述第二序列和同源重组的第三序列。

12.根据权利要求1-11所述的组合物,其中所述第三载体包含同源重组的所述第三序列和同源重组的第四序列。

13.根据权利要求1-12所述的组合物,其中所述第三载体包含同源重组的所述第三序列和同源重组的第四序列。

14.根据权利要求1-13所述的组合物,其中所述第四载体包含同源重组的所述第一序列和同源重组的所述第四序列。

15.根据权利要求1-14所述的组合物,其中所述第一载体、所述第二载体、和/或所述第三载体编码转座酶。

16.根据权利要求1-15所述的组合物,其中所述转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶(SB)。

17.根据权利要求1-16所述的组合物,其中所述第一载体、所述第二载体、所述第三载体、和/或所述第五载体中的1、2、3、4、5种是睡美人(SB)或piggyBac转座子载体。

18.根据权利要求1-17所述的组合物,其中所述独特的抗原结合结构域选择性结合不同的抗原。

19.根据权利要求1-18所述的组合物,其中所述独特的抗原结合结构域选择性结合相同的抗原。

20.根据权利要求1-19所述的组合物,其中所述抗原结合结构域选择性结合CD19、通用抗原(小鼠)、HER-3、GD2、Gp75、CS1蛋白、间皮素、磷脂酰丝氨酸、cMyc、CD22、CD4、CD44v6、CD45、CD28、CD3、CD3e、CD123、CD138、CD52、CD56、CD74、CD30、Gp75、CD38、CD33、CD20、Her1/HER3融合物、GD2、碳水化合物、曲霉、ROR1、c-MET、EGFR、Dectin、埃博拉、真菌、GP、HERV-K(HERVK)、NY-ESO-1、VEGF-R2、TGF-b2R、IgG4、生物素或O-AcGD2。

21.根据权利要求1-20所述的组合物,其中所述独特的抗原结合结构域由scFv组成或包含scFv。

22.根据权利要求1-21所述的组合物,其中所述铰链区编码12AA肽(GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT,SEQ ID NO:1)、t-20AA肽、IgG4FcΔEQ、IgG4FcΔQ、(t-12AA+t-20AA)、mKate、phiLov、dsRed、Venus、eGFP、CH3HA,(CD8α+t-20AA)、双重t-20AA、(t-20AA+CD8α)、(CD8α+亮氨酸拉链Basep1)、(CD8α+亮氨酸拉链Acid1)、2D3、CD8α或IgG4Fc。

23.根据权利要求1-22所述的方法,其中所述膜内结构域中的至少一个包含CD3ζ。

24.根据权利要求1-23所述的方法,其中所述膜内结构域中的至少一个包含一个或多个ITAM结构域。

25.根据权利要求1-24所述的方法,其中所述膜内结构域中的至少一个包含(CD28+CD3ζ)、(CD28+CD27+CD3ζ)、(CD28+OX40+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+CD3ζ)、(CD28+CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+CD27+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+OX40+CD3ζ)、(4-1BB+CD3ζ)、(4-1BB+OX40+CD3ζ)、(4-1BB+CD27+CD3ζ)、(CD27+CD3ζ)、(CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+CD3ζ)、(CD28Δ+CD27+CD3ζ)、(CD28Δ+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+CD27+CD3ζ)、(4-1BB+ICOS+CD3ζ)、(CD28+ICOS+CD3ζ)、(ICOS+CD3ζ)、CD3ζ、仅CD28。

26.一种组合物,其包含编码嵌合抗原受体的载体集合,所述载体集合编码多个独特的抗原结合结构域、铰链结构域和膜内结构域,所述集合的所述载体就所述结构域而言是随机化的。

27.一种产生多个各自编码嵌合抗原受体(CAR)的载体的方法,所述方法包括:

(i)获得根据权利要求1-25中任一项所述的组合物;并且

(ii)使所述组合物经受足以允许由所述载体编码的所述独特的抗原结合结构域、铰链结构域和/或膜内结构域经由同源重组而重组的条件以产生多个第四载体,其中所述第四载体中的每个编码CAR。

28.根据权利要求27所述的方法,其中所述方法进一步包括在细胞中表达所述CAR。

29.根据权利要求27-28所述的方法,其中所述方法进一步包括测试所述CAR的活性。

30.根据权利要求27-29所述的方法,其中所述第一载体中的一个或多个编码scFv区。

31.根据权利要求27-30所述的方法,其中所述第三载体中的一个或多个编码跨膜结构域。

32.根据权利要求27-30所述的方法,其中所述第二载体中的一个或多个编码跨膜结构域。

33.根据权利要求27-32所述的方法,其中所述方法进一步包括通过重组随机合并编码跨膜结构域的第五载体与所述第一载体、第二载体、和第三载体以形成所述第四载体。

34.根据权利要求27-33所述的方法,其中从编码多个独特的scFv区和多个独特的铰链区的多个载体随机连接所述第一载体和所述第二载体。

35.根据权利要求27-34所述的方法,其中从编码多个独特的scFv区和多个独特的膜内结构域的多个载体随机连接所述第一载体和所述第三载体。

36.根据权利要求27-35所述的方法,其中从编码多个独特的铰链区和多个独特的膜内结构域的多个载体随机连接所述第二载体和所述第三载体。

37.根据权利要求27-36所述的方法,其中从编码多个独特的scFv区、多个独特的铰链区和多个独特的膜内结构域的多个载体随机连接所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体。

38.根据权利要求27-36所述的方法,其进一步包括通过随机连接来自编码多个scFv区的载体的第一文库的所述第一载体,随机连接来自编码多个scFv区的载体的第二文库的所述第二载体,并且随机连接来自编码多个膜内结构域的载体的第三文库的所述第三载体产生所述第四载体,以形成编码所述CAR的所述第四载体。

39.根据权利要求27-38所述的方法,其中所述第一载体包含同源重组的第一序列和第二位点。

40.根据权利要求27-39所述的方法,其中所述第二载体包含同源重组的所述第二序列和同源重组的第三序列。

41.根据权利要求27-40所述的方法,其中所述第三载体包含同源重组的所述第三序列和同源重组的第四序列。

42.根据权利要求27-41所述的方法,其中所述第三载体包含同源重组的所述第三序列和同源重组的第四序列。

43.根据权利要求27-42所述的方法,其中所述第四载体包含同源重组的所述第一序列和同源重组的所述第四序列。

44.根据权利要求27-43所述的方法,其中所述第一载体、所述第二载体、和/或所述第三载体编码转座酶。

45.根据权利要求27-44所述的方法,其中第六载体编码转座酶,并且其中所述方法包括将所述第四载体和所述第六载体中的一种或多种引入、电穿孔、或转染到细胞中。

46.根据权利要求45所述的方法,其中所述转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶(SB)。

47.根据权利要求27-46所述的方法,其进一步包括在存在人工抗原呈递细胞(aAPC)的情况下培养或提供用所述CAR转染的细胞,所述人工抗原呈递细胞(aAPC)能刺激表达CAR的T细胞的扩增。

48.根据权利要求27-47所述的方法,其中所述scFv区、所述铰链区、和所述膜内结构域中的每种各自在睡美人(SB)或piggyBac转座子载体中编码。

49.根据权利要求27-48所述的方法,其中从编码多个独特的scFv区、所述铰链区和膜内结构域的多个载体通过所述重组随机连接所述第一载体、所述第二载体和/或所述第三载体中的每种。

50.根据权利要求27-49所述的方法,其中所述第一载体、所述第二载体、和所述第三载体各自含有转座子;并且其中经由同源重组的所述连接包括位点特异性重组。

51.根据权利要求50所述的方法,其中所述第一载体和所述第二载体各自具有第一同源重组位点;并且其中所述第二载体和所述第三载体各自具有第二同源重组位点。

52.根据权利要求50-51所述的方法,其中所述第一载体具有第三重组位点,并且其中所述第四载体具有第四重组位点,其中所述第三重组位点和第四重组位点可以允许对细胞的同源重组。

53.根据权利要求28-52所述的方法,其中所述细胞是T细胞。

54.根据权利要求53所述的方法,其中所述T细胞是αβT细胞、γδT细胞、或NK细胞、或NKT细胞。

55.根据权利要求53所述的方法,其中所述细胞是多能细胞。

56.根据权利要求55所述的方法,其中所述多能细胞是干细胞或诱导的多能干细胞。

57.根据权利要求53所述的方法,其中所述细胞从干细胞、诱导的多能干细胞或干细胞衍生。

58.根据权利要求56-57所述的方法,其中所述细胞是从诱导的多能干细胞衍生的T细胞或NK细胞。

59.根据权利要求27-58所述的方法,其中所述独特的抗原结合结构域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或更多个选择性识别不同抗原的scFv。

60.根据权利要求27-59所述的方法,其中所述独特的抗原结合结构域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或更多个选择性识别相同抗原的scFv。

61.根据权利要求27-60所述的方法,其中所述抗原结合结构域选择性结合CD19、通用抗原(小鼠)、HER-3、GD2、Gp75、CS1蛋白、间皮素、磷脂酰丝氨酸、cMyc、CD22、CD4、CD44v6、CD45、CD28、CD3、CD3e、CD123、CD138、CD52、CD56、CD74、CD30、Gp75、CD38、CD33、CD20、Her1/HER3融合物、GD2、碳水化合物、曲霉、ROR1、c-MET、EGFR、Dectin、埃博拉、真菌、GP、HERV-K(HERVK)、NY-ESO-1、VEGF-R2、TGF-b2R、IgG4、生物素或O-AcGD2。

62.根据权利要求27-61所述的方法,其中所述抗原结合结构域包含scFv或由scFv组成。

63.根据权利要求27-62所述的方法,其中所述铰链区编码12AA肽(GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT,SEQ ID NO:1),t-20AA肽、IgG4FcΔEQ、IgG4FcΔQ、(t-12AA+t-20AA)、mKate、phiLov、dsRed、Venus、eGFP、CH3HA,(CD8α+t-20AA)、双重t-20AA、(t-20AA+CD8α)、(CD8α+亮氨酸拉链Basep1)、(CD8α+亮氨酸拉链Acid1)、2D3、CD8α或IgG4Fc。

64.根据权利要求27-63所述的方法,其中所述膜内结构域编码CD3ζ。

65.根据权利要求27-64所述的方法,其中所述膜内结构域编码一个或多个ITAM结构域。

66.根据权利要求27-65所述的方法,其中所述膜内结构域编码(CD28+CD3ζ)、(CD28+CD27+CD3ζ)、(CD28+OX40+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+CD3ζ)、(CD28+CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+CD27+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+OX40+CD3ζ)、(4-1BB+CD3ζ)、(4-1BB+OX40+CD3ζ)、(4-1BB+CD27+CD3ζ)、(CD27+CD3ζ)、(CD27+OX 40+CD3ζ)、(CD28Δ+CD3ζ)、(CD28Δ+CD27+CD3ζ)、(CD28Δ+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+CD27+CD3ζ))、(4-1BB+ICOS+CD3ζ)、(CD28+ICOS+CD3ζ)、(ICOS+CD3ζ)、CD3ζ、仅CD28。

67.根据权利要求29-66所述的方法,其中所述活性包括所述CAR选择性结合癌细胞,选择性结合病原体,选择性结合参与自身免疫性疾病的细胞或者促进T细胞的活化、T细胞的破坏、T细胞的分化、T细胞的增殖、T细胞的去分化、T细胞的移动、T细胞的细胞因子生成、或T细胞的杀伤的能力。

68.根据权利要求67所述的方法,其中所述癌细胞是卵巢癌、淋巴瘤、肾细胞癌、B细胞恶性肿瘤、CLL、B-ALL、ALL、白血病、B细胞恶性肿瘤或淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、无痛性B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、AML,宫颈癌、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、成神经细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、肺癌、骨肉瘤、胶质瘤、上皮衍生的肿瘤、前列腺癌或儿科癌症。

69.根据权利要求67所述的方法,其中所述病原体是病毒、真菌或细菌。

70.根据权利要求29-69所述的方法,其中所述测试包括单细胞成像、单细胞遗传学、单个T细胞或T细胞群体的评估;测量特异性杀伤或连续杀伤、基因表达、蛋白质表达、朝向或远离靶标的移动、增殖、活化诱导的细胞死亡、细胞因子的分泌或趋化因子的分泌。

71.根据权利要求27-70所述的方法,所述方法进一步包括基于单个CAR的特性,从所述多个载体选择所述单个CAR。

72.根据权利要求71所述的方法,其中所述方法进一步包括向受试者治疗性施用所述单个CAR。

73.根据权利要求72所述的方法,其中所述受试者是哺乳动物。

74.根据权利要求73所述的方法,其中所述哺乳动物是人。

75.一种多肽,所述多肽包含下列各项或者由下列各项组成:CAR 217(SEQ ID NO:2)、CAR 194(SEQ ID NO:3)、CAR 212(SEQ ID NO:4)、CAR 213(SEQ ID NO:5)、CAR 265(SEQ ID NO:6)、CAR214(SEQ ID NO:56)、CAR 215(SEQ ID NO:57)、CAR 216(SEQ ID NO:58)、CAR 218(SEQ ID NO:59)、CAR 193(SEQ ID NO:55)或CAR 268(SEQ ID NO:7)。

76.一种经转化的T细胞,其表达根据权利要求75所述的多肽。

77.根据权利要求76所述的经转化的细胞,其中所述细胞是永生化细胞。

78.根据权利要求76所述的T细胞,其中所述T细胞是αβT细胞、γδT细胞、NK细胞、NKT细胞、干细胞、从干细胞衍生的细胞,包括免疫系统的细胞。

79.一种药物制剂,所述药物制剂包含根据权利要求76-78中任一项所述的经转化的T细胞。

80.一种核酸,所述核酸编码包含下列各项或由下列各项组成的嵌合抗原受体:CAR 217(SEQ ID NO:2)、CAR 194(SEQ ID NO:3)、CAR 212(SEQ ID NO:4)、CAR 213(SEQ ID NO:5)、CAR 265(SEQ ID NO:6)、CAR 214(SEQ ID NO:56)、CAR 215(SEQ ID NO:57)、CAR 216(SEQ ID NO:58)、CAR 218(SEQ ID NO:59)、CAR 193(SEQ ID NO:55)或CAR 268(SEQ ID NO:7)。

81.根据权利要求80所述的核酸,其中所述核酸被包含在T细胞中。

82.根据权利要求81所述的核酸,其中所述T细胞是αβT细胞、γδT细胞、NK细胞、NKT细胞、干细胞、或从多能细胞衍生的T细胞。

83.根据权利要求81所述的核酸,其中所述T细胞被包含在药学上可接受的载体或赋形剂中。

84.一种组合物,其包含不同CAR编码载体的文库,所述文库的载体就独特的抗原结合结构域、铰链结构域和/或膜内结构域而言是随机化的。

85.根据权利要求84所述的组合物,其中所述文库就独特的抗原结合结构域、铰链结构域和膜内结构域而言随机化。

86.根据权利要求84所述的组合物,其中所述文库就独特的抗原结合结构域和膜内结构域而言随机化。

87.根据权利要求84所述的组合物,其中所述文库就独特的抗原结合结构域和铰链结构域而言随机化。

88.根据权利要求84所述的组合物,其中所述文库就独特的抗原铰链结构域和膜内结构域而言随机化。

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