抗A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用的制作方法

本发明属于单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种抗A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。

背景技术：

流脑，是流行性脑脊髓膜炎(Epidemic cerebrospinal meningitis)的简称，是由脑膜炎奈瑟菌引起的对人类危害极大的呼吸道传染性疾病，全年龄段人群均可发病，但患者多见于儿童，细菌感染起自鼻咽部，随之浸入血液循环，终止于脑膜或身体其他部位而产生炎性损害。

奈瑟氏脑膜炎球菌(N.meningitidis)是流脑的病原菌，其抗原成分主要包括荚膜多糖、外膜蛋白、脂多糖，这些抗原物质也是流脑血清学分群、分型的基础，其中荚膜多糖为特异性抗原，很据其抗原性的不同将脑膜炎球菌分为A、B、C、D、X、Y、Z、29E、W135、H、I、K、L13个血清群。A群和C群是引起该疾病流行最常见的菌株，占流行病例的90％以上。虽然近年来我国B、C群流行有上升趋势，但长期以来我国流行菌株一直是A群占主导地位。

流脑的流行性爆发具有明显的季节性，以冬春季节发病较多；同时具有地区分布性，一般在发达国家(欧洲、北美洲等)发病率较低，在发展中国家(非洲、亚洲)发病率相对较高，；此外流脑的流行存在菌群变迁和菌型漂移现象，主要表现在传统地域菌群分布的改变，比如非洲一直以A群流行为主，70年代在脑膜炎流行带相继报告了C群流行，80年代又报道了W135和Y菌群的流行。 而在我国，流脑流行主要以A群为主，2000年以来C群流行逐渐蔓延，B、Y、W135有散发病例报告，近20年来有B群检出增多的迹象，说明我国人群中可能B群携带率开始升高，由此看来，流脑的流行具有交替流行，多菌群同时流行的趋势。中国为流脑高发地区，先后出现过5次流行性爆发，1938年、1949年、1959年、1967年、1977年，主要为A群。近三十年来，我国流行菌株仍是A群，但近年来某些地区B群和C群仍有散在地上升趋势。由此看来，对流脑的分型进行监测尤为重要，有利于流行病学的调查，实时掌握各个地区的流脑流行趋势，并及时制定相应的预防措施，防治疾病的爆发。

1913年Flexner运用血清疗法来治疗脑膜炎球菌病，到1937年，又引入了磺胺类抗生素治疗该病，随着脑膜炎球菌对磺胺类药物耐药性的产生，20世纪六十年代，第一支针对脑膜炎球菌的疫苗应运而生。而在我国，1983年卫生部制定以疫苗预防为主的综合措施后，在全国实施A群脑膜炎球菌多糖疫苗接种，自此以后我国流脑发病率逐年下降。

目前国内外上市的疫苗有A、C、Y和W135群单价或多价的多糖疫苗、多糖-蛋白结合疫苗，流脑疫苗的中各组分多糖的含量的测定直接影响到疫苗质量控制和工艺开发，2015版规定用磷含量法检测A群脑膜奈瑟球菌多糖含量，但该方法，检测过程繁琐，时间长，需要使用强酸等有机试剂,且易受检测器皿清洗后磷残留的影响等，同时检测的灵敏度较低。基于此类缺点，云南省沃森生物技术股份有限公司应用火箭免疫电泳的方法来检测流脑疫苗中各组分多糖的含量，该方法相对快速、灵敏度高，但该方法需要人为测量免疫峰的高度来测算含量，易受人为测量的影响。因此，运用免疫学原理，建立一种快速可靠、特异性高、敏感性强的检测疫苗中多糖含量的方法成为近年来研究的热点，也是 研究的重点。

申请号为201510161178.9的中国专利申请公开了一种脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体及其应用，分别提供了针对脑膜炎球菌A、C、Y和W135群多糖特异性的小鼠单克隆抗体，通过免疫小鼠和制备杂交瘤细胞获得。虽然该发明提供的各型流脑多糖特异的单克隆抗体与其它型荚膜多糖无明显交叉反应。由于脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗在制备过程中，存在空间屏蔽效应的可能，使得多糖的一些抗原表位被蛋白质所屏蔽；另外，多糖与蛋白结合后甚至产生新的抗原表位，故该专利提供的单抗对多糖结合疫苗中的特异性和准确检测多糖含量的能力有待验证。

目前国内外上市的疫苗有A、C、Y和W135群单价或多价的多糖疫苗、多糖-蛋白结合疫苗，多糖-蛋白结合疫苗主要有A群、C群、AC群和ACYW135群。如何仅采用一种抗体就能准确识别、定量检测A群、AC群和ACYW135群多糖蛋白结合疫苗中A群脑膜炎球菌荚膜多糖的问题亟待解决。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种抗A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。本发明提供的杂交瘤细胞株经传代稳定性实验证明，能稳定地、特异地分泌针对A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖结合物的单克隆抗体。

本发明的技术方案如下：一种分泌抗A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株WV-A-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述杂交瘤细胞保藏编号：CCTCC NO:C2015229，保藏时间： 2015年12月17日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。

本发明还提供一种抗A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株WV-A-01分泌。

所述单克隆抗体由A群脑膜炎球菌多糖结合物免疫小鼠后获得。

所述A群脑膜炎球菌多糖结合物的载体为破伤风类毒素、白喉类毒素或白喉无毒变异体蛋白(CRM197)。

所述单克隆抗体制备过程采用ELISA间接竞争法筛选，采用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化。

本发明还提供所述单克隆抗体在检测A群脑膜炎球菌荚膜多糖含量中的应用。本发明提供的单克隆抗体适用于A群脑膜炎球菌结合疫苗和含A群的脑膜炎球菌多价结合疫苗中A群荚膜多糖的检测，且不会出现多糖与载体蛋白结合后，或因载体改变而无法特异性识别的情况。

所述A群脑膜炎球菌荚膜多糖来源于A群脑膜炎球菌多糖疫苗、AC群脑膜炎球菌多糖疫苗或ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗。

所述应用检测过程采用间接竞争ELISA方法，该方法准确、快速、特异、灵敏。用该单抗建立间接竞争ELISA方法，与夹心ELISA相比，检测灵敏度和准确性无显著差异，但竞争法只需要有一个抗原表位的单抗即可以进行，而夹心法要求至少有两个表位的抗原才能结合单抗。

本发明还提供含有所述单克隆抗体的检测试剂盒。

由于在制备A群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及多价结合疫苗过程中，荚膜多糖的表面位点容易被覆盖，且A群脑膜炎球菌荚膜多糖与不同载体蛋白结合时以及制备含有A群荚膜多糖的多价蛋白结合疫苗时，被覆盖的抗原 表面会点可能不同；此时若采用现有的单克隆抗体检测A群结合疫苗或多价结合疫苗中A群脑膜炎球菌荚膜多糖的含量时，特异性识别较差，容易出现不能准确定量检测的情况。若针对每种现有结合疫苗都制备各自的单克隆抗体，操作繁琐、工作量较大，因此制备出一种通用的单克隆抗体具有重要的意义。本发明难点在于筛选的杂交瘤细胞株既要与A群多糖反应又要与多种A群多糖蛋白结合物反应，筛选难度较大。

本发明筛选并保藏了一株能稳定分泌A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖的特异性抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株经传代稳定性实验证明，能稳定地、特异地分泌针对A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖的单克隆抗体，该细胞株通过接种小鼠腹腔，制备得到的腹水型单抗，用蛋白A亲和层析法纯化后，纯度高，抗体滴度高，符合后续实验要求，本发明运用该单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法，特异性强、灵敏度高，重复性好。所述单克隆抗体特异性地识别与结合了破伤风类毒素或白喉毒素无毒变异体等蛋白载体的A群脑膜炎球菌多糖，不会因为结合疫苗中蛋白的屏蔽效应而造成无法特异性识别的情况，与C、Y、W135群多糖以及破伤风类毒素载体、白喉毒素无毒变异体载体均不发生交叉反应；检测灵敏度可达纳克级，提高了检测的灵敏度，且操作简单，特异性强。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、与传统的磷含量法相比，避免了测试器皿清洗剂中含磷成分对实验造成的影响，以及试验过程中强酸强碱的使用带来的危险因素，检测过程更为简便、直观；

2、与火箭免疫电泳法相比，本技术为定量检测技术，避免了在测量峰高时，人为因素造成的偏差；

3、应用本单抗进行A群多糖的含量检测的灵敏度与传统的磷含量测定法和火箭免疫电泳法相比，精确度可以达到纳克级，具有操作简单，特异性强，高通量的特点；

4、与普通单克隆抗体相比，可特异性识别包括以白喉毒素突变体和破伤风类毒素为载体的A群结合物和A群流脑多糖，特异性高、通用性强，适用范围广；

5、本发明可用于流脑A群血清型分型诊断以及流脑多价多糖疫苗和结合疫苗研发过程中A群多糖的定量检测，具有相当可观的实用价值，为流脑疫苗质量控制和流行病学调查及防控奠定基础。

附图说明

图1为杂交瘤细胞亚克隆培养第3天的图片；

图2为杂交瘤细胞亚克隆培养第5天的图片；

图3为单克隆抗体纯化图，图中从左往右，L1开始上样，Cchuan1～Fchuan为穿透峰；C2～F为所需单抗峰；

图4为单克隆抗体的SDS-PAGE电泳电泳图，图中从左到右分别为：Marker、纯化前单抗、纯化后单抗；

图5为A群脑膜炎球菌单抗采用间接ELASA方法测定多糖含量的标准曲线图；

图6为免疫双扩法测定所述单克隆抗体的特异性结果图，图中1为A群脑膜炎球菌多糖，2为C群脑膜炎球菌多糖，3为Y群脑膜炎球菌多糖，4为W135群脑膜炎球菌多糖，5为破伤风类毒素，6为白喉毒素无毒变异体。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1：抗A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株WV-A-01的建立

本实施例中涉及疫苗及多糖除特殊说明外可按照中华人民共和国药典2015版三部制备或市售获得。

1.1抗原的来源

1.1.1A群脑膜炎球菌白喉类毒素无毒变异体多糖结合物原液(批号MenAps-CRM₁₉₇20140201),由云南沃森生物技术股份有限公司技术中心提供；

1.2小鼠的来源

雌性，6～8周龄BALB/c鼠，SPF级(无特定病原体Specific pathogen Free,SPF)，15～20g，购自广东省医学实验动物中心(许可证号SCXK(粤)20130002)。

1.3骨髓瘤细胞的来源和维持培养

骨髓瘤细胞SP2/0，购自中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库(KCB92021YJ)

1.4杂交瘤细胞株的制备

采用体内免疫方式和聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)融合方法制备单克隆细胞。

1.4.1动物的免疫及血清效价的测定

选取3只6～8周龄雌性BALB/c鼠，SPF级，免疫方法按常规的腹腔注射 的方法进行(见表1-4-1)，初免取等量A群奈瑟氏脑膜炎球菌(载体为白喉毒素无毒变异体)多糖结合疫苗原液(批号：MenAps-CRM₁₉₇20140201)与弗氏完全佐剂充分混合，腹腔注射，0.1ml/只；二免为2周后取抗原与弗氏不完全佐剂充分混合，腹腔注射，0.1ml/只；三免与二免相同；三免后7天小鼠尾部取血，用间接ELISA测效价，加强免疫，直接腹腔注射A群脑膜炎球菌菌液每只0.1ml，3d后处死小鼠取脾。

表1-4-1 BALB/c小鼠免疫程序

1.4.2细胞融合和培养

1.4.2.1饲养细胞的制备

用小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，于融合前一天制备。具体操作如下：选取健康的BALB/c小鼠，摘眼球放血处死，浸泡于75％的酒精中5-10分钟，手 提住小鼠尾巴，置于超净台无菌平皿中。用镊子提起小鼠腹部，用无菌剪沿两侧剪开皮肤，充分暴露腹部。用酒精擦拭消毒后，用注射器取5mlRPMI培养基注入小鼠腹腔，且注射器在腹腔内反复抽吸数次后，吸出腹腔内液体(内含巨噬细胞)，注入离心管内，1000r/min，离心10min，弃上清。用5mlHAT培养基(H—Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T——Thymidine胸腺嘧啶核苷)悬浮细胞，计数，调整细胞浓度为2×10⁵/mL。将细胞悬液加入96孔培养板，每孔0.1ml，37℃，5％C0₂培养箱中培养。

1.4.2.2骨髓瘤细胞的培养

在融合前2周复苏骨髓瘤SP2/0细胞。从液氮罐取出细胞后迅速在37℃水浴中解冻，1500r/min离心8min，弃上清后用含20％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，次日换液，连续培养3天待骨髓瘤细胞的活性恢复后，扩大培养。用6个装有5ml培养基的培养瓶，接种骨髓瘤细胞，1周后再次接种,使细胞处于对数生长期。融合前12h换液一次。融合当天，将细胞从瓶壁上轻轻吹下，收集于50ml离心管内，1000r/min离心5-10min，弃上清，加入30ml培养基，同法离心一次，然后重悬于10ml无血清的RPMI1640培养基中。加0.4％台酚蓝染液进行活细胞计数，计数结果约4×10⁷个/ml。

1.4.2.3脾淋巴细胞的制备

取抗血清效价最高的小鼠，摘眼球放血处死，75％的乙醇消毒5-10分钟，于无菌超净工作台上开腹取脾，置于盛有5ml培养基的平皿中，轻轻洗涤，并剥去周围结缔组织。置于200目筛网上研磨，加入培养基冲洗过滤，使脾脏细胞充分洗出来，1500r/min离心5min，弃上清，用培养基重新悬浮，进行活细胞计数。

1.4.2.4细胞融合

将分离的脾细胞于处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0以(5-10):1的比例混合于50ml的离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，轻击管底，打散沉淀的细胞，置37℃水浴中预热，缓慢加入1mlPEG4000融合两种细胞，待融合完成后，加入15mlRPMI-1640培养基终止融合，静置10min，1000r/min离心10min，弃上清，1％HAT和20％(体积比)胎牛血清的RPMI1640改良型培养基重悬细胞融合物。将细胞悬液按150μl/孔分配到96孔饲养细胞板中，置于37℃,5％CO₂培养箱中培养。5d后用含1％HAT的培养基半换液；10d后用1％HT(H—Hypoxanthine次黄嘌呤，T——Thymidine胸腺嘧啶核苷)的培养基换出HAT。待培养至细胞覆盖孔底时，吸取细胞上清进行抗体检测。

1.5杂交瘤细胞株的筛选、克隆

1.5.1间接酶联免疫吸附(ELISA)实验操作

用包被液将A群脑膜炎球菌多糖(批号：A201301001)稀释为2μg/mL，100μl/孔，4℃过夜包被96孔酶标板，次日用PBST洗涤液200μl/孔洗板3次，拍干；用5％的脱脂奶封闭，200μl/孔，37℃温箱，封闭1h，洗板5次，拍干；取细胞培养上清加入板内，每孔100μl，37℃温箱，孵育1h，洗板5次，拍干；加入用0.01mol/L的pH 7.4PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗(1:10000)，100μl/孔，37℃温育1h，洗板5次，拍干；然后加入显色液，每孔100μl，避光显色10min，每孔加入终止液100μl，测定A450值。

1.5.2杂交瘤细胞株的筛选

初筛，用A群脑膜炎球菌多糖(批号：A201301001)包被酶标板，按1.5.1的间接ELISA方法，对细胞培养上清进行检测，标出阳性孔，对所有克隆细胞 进行换液，两天后再检测一次，SP2/0培养上清作阴性对照，检测值/阴性值>2.1的孔判为阳性孔，两次检测值都为阳性的孔筛选出来，再分别用C(批号：C201304005)、Y(批号：Y201308014)、W135(批号：W₁₃₅201304004)群脑膜炎球菌多糖，包被酶标板，进行阳性孔特异性筛查，将只跟A多糖反应而不跟流脑其他菌群反应的特异性阳性孔筛选出来后，进行后续的再克隆和亚克隆。在克隆过程中，再用上述A群脑膜炎球菌多糖，A群多糖蛋白(破伤风类毒素)结合物(批号：20140801)，A群多糖蛋白(白喉毒素无毒变异体)结合物(批号：MenAps-CRM₁₉₇20140201)、破伤风类毒素(TT20121006)、白喉毒素无毒变异体(20140101)，进行筛选。

8块96孔板进行初筛，共筛选了62个阳性孔，见表1-5-2-1；对这62个孔挑选出OD值相对较高的27个孔，转移到24孔板中培养，进行第二步特异性筛查，最后筛选出2株与A群脑膜炎球菌多糖反应而不与流脑其它菌群多糖反应的杂交瘤细胞，分别命名为1B6，1D5。将这2株细胞进行克隆培养，3～4次克隆化后，整块板都为单细胞阳性孔，也就是阳性率达100％。即获得3株杂交瘤细胞株。分别用A群脑膜炎球菌多糖、A群脑膜炎球菌多糖蛋白(破伤风类毒素)结合物、破伤风类毒素、A群脑膜炎球菌多糖蛋白(白喉毒素变异体)结合物、对该三株细胞进行检测，见表1-5-2-2，结果发现1B6与A群多糖反应，与A群多糖破伤风类毒素载体结合物以及白喉毒素变异体载体结合物、破伤风类毒素、白喉毒素变异体均不反应，该株杂交瘤细胞虽然能特异性与A群多糖结合，但不能与A群多糖蛋白(破伤风类毒、白喉毒素变异体结合物反应，可能是因为蛋白载体与A群流脑多糖结合的结合物遮盖了抗原上能与单抗结合的位点，使得该单抗不能与之结合，阻碍其应用；1D5除了能与A群多糖结合外，还与A 群多糖破伤风载体结合物和A群多糖白喉毒素变异体载体结合物反应，且不与破伤风类毒素核白喉毒素变异体反应，因此，该单抗符合本发明要求，将其命名为WV-A-01。

表1-5-2-1初检62个阳性孔的OD₄₅₀值

表1-5-2-2杂交瘤细胞特异性筛查(间接ELASA)

1.5.3杂交瘤细胞克隆

采用有限稀释法对1.5.2筛选的阳性细胞孔进行3-4次克隆化，每次克隆后7天采用1.5.1所述的间接ELISA法检测克隆板内的细胞上清抗体，直到阳性率为100％，检测抗体，获得1株效价为1:5120的细胞株，从而建立了一株抗A群奈瑟氏脑膜炎球菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为WV-A-01。

1.6杂交瘤细胞的冻存和复苏

杂交瘤细胞的冻存：待细胞长满培养瓶底80％-90％时，将细胞吹打至全部悬浮起来，1500r/min，离心5min，弃上清，以细胞冻存液(30％胎牛血清、60％不完全RPMI1640培养液、10％DMSO)重悬细胞，调整其浓度为5×10⁶～1×10⁷ 个/mL，分装到冻存管内，1mL/管，置4℃1h后转移到-20℃放置1h，然后置-80℃1h，再转入液氮罐口悬挂过夜，最后侵入液氮内长期保存。

杂交瘤细胞的复苏：从液氮罐取出冻存管，立刻放入37℃水浴中迅速融化，1000r/min离心5min，弃上清，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，转入培养瓶，37℃，5％CO2培养箱中培养，次日还液，继续培养。

1.7杂交瘤细胞传代过程中分泌抗体的稳定性测定

将杂交瘤细胞按每2-3天传一代，连续传代培养20代，用1.5.1的间接ELISA法分别检测3、5、10、15、20代细胞培养上清效价，每个浓度做4个重复，从而评价杂交瘤细胞在传代过程中分泌抗体的稳定性，根据表1-7可得出结论，该杂交瘤细胞在传代过程中效价稳定在1:5120，说明该杂交瘤细胞能稳定分泌抗体。

表1-7杂交瘤细胞传代培养上清A450值

1.8单克隆抗体亚类鉴别

单克隆抗体IgG类/亚类鉴定试剂盒(购自赛尔维公司)，采用酶联免疫吸附法进行，实验结果见表1-8，本发明单克隆抗体属于IgG1类。

表1-8单抗IgG亚类检测A450值

实施例2：单克隆抗体(小鼠腹水)的制备

2.1小鼠预处理

取8周-10周的BALB/c小鼠3只，注射灭菌液体石蜡，0.5ml/只，7d后用于接种杂交瘤细胞。

2.2杂交瘤细胞的复苏，亚克隆和扩大培养

复苏按1.6的方法进行，培养过程中注意观察细胞数量及形态，亚克隆按有限稀释法进行，亚克隆检测结果见表2-2，根据表可知，复苏后经亚克隆的细胞阳性率为100％，结合显微镜下观察，挑选细胞形态较好的进行扩大培养(见图1、图2)。

2.3小鼠接种杂交瘤细胞

待细胞长满板底80％～90％时将细胞吹打下来，1200r/min离心5min，弃上清，用RPMI-1640培养基悬浮细胞，计数，调整细胞数为5×10⁵～l×10⁶个/mL，腹腔注射一周前预处理过的小鼠，0.5ml/只。注意每天观察小鼠的生长状态，约7-10天后，小鼠腹部明显膨大时，用注射器抽取腹水，间隔1～2天可继续抽取，直至小鼠死亡。

2.4单克隆抗体的分离

每次抽取的腹水1200r/min离心5min，取上清，分装，-20℃保存，即为WV-A-01细胞株产生的本发明所述单克隆抗体。

实施例3：单克隆抗体的纯化

3.1应用Protein A-Sepharose CL-4B(填料)亲和层析法纯化单克隆抗体，AKTA explorer100(蛋白纯化系统)进行监测，纯化色谱见图3，具体操作如下:

3.1.1装柱：将1.5gProtein A-Sepharose CL-4B干粉用6-7ml蒸馏水溶解，再用0.02M，pH7.4的磷酸盐缓冲液侵泡15min，然后装入层析柱中。

3.1.2平衡:用10倍柱床体积的上样缓冲液过柱，流速为1ml/min，pH试纸测试流出液体的pH为7.4。

3.1.3上样：取预处理过的腹水5ml，用上样缓冲液稀释至50ml，用0.45μm的滤膜过滤，上样，流速为1ml/min。

3.1.4洗脱：用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1ml/min。随后用0.02M，pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，同时应用AKTAexplorer100进行监测分离纯化色谱图(图3)，当观察到基线开始上升即出现洗脱峰时，收集洗脱峰。

3.1.5平衡收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡5-10倍柱床体积，流速调至1ml/min，再用蒸馏水平衡10倍柱床体积。

3.2.1抗体蛋白检测——SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测纯度

配制SDS-PAGE凝胶浓缩胶浓度4.5％，pH8.8，分离胶浓度为12.5％，pH6.8。组装好电泳板后，将配好的分离胶转入板中，立刻加无水乙醇压胶，待分离胶 固定后，用滤纸轻轻吸取表面乙醇，加入浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后，放入电泳槽，慢慢拔出梳子。检测样品稀释后和上样缓冲液等体积混合，于沸水中煮10min。以90-120V电压进行电泳，约2h溴酚蓝到达分离胶底部时结束电泳将胶取出，用银染法染色。结果见图4，根据该图可知，纯化后单克隆抗体纯度很好，用凝胶成像系统分析纯度＞99％，两条条带分别为重链50Ku，轻链25Ku，分子量大小与BALB/c小鼠IgG的重链和轻链的理论值相一致。

3.2.2单抗效价检测

用间接ELISA法检测单抗效价，结果见表3-2-2，效价为1:25600。

表3-2-2单克隆抗体效价

实施例4：间接竞争ELISA方法建立

A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖：由云南沃森生物技术股份有限公司技术中心按照《中华人民共和国药典》三部要求制备A群脑膜炎球菌多糖，通过药典通则 3103磷含量测定法测定多糖含量后作为内部参比品。

4.1主要溶液的配置

包被缓冲液(0.1mol/L，pH9.6的盐酸盐缓冲液)：Na2CO3·10H2O 0.86g；NaHCO3 0.586g；加灭菌水至200mL。

稀释液(0.01mol/L，pH7.4的PBS缓冲液)：NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O2.9g；KH2PO4 0.2g；加灭菌水至100mL。

洗涤液(0.01mol/L，pH7.4的PBST)：1PBS缓冲液000mL；Tween-20 0.5mL。

封闭液(5％脱脂奶粉PBS稀释液)：1g脱脂奶粉；20mLPBS稀释液。

显色液：底物液10mL；TMB 0.5mL；H2O2 32μl。

终止液(2mol/L H2SO4)：浓硫酸(18mol/L 98％)22.2mL；灭菌水177.8mL4.2竞争ELISA方法的建立及标准曲线的绘制

根据4.1中筛选的各组条件，按如下步骤建立竞争ELISA方法。

包被：A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖2μg/ml，每孔100μl，4℃过夜，进行抗原包被；

洗板：洗板机洗板三次，拍干；

封闭：5％脱脂奶粉封闭，每孔200μl，37℃，1h；洗板同上；

竞争：用PBS将A群多糖参比品2倍稀释为：1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.1563μg/ml、0.0781μg/ml、0.0391μg/ml、0.0195μg/ml、0.0098μg/ml，单抗以1:1600稀释，50μl：50μl的体积比加入到已封闭好的板内，轻轻摇晃混匀，37℃，竞争1h；洗板同上；

显色：每孔100μl显色液，室温避光显色10min；

终止：待显色完成，每孔100μl终止液终止反应；

读数：酶标仪450nm读取各孔OD值。

以A群多糖标准品浓度的对数为横坐标，以抑制率为纵坐标，进行Log-Logit回归，绘制标准曲线。见图5，以A群脑膜炎多糖多糖标准品浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标进行Log-logit回归分析，绘制标准曲线，y＝-1.6648-2.2542x,R²＝0.9895,该间接竞争ELISA方法的线性范围0.022-1.2007ug/ml,检测下限为0.0228μg/ml，IC50为0.1658μg/ml。本发明方法检测灵敏度为22.8ng/ml，而《中国药典》2015版对A群多糖检测的磷含量法检测限为微克级，且在检测过程中，检测结果不受容器清洗时残留磷的影响，因此本发明方法明显优于磷含量法。

4.3单抗特异性在竞争ELASA中应用的验证

4.3.1交叉反应试验

将A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖以及破伤风类毒素和白喉毒素无毒变异体用PBS稀释到5μg/ml，每个浓度做5个重复，同时设置阴性和阳性对照，按1.5.1操作步骤进行，在酶标仪中检测450nm处的OD值，结果见表4-3。从表可以得出结论：该单抗特异性好，与A群多糖的竞争结合反应率为100％，而不与流脑其它群多糖发反应。

表4-3单抗间接ELISA特异性反应试验

4.3.2琼脂糖双向免疫扩散实验

琼脂糖免疫双扩实验中，梅花孔中央加入本实验制备的A群奈瑟氏脑膜炎球菌单抗，周围孔分别加入A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌多糖以及破伤风类毒素、白喉毒素无毒变异体载体，实验结果见图6，结果显示，该单抗只与A群脑膜炎球菌多糖发生反应，与其他群脑膜炎球菌多糖和破伤风类毒素、白喉毒素无毒变异体均不发生反应，表明该单抗特异性好。

实施例5：单抗在流脑多价疫苗、流脑结合疫苗中间接竞争ELASA方法定量检测的应用

5.1不同批号多糖抗原包被适用性实验

按照4.2中建立的竞争ELISA方法操作，取3个批次A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖精糖(载体为CRM197，批号：MenA201301001、MenA201303003、 MenA201304004)分别包被酶标板，随机抽取5支ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗(载体为CRM197，批号：FPPV14112203，A群多糖含量：57.8ug/支)，每个样品做三个重复，最后结果求取平均值。见表5-1。用SPSS17.0软件进行单样本t检验统计学分析，双侧，T＝-0.4484时，P＞0.05，无统计学差异，表明检测值与疫苗原标示量(57.8ug/剂)无显著差异。变异系数(CV)在2.96％～4.15％，按上述条件建立的检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗中A多糖含量的间接竞争ELISA精确度、稳定性好，重复性佳。

表5-1不同批号A多糖抗原包被酶标板测定同一批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗中A群多糖含量(μg/剂)

*表中数值为每个样品做3个重复后求取的平均值

5.2不同批号疫苗检测的适用性研究实验

根据建立的竞争ELISA方法操作，取A群脑膜炎球菌多糖精糖(批号：MenA201301001)包被酶标板，取三批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗(批号：201305012，A群多糖含量：62.5ug/支；批号：201305013，A群多糖含量：54.3ug/支；批号：201305014，A群多糖含量：61.9ug/支)，每个样品做三个重复，最后结果求取平均值。见表5-2。用SPSS17.0软件进行单样本t检验统计学分析， 双侧，分别求得T值、P值，置信区间见表3-12，P值均＞0.05，无统计学差异，表明检测值与疫苗原标示含量无显著差异，批间变异系数小，且检测值均在置信区间范围。显示按上述条件建立的检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗中A多糖含量的间接竞争ELISA，精确度、稳定性好，重复性佳。

表5-2不同批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗中A群多糖含量(μg/剂)

表5-2不同批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗中A群多糖含量(μg/剂)

*表中数值为每个样品做3个重复后求取的平均值

5.3单抗在间接竞争ELISA应用中对不同批号ACYW135脑膜炎球菌多糖结合疫苗检测的适用性研究实验

根据建立的竞争ELISA方法操作，取A群脑膜炎球菌多糖精糖(批号： MenA201301001)包被酶标板，再取三批ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(批号分别为：20120504，A多糖含量6.2μg/0.5ml；20120504，A多糖含量6.6μg/0.5ml；20120506，A多糖含量6.4μg/0.5ml)，每批随机取5支，每支样品做三个重复，最后结果求取平均值。用SPSS17.0软件进行单样本t检验统计学分析，双侧，分别求得T值、P值，置信区间见表5-3，P值均＞0.05，无统计学差异，表明检测值与疫苗原标示含量无显著差异，批间变异系数小，且检测值均在置信区间范围。显示按上述条件建立的检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中A多糖含量的间接竞争ELISA，精确度高、稳定性好。

表5-3不同批ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中A群多糖含量(ìg/0.5ml)

*表中数值为每个样品做3个重复后求取的平均值

5.4单抗在间接竞争ELISA应用中对不同批号A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗检测的适用性研究实验

根据建立的竞争ELISA方法操作，取A群脑膜炎球菌多糖精糖(CRM197,批号：MenA201301001)包被酶标板，再取三批A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(批号分别为：20120401，A多糖含量114.8μg/ml；20120402，A多糖含量151.5μg/ml；20120403，A多糖含量155.1μg/ml)，每批随机取5支，每支样品做三个重复，最后结果求取平均值。用SPSS17.0软件进行单样本t检验统计学分析，双侧，分别求得T值、P值，置信区间见表5-4，P值均＞0.05，无统计学差异，表明检测值与疫苗原标示含量无显著差异，批间变异系数小，且检测值均在置信区间范围。显示按上述条件建立的检测A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中A多糖含量的间接竞争ELISA，精确度高、稳定性好。

表5-4不同批A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中A群多糖含量(ìg/ml)

*表中数值为每个样品做3个重复后求取的平均值

5.5单抗在间接竞争ELISA应用中对不同批号AC群脑膜炎球菌多糖结合疫苗检测的适用性研究实验

由于不同的载体蛋白与A群荚膜多糖形成的空间构象不同，形成的抗原位点不同，且覆盖的抗原位点也不同，故需验证所述单抗是否能有效检测其他蛋白作为载体的结合物中多糖的含量。

根据建立的竞争ELISA方法操作，取AC群脑膜炎球菌多糖精糖(载体为破伤风类毒素，批号：MenA201301001)包被酶标板，再取三批AC群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(批号分别为：201401001，A群多糖含量11.6ìg/0.5ml；201401002，A群多糖含量11.6ìg/0.5ml；201402004，A群多糖含量10.2ìg/0.5ml)，每批随机取5支，每支样品做三个重复，最后结果求取平均值。用SPSS17.0软件进行单样本t检验统计学分析，双侧，分别求得T值、P值，置信区间见表5-5，P值均＞0.05，无统计学差异，表明检测值与疫苗原标示含量无显著差异，批间变异系数小，且检测值均在置信区间范围。显示按上述条件建立的检测AC群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中A多糖含量的间接竞争ELISA，精确度高、稳定性好。

表5-4不同批AC群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中A群多糖含量(ìg/0.5ml)

*表中数值为每个样品做3个重复后求取的平均值

综上所述，应用本发明杂交瘤细胞株WV-A-01(其保藏号为CCTCC C2015229)制备获得的这株A群流脑单克隆抗体在进行间接竞争酶联免疫检测方法定量检测时，能特异性的识别A群流脑多糖疫苗、A群流脑多糖结合物(破伤风类毒素)、A群流脑多糖结合物(白喉毒素变异体)等疫苗中A群流脑多糖的含量，检测灵敏度可达纳克级。同时，与C、Y、W135群流脑多糖不发生交叉反应。可用于偶联疫苗研制过程中的质量控制。