一种花椰菜花球花梗长度的分子标记辅助选择方法与流程

本发明属于蔬菜分子育种技术领域，尤其涉及利用分子标记对花椰菜花梗长度性状进行辅助选择的方法。

背景技术：

松散花球型花椰菜（简称松花菜）是近年来迅速发展起来的一种花椰菜新类型，由于其口感脆嫩、易入味等优点，广受我国消费者青睐。据不完全统计，目前松花菜在我国的栽培面积与普通花椰菜相当，约在300万亩左右。松花菜与普通花椰菜最显著的差异在于其松大的花球，而花球花梗长度则是花球松大的重要因素（附图1）。因此，花球花梗长度是松花菜商品性的决定因素之一，其遗传改良是花椰菜遗传育种的重要课题之一。

目前，花椰菜花梗长度的遗传改良主要通过表型选择来完成，该方法必须在花椰菜花球成熟期才能完成，需要耗费大量时间（从播种至选择完成一般需要3-5个月）、土地及人力资源，难以开展大规模的材料鉴定和筛选。而分子标记辅助选择技术则可以通过对育种材料目标性状相关联的DNA序列的鉴定来完成针对目标性状表型的筛选。这使得育种材料的选择在苗期甚至种子时期即可开展，大大提高了选择效率。此外，分子标记辅助选择技术不受外界环境的影响，结果更加稳定可靠。目前，分子标记在水稻、玉米、番茄等粮食和蔬菜作物中已得到广泛的应用，极大程度上推动了这些农作物遗传育种的发展。其中，单核苷酸多态性（SNP）由于变异丰富、易于实现自动化和高通量等优势，是最具发展前景的分子标记类型之一。然而，由于花椰菜分子生物学研究的相对滞后性，分子标记尤其是基于SNP的标记辅助选择在花椰菜育种中极少有实质性的应用。因此，开发实用性强、准确性高、成本低的与花椰菜花球花梗长度连锁的分子标记，可以显著提高花球花梗长度选择的效率和准确性，在花椰菜遗传育种中极具应用价值。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是：针对花椰菜传统育种中的花球花梗长度选择完全依赖于表型调查，需耗费大量时间、土地资源的现状，开发一种快捷、高效、稳定、准确的分子标记辅助选择花椰菜花球花梗长度的方法。本发明第二个目的是提一种检测松花菜花球花梗长度的特异引物组合。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种松花菜花球花梗长度的分子标记辅助选择方法，该方法按如下步骤进行：

1）待检测材料准备：将待检测的花椰菜材料按照常规方法播种、育苗，并分单株编号；于2-3片真叶期取各单株叶片按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，-20℃保存，备用；

2）待检测样品基因组DNA的PCR扩增：利用特异引物组合对待检测样品的基因组DNA分别进行PCR扩增，特异引物组合中上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCAAATCTTTT -3’；反应总体积20μL，具体体系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl₂，1×扩增缓冲液，基因组DNA 50 ng，加dd H₂O至20μL；热循环程序为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性1min，55℃复性30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；

3）PCR产物的酶切反应及电泳检测：将2）中的PCR产物利用限制性内切酶Mae I在37℃条件下酶切3 h，酶切体系含 PCR 产物 7μL， 10×buffer 1μL，1 U Mae I，加dd H₂O至10μL；酶切后将其产物在1.2% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴乙锭显色；

4）待检测样品花球花梗长度的鉴定与筛选：依据3）中凝胶条带模式，显示为169bp的样品视为含有长花梗位点基因型的材料予以保留，而显示为135bp的样品则视为不含长花梗位点基因型的材料予以剔除；将入选幼苗定植于大田，按照常规松花菜栽培措施进行田间管理；花球成熟时用游标卡尺测量花球最下部4个不同分枝方向的花梗长度，取平均值作为该株的花梗长度值，淘汰其中花梗长度达不到预期值的短花梗植株，对花梗长且其它农艺、经济性状好的植株予以进一步繁殖。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种检测松花菜花球花梗长度的特异引物组合，该引物组合中上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCA A ATCTTTT -3’。

本发明的有益效果是：

（1）本发明提供的分子标记可应用于花球花梗长度性状的辅助选择，检测方便,费用低廉。利用本方法在苗期即可对育种材料进行检测，从而可在早期淘汰大量不含有长花梗位点基因型的材料，大幅度减少后期所需的定植、田间管理、表型鉴定的工作量。另外，本发明中的标记是基于SNP开发而来，这为今后实现高通量的自动化基因型检测提供了可能性。

（2）传统育种方法完全依赖于对花球花梗长度的表型调查进行选择，主观性强，易受环境影响，可能存在一定的误差。利用本方法可直接针对相应位点的基因型进行鉴定，可以避免环境因素等的影响。另外，本方法在分子标记检测、筛选的基础上，对入选材料的目标性状进行表型的复选，大大提高了选择的准确性。

附图说明

图1. 普通花椰菜与松花菜的花球表型差异。

图2. 本发明在长花梗材料和短花梗材料中揭示的SNP。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：（花椰菜自交系‘4306-1’和‘4310-2’回交后代的分子标记辅助选择）

花椰菜自交系‘4310-2’农艺性状优异，但花球花梗长度较短；‘4306-1’花球花梗长度较长但其他农艺性状一般，可通过二者杂交和连续回交对‘4310-2’的花球花梗长度性状进行定向改良。本发明中的特异分子标记扩增产物在二者间存在169bp/135bp的多态性，因此可利用本发明在回交过程中进行分子标记辅助选择。

（1）‘4306-1’和‘4310-2’的杂交和回交：将‘4306-1’和‘4310-2’种子分别播种、育苗、定植于塑料大棚。以‘4306-1’为父本，‘4310-2’为母本开花期进行人工播蕾杂交，待种荚成熟后收集种子，即为F₁。次年将F₁种子和轮回亲本‘4310-2’种子分别播种、育苗、定植于塑料大棚。以F₁为父本，‘4310-2’为母本开花期进行人工播蕾杂交，待种荚成熟后收集种子（200粒以上），即为BC₁F₁。

（2）BC₁F₁世代苗期分子标记辅助选择：将收集的BC₁F₁世代种子随机选取200粒，穴盘播种，育苗，并分单株编号。于2-3片真叶期取各单株叶片按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，-20℃保存，备用。利用引物组合（上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCAAATCTTTT -3’）对上述DNA分别进行PCR扩增。反应总体积20μL，具体体系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl2，1×扩增缓冲液，基因组DNA 50 ng，加dd H2O至20μL。热循环程序为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性1min，55℃复性30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将PCR产物利用限制性内切酶MaeI在37℃条件下酶切3 h，酶切体系含 PCR 产物 7μL，10×buffer 1μL，1 U MaeI 酶，加dd H2O至10μL。酶切后将其产物在1.2% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴乙锭显色。在该BC₁F₁世代中，显示为169bp的单株视为含有长花梗位点基因型的材料予以保留，而显示为135bp的单株则视为不含长花梗位点基因型的材料予以淘汰。

（3）将入选幼苗定植于大田，按照常规花椰菜栽培措施进行田间管理。花球成熟时用游标卡尺测量花球最下部4个不同分枝方向的花梗长度，取平均值作为该株的花梗长度值，淘汰其中花梗长度达不到预期值的短花梗植株（由分子标记与表型之间可能存在的小概率误差造成），选择花梗长且其它农艺、经济性状最接近轮回亲本‘4310-2’的植株进一步与轮回亲本‘4310-2’杂交，获得BC₂F₁世代。

（4）后续回交世代的选择：对获得的BC₂F₁世代按照上述第（2）、（3）步骤进行选择，进而回交获得BC₃F₁世代；并以同样方法进行选择和回交直至BC₆F₁世代，再对其进行自交，获得遗传稳定的BC₆F₂世代，即为花球花梗长度得到明显改良的‘4310-2’。

实施例2：（松花菜品种‘庆农65天’自交分离后代的分子标记辅助选择）

（1）‘庆农65天’自交F₂世代的获得：将‘庆农65天’种子播种、育苗、定植于塑料大棚。于开花期进行人工播蕾自交，待种荚成熟后收集种子，即为F₂世代。

（2）F₂世代苗期分子标记辅助选择：将收集的F₂世代种子随机选取500粒，穴盘播种，育苗，并分单株编号。于2-3片真叶期取各单株叶片按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，-20℃保存，备用。利用引物组合（上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCA AATCTTTT -3’）对上述DNA分别进行PCR扩增。反应总体积20μL，具体体系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl2，1×扩增缓冲液，基因组DNA 50 ng，加dd H₂O至20μL。热循环程序为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性1min，55℃复性30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将PCR产物利用限制性内切酶MaeI在37℃条件下酶切3 h，酶切体系含 PCR 产物 7μL，10×buffer 1μL，1 U MaeI 酶，加dd H₂O至10μL。酶切后将其产物在1.2% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴乙锭显色。在该F₂世代中，显示为169bp的单株视为含有长花梗位点基因型的材料予以保留，而显示为135bp的单株则视为不含长花梗位点基因型的材料予以淘汰。

（3）将入选幼苗定植于大田，按照常规花椰菜栽培措施进行田间管理。花球成熟时用游标卡尺测量花球最下部4个不同分枝方向的花梗长度，取平均值作为该株的花梗长度值，淘汰其中花梗长度达不到预期值的短花梗植株（由分子标记与表型之间可能存在的小概率误差造成），对花梗长且其它农艺、经济性状好的植株予以进一步自交，获得F₃世代。

（4）后续自交世代的选择：对获得的F₃世代按照上述第（2）、（3）步骤进行选择，进而自交获得F₄世代；并以同样方法进行选择和自交直至F₆世代，即获得了遗传稳定、花球花梗长且其他农艺、经济性状优异的新材料。

（5）分子标记辅助选择的结果分析：在本实施例中，各世代通过分子标记鉴定后入选的单株达到花球花梗长度要求的比例均达到80%以上，表明本发明中的特异分子标记对花球花梗长度性状的辅助选择效果良好，可以在早期淘汰大量花球花梗长度不达标的单株，有效提高选择效率。在此基础上，我们通过花球花梗长度表型复选来弥补分子标记选择的少量误差，并配合其他农艺、经济性状的选择，获得了2份综合表现优异的纯合育种材料。

<110>浙江省农业科学院

<120>一种花椰菜花球花梗长度的分子标记辅助选择方法

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<212>DNA

<213>人工合成

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<212>DNA

<213>人工合成

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