PDGFRA基因突变检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因PDGFRA基因突变检测试剂盒。
背景技术：
：胃肠道间质瘤（GIST）是消化道最常见的间叶源性肿瘤。PDGFRA基因编码的蛋白质是血小板衍生生长因子受体A(PDGFRA)，为一种单链跨膜糖蛋白，与C-KIT同属III型酪氨酸蛋白激酶家族，且结构相似，两者的氨基酸序列有很高的同源性。PDGFRA与配体PDGF结合后形成受体配体复合物并活化PDGFRA，从而启动磷脂酰肌醇、cAMP及多种蛋白质的磷酸化通路，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，促进DNA合成，细胞分裂和增殖。当受体或配体发生异常突变，可导致恶性肿瘤。研究发现，PDGFRA基因D842V突变是导致GIST患者对格列卫产生原发耐药性的原因。PDGFRA突变与c-kit基因突变是相互独立的。因此，检测肿瘤患者PDGFRA基因突变的情况可用于判断格列卫(Imatinib/Glivec/Gleevec)治疗是否有效。PDGFRA基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技术采用等位基因特异性扩增法对样本的基因突变进行区分，该方法成本较低，但检测率较高，容易出现假阴性结果；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种可以采用Sanger测序法检测PDGFRA基因的技术具有重要的临床意义。技术实现要素：本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种PDGFRA基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中PDGFRA基因主要突变位点型别，检测位点包括PDGFRA基因12和18两个外显子的主要突变位点，包括但不限于12号外显子上c.1682T>A,p.V561D突变位点；18号外显子上c.2525A>T,p.D842V突变位点。本发明的PDGFRA基因突变检测试剂盒具体包括：（1）用于扩增样本中PDGFRA基因Exon12和18两个外显子的特异性引物，具体序列如下:（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对PDGFRA基因Exon12和18两个外显子进行测序分析，具体序列如下：外显子名称序列号Reverse5’-3’12SEQ-PD12SEQIDNo.5GCAAGGGAAAAGGGAGTCTT18SEQ-PD18SEQIDNo.6ACCATGGATCAGCCAGTCTT（3）2个装有PDGFRA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括12号外显子上c.1682T>A,p.V561D突变位点；18号外显子上c.2525A>T,p.D842V突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：组份体积（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl20.7525mMdNTPs0.4H2O11.1其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本试剂盒主是根据PDGFRA基因的Exon12和18两个外显子的保守序列分别设计PDGFRA基因四个外显子的特异性引物，分别将Exon12和18两个外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：（1）引物设计：利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从PDGFRA基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计PDGFRA基因Exon12和18两个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA，引物序列分别是SEQIDNOs：1-4。。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNOs：5-6。（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因PDGFRA的Exon12和18两个外显子片段回收用于测序。附图说明以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。图1为PDGFRA基因的Exon12和18两个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。图1中各标号的具体表示如下：1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；4：4号样本；5：5号样本；6：6号样本；P12：PDGFRA基因第12号外显子；P18：PDGFRA基因第18号外显子；M：DNAmaker，从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。图2-1为PDGFRA基因的Exon12外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-2为PDGFRA基因的Exon12外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。图2-3为PDGFRA基因的Exon18外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-4为PDGFRA基因的Exon18外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。具体实施方式1、引物设计根据PDGFRA基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从PDGFRA基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计PDGFRA基因Exon12和18两个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQIDNos：1-4。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNos：5-6。2、PCR扩增2.1、质控品准备阳性质控品为PDGFRA野生型和突变型质粒按质量比1:1的比例混合，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。2.2、试剂配制提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。确定反应数N，N=待检样本数（n）×2+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个试剂的量，计算如下：组分PCRmix（即PCR反应预混液）Taq酶体积（μl）19.75×N0.25×N取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。2.3、加样将PDGFRA阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加1.25μl（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。2.4、PCR扩增配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。回收得到的产物即可用于测序。序列表<110>广东凯普生物科技股份有限公司<120>PDGFRA基因突变检测试剂盒<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PDGFRAEx12-F<400>1tccagtcactgtgctgcttc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PDGFRAEx12-R<400>2gcaagggaaaagggagtctt20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PDGFRAEx18-F<400>3accatggatcagccagtctt20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>PDGFRAEx18-R<400>4tgaaggaggatgagcctgacc21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-PD12<400>5gcaagggaaaagggagtctt20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-PD18<400>6accatggatcagccagtctt20当前第1页1 2 3