短链脱氢酶的突变体、重组表达载体、基因工程菌和应用的制作方法

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶的分子改造，同时涉及相应突变酶基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及上述突变体酶或含有突变体酶的重组细胞在不对称还原一系列潜手性酮制备光学纯手性醇中的应用。

背景技术：

手性醇是一类在手性碳上连有羟基的旋光性化合物。羟基能够轻易被转换为多种其他功能基团的性质使手性醇成为最重要的手性砌块之一。具有光学活性的手性醇被广泛用于合成手性药物、精细化学品和农用化学品等。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法，理论上能将底物酮100％转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。其中，生物催化潜手性酮不对称还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为手性醇绿色合成的优选途径。

在具有催化不对称还原潜手性酮活性的酶中，短链脱氢酶由于其催化底物谱广、热稳定性好以及有机溶剂耐受性强等特点而倍受关注。短链脱氢酶催化潜手性酮还原制备高光学纯度手性醇已有诸多报道。然而，大多数生物催化剂催化潜手性酮不对称还原过程遵循Prelog规则，遵循anti-Prelog规则催化潜手性酮还原的生物催化剂相对较少。这将限制作为手性药物合成重要中间体anti-Prelog手性醇的制备及生物催化绿色合成技术的推广。本课题组前期筛选得到一株能够以anti-Prelog立体选择性催化潜手性酮还原的菌株短稳杆菌ZJUY-1401(Empedobacter brevis ZJUY-1401)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2014520(专利公开号CN 105316250 A)；并从其基因组中挖掘并克隆表达了遵循anti-Prelog规则高立体选择性还原潜手性酮的短链脱氢酶EbSDR8(专利公开号CN 105238768 A)。但是，该短链脱氢酶的催化活性远不能满足工业化生产要求，因此，有必要通过相关技术提高该酶的催化效率以充分挖掘其应用价值。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的是提供酶活提高的短链脱氢酶EbSDR8的突变体及其重组工程菌等，为手性醇的合成提供强有力的生物催化剂。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面提供催化活性显著提高的短链脱氢酶EbSDR8的突变体，这些突变体是在SEQ ID No.2所示短链脱氢酶EbSDR8氨基酸序列基础上进行构建，该短链脱氢酶核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示(专利公开号CN 105238768A)。所述突变体为在SEQ ID No.2所示短链脱氢酶EbSDR8氨基酸序列基础上含有如下几个位点的单点突变或多点组合突变：94位甘氨酸(Gly94)、145位组氨酸(His145)、153位丝氨酸(Ser153)、188位酪氨酸(Tyr188)和193位亮氨酸(Leu193)。

优选地，所述突变体是分别在短链脱氢酶EbSDR8的Gly94和Ser153两个位点上进行取代，且更优选的，上述两个优选位点同时进行取代时具有更优的催化活性。

优选地，所述短链脱氢酶EbSDR8的突变体分别为：将94位甘氨酸突变为丙氨酸(Gly94Ala，即G94A)，其是由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成；将153位丝氨酸突变为亮氨酸(Ser153Leu，即S153L)，其是由SEQ ID No.6所示的氨基酸序列组成；且上述两个优选单点突变体的组合突变(Gly94Ala/Ser153Leu，即G94A/S153L)具有更优的催化活性，其是由SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成。

任何对上述突变体氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有短链脱氢酶活性的，仍属于本发明的保护范围。

本发明的第二方面提供上述短链脱氢酶突变体的核苷酸序列。其中突变体G94A核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；突变体S153L核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示；突变体G94A/S153L核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示。

如本领域技术人员所知，本发明的短链脱氢酶突变体的核苷酸序列也可以是编码序列表中所示氨基酸组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。

任何对所示突变体核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明的第三方面提供一种包含本发明的短链脱氢酶突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的短链脱氢酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-30a。

本发明的第四方面提供一种表达重组短链脱氢酶突变体的基因工程菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的短链脱氢酶突变体基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五方面提供一种重组短链脱氢酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组短链脱氢酶突变体蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的短链脱氢酶突变体蛋白的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生短链脱氢酶突变体蛋白即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组短链脱氢酶突变体蛋白。

本发明的第六方面提供所述短链脱氢酶突变体或其基因工程菌在不对称催化潜手性酮制备光学活性手性醇中的应用。

具体的，所述的应用为：以潜手性酮(I)为底物，所述短链脱氢酶突变体或其重组细胞，以NADH或NADPH为辅酶，20～50℃下，于pH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系a中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。

其中，R₁和R₂为氢、烷基、卤代烷基、卤素、烷氧基和硝基。

具体的R₁和R₂可以为-H，-CH₃，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₃，-CH₂X，-CX₃，-X，-OCH₃，-OCH₂CH₃；X代表F，Cl，Br，OH，NO₂。

所述的反应条件可按本领域所用的常规条件进行选择。

进一步，所述转化体系a中底物初始浓度为5～1000mmol/L。

进一步，所述转化体系a中重组短链脱氢酶突变体纯酶在反应液中较佳的浓度为0.1～2.0mg/mL。所述转化体系a中菌体的质量用量以菌体湿重计为1～400g/L。

进一步，所述转化体系a还包括有机溶剂，由底物、催化剂、有机溶剂与pH 5.5～10.5的缓冲液构成转化体系b，有机溶剂占转化体系b总体积1～20％，转化体系b中底物初始浓度为5～1000mmol/L，菌体的质量用量以菌体湿重计为10～400g/L。

进一步，所述反应在pH 6.5～10.5的缓冲液中进行。

进一步，反应体系还可添加1～15％醇或糖作为辅底物，可以显著提高反应的活力和立体选择性。所述辅底物包括但不限于下列之一：①乙醇、②异丙醇、③葡萄糖、④蔗糖等。

进一步，反应体系中的辅底物为异丙醇。

进一步，反应体系中异丙醇的浓度为10％。

进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，将转化反应液离心，取上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应手性醇。所述粗品提纯的方法为本领域公知技术，通常为有机溶剂萃取、色谱分离和吸附分离等。

本发明所述转化体系a和转化体系b均为转化体系，为便于区分不同步骤转化体系的组成不同而命名，字母本身没有含义。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了催化活性显著提高的短链脱氢酶突变体及其核苷酸序列，以及含有相应突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，通过这些短链脱氢酶突变体或含有相应突变体蛋白的重组细胞不对称还原可制备高光学纯度的手性醇；本发明中所述短链脱氢酶突变体或含有突变体蛋白的重组细胞不对称还原制备手性醇具有高催化活性，能够合成高光学纯度手性醇(ee>99％)。催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广、环境友好，且其重组细胞能够在不外加任何辅酶的含异丙醇反应体系中高效催化潜手性酮的不对称还原，具有很好的工业化应用开发前景。

(四)附图说明

图1为短链脱氢酶EbSDR8及其突变体分离纯化后SDS-PAGE图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：突变体的构建

以含有突变点的寡核苷酸片段为引物(表1)，采用QuickChangeTM方法(Stratagene,La Jolla,CA)扩增含有短链脱氢酶EbSDR8基因的pET-30a重组质粒。

表1突变体构建引物

^a下划线标示为突变位点

PCR反应体系：5×PrimerSTAR buffer(Mg2+plus)，5μL；dNTPs(各2.5mM)，2.0μL；上游引物(10μM)，1.0μL；下游引物(10μM)，1.0μL；重组质粒模板，15ng；PrimerSTAR polymeraseTM HS(2.5U/μL)，0.5μL；加ddH2O至总体积为25μL。

PCR程序：(1)98℃，1min；(2)98℃，10s；(3)55℃，10s；(4)72℃，7min。步骤(2)-(4)循环20次后冷却至4℃。

PCR产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶DpnI进行消化以降解模板质粒。酶切反应体系及条件：17μL经清洗处理的PCR产物，2.0μL 10×缓冲液，1.0μL限制性内切酶DpnI，37℃保温1h。

将上述经酶切处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有短链脱氢酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中。最终获得突变体G94A、S153L和G94A/S153L核苷酸序列测序结果分别如序列表中SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示，相应编码蛋白质氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8所示。

实施例2：短链脱氢酶突变体的诱导表达

实施例1构建的工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，26℃诱导培养6h后，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，于-80℃贮存备用。

实施例3：短链脱氢酶突变体的分离纯化

实施例2收集的菌体细胞悬浮于10mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM，pH 8.0)中，振荡摇匀后置超声波下破碎(有效时间8min)。破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于酶的后续的分离纯化。纯化柱为Ni-NTA，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，以5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM T磷酸钠，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白。酶液用HiTrap脱盐柱进行脱盐，脱盐缓冲液为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(100mM,pH 7.5)缓冲液，所得纯酶液于4℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，SDS-PAGE电泳见图1，通道1为蛋白Maker；通道2为EbSDR8纯酶；通道3为突变体G94A纯酶；通道4为突变体S153L纯酶；通道5为突变体G94A/S153L纯酶。结果表明经Ni-NTA亲和层析，得到电泳纯的重组短链脱氢酶EbSDR8及其突变体。

实施例4：短链脱氢酶EbSDR8及其突变体的比活

通过分光光度计在340nm处检测NADH吸光值变化以计算羰基还原酶活力。酶活单位(U)的定义为：30℃下，每分钟催化1μmol NADH氧化所需的酶量；比活为每毫克蛋白所具有的酶活(U/mg)。反应体系为(1.0mL)：0.3mM NADH，100μL异丙醇，Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM,pH 7.5)和适量的纯酶。底物分别为苯乙酮1a，4’-氟苯乙酮1b，4’-氯苯乙酮1c，4’-溴苯乙酮1d，4’-甲基苯乙酮1e，4’-甲氧基苯乙酮1f，4’-乙氧基苯乙酮1g，2,2,2-三氟苯乙酮1h，2-氯-4’-氟苯乙酮1i，3’-氯-4’-氟苯乙酮1j，2,3’,4’-三氯苯乙酮1k，2,2’,4’-三氯苯乙酮1l。野生型EbSDR8及其突变体催化相应底物比活和立体选择性如表2所示。

表2 EbSDR8及其突变体催化活性

实施例5：短链脱氢酶突变体EbSDR8及其突变体的动力学参数

在标准条件下，通过改变反应体系中底物的浓度进行酶活力测定，根据双倒数作图法计算相应的动力学常数。动力学常数计算中所用底物及其浓度如下：苯乙酮1a(0～10mM)，4’-氟苯乙酮1b(0～10mM)，4’-氯苯乙酮1c(0～1.0mM)，4’-溴苯乙酮1d(0～0.5mM)，4’-甲基苯乙酮1e(0～0.5mM)，4’-甲氧基苯乙酮1f(0～0.2mM)，4’-乙氧基苯乙酮1g(0～0.2mM)，2,2,2-三氟苯乙酮1h(0～0.3mM)，2-氯-4’-氟苯乙酮1i(0～0.5mM)，3’-氯-4’-氟苯乙酮1j(0～1.5mM)，2,3’,4’-三氯苯乙酮1k(0～1.0mM)，2,2’,4’-三氯苯乙酮1l(0～1.0mM)。野生型EbSDR8及其突变体催化相应底物的表观动力学参数如表3所示。

表3 EbSDR8及其突变体不对称还原潜手性酮表观动力学参数

实施例5：短链脱氢酶突变体EbSDR8及其突变体G94A/S153L转化高浓度2,2,2-三氟苯乙酮

反应体系(10.0mL)：0.4g湿菌体细胞，不同浓度2,2,2-三氟苯乙酮，1.0mL异丙醇，9.0mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM,pH 7.5)和适量的纯酶。于35℃，200rpm条件下反应。野生型EbSDR8重组大肠杆菌全细胞催化活性明显低于突变体G94A/S153L，反应1h后，突变体G94A/S153L全细胞催化反应产率达到95.2％，而野生型EbSDR8反应组产率仅为69.9％；同样条件下，野生型EbSDR8和突变体G94A/S153L全细胞催化该反应产率达到99％所需时间分别为5.5和1.5h。当底物浓度达到800mM时，该突变体全细胞仍能有效催化反应进行，反应9h，产率达到95.1％，产物的浓度达760.7mM，该突变体催化高浓度底物转化时仍然展现出良好的立体选择性，产物ee值保持99％以上。突变体G94A/S153L全细胞能够在无外源辅酶添加的情况下，以异丙醇作为辅底物实现辅酶循环，有效催化高浓度2,2,2-三氟苯乙酮不对称还原，表明该全细胞生物催化剂具有广阔的工业化应用前景。