含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法及应用与流程

文档序号:11095881阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)将含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋清洗消毒后打破,用蛋黄分离器小心分离卵黄,保证卵黄膜未破裂;

(2)将卵黄在普通滤纸翻滚数次,尽可能将卵白吸除干净,卵黄破膜收集卵黄;

(3)用2倍卵黄体积的10mM PBS,pH7.4稀释卵黄,室温搅拌;按终浓度3.5%PEG6000沉淀稀释后的卵黄,离心条件为:速度为8000~12000rpm/min,温度为4℃,离心时间为5~20min;离心后收集上层清液,经普通滤纸过滤去除不溶物;

(4)向步骤(3)中去除不溶物后的上层清液加入终浓度为8.5%PEG6000,室温搅拌10~30min,再离心弃去上层清液得到沉淀,离心条件为:速度为8000~12000rpm/min,温度为4℃,离心时间为5~20min;

(5)将步骤(4)离心得到的沉淀用卵黄体积的PBS,pH7.4溶解,再加入终浓度为12%PEG6000沉淀卵黄抗体,室温搅拌10~30min;再离心弃上层清液得二次沉淀,其离心条件为:速度为10000rpm/min,温度为4℃,离心时间为10min;

(6)将步骤(5)离心得到的二次沉淀再用6~8ml PBS重悬溶解;在4℃条件下加入33%饱和硫酸铵,搅拌50~70min,再离心弃上层清液得到三次沉淀,其离心条件为:速度为8000~12000rpm/min,温度为4℃,离心时间为5~20min;

(7)将步骤(6)离心得到的三次沉淀再用1ml PBS重悬溶解;溶解后的沉淀对PBS透析,20小时以上,每6~8小时更换透析液一次;收集经过透析的卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋为用CagA基因阳性的毒力型幽门螺杆菌免疫所产的鸡蛋。

3.根据权利要求2所述的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的鸡蛋的制备方法,包括以下步骤:

1)培养CagA基因阳性的毒力型幽门螺杆菌;

2)免疫产蛋母鸡:选用40周龄健康产蛋母鸡隔离饲养,进行皮下注射,首次注射1.0x109cfu/只;每周加强一次免疫1.0x109cfu/只;三次免疫后收集鸡蛋。

4.根据权利要求2所述的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法,其特征在于,采用间接法ELISA测定血清及含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体滴度;具体步骤如下:

S1:超声破碎幽门螺杆菌,Bradford法定量蛋白浓度;

S2:用pH9.6碳酸缓冲溶液稀释菌体蛋白,按100ug/well包被酶标板,4℃过夜;甩掉包被液,用含有0.05%吐温20的PBS浸泡冲洗2~5次每次30~70s;

S3:用1%牛血清白蛋白封闭,温度为37℃,时间为50~70min,洗涤2~5次;加入倍比稀释血清或卵黄,37℃孵育1.5~3h,洗涤酶标板4~6次;

S4:加入1:10000稀释的酶标二抗,37℃反应30~60min后,洗涤板条4~6次;TMB显色,室温10~30min,2M硫酸终止显色反应,酶标仪读取450nm的OD值;抗体滴度判断:OD值大于阴性对照值的2.1倍为阳性,阳性值的最大稀释倍数为滴度。

5.根据权利要求3所述的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法,其特征在于,可直接对免疫所产的鸡蛋的卵黄进行干燥制得含含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的卵黄粉,干燥方法具体包括如下步骤:将用蛋黄分离器小心分离卵黄于-20℃预冷冻1~3h,转入-80℃冻存过夜;第二天转入冻干机,主冻干0.1mbar,-56℃,至少24h;终冻干0.02mbar,-56℃,2小时;收获冻干样,研磨获得含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄粉。

6.根据权利要求5所述的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法,其特征在于,所制得的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体和所制得的含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄粉均可应用于食品或食品添加剂或医药或保健品或功能性保健食品。

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